诺贝尔化学奖.ppt

1979年，穆利斯进入Cetus公 司，从事合成寡聚核苷酸的工作。 1981年他担任DNA合成实验室主任， 主要任务是加速和优化寡聚核苷酸 的合成。80年代初DNA合成仪进入 实验室，他对这台原型机提出了许
多改进的意见，还试着编写新的程 序。由于DNA合成仪的应用使寡核 苷酸的合成效率提高10倍。这样， 穆利斯能把更多的时间用于计算机
1986—1988年任 Xytronyx公司分子生 物学部主任。从1987 年开始在加州任PCR 技术与核酸化学的非 官方顾问。他现在是 加州奥克兰儿童医院 和研究所的知名专家， 并为几家公司作科学 顾问。
19世纪50年代，Khorana合成了 寡聚核苷酸，同时，他利用合成的 寡聚核苷酸DNA合成酶以及DNA，开 发出了使DNA扩增的方法。当时，这 一领域的研究人员通常都使用 Khorana的DNA扩增技术。可以说， 这是一个司空见惯的基本技术，谁 也没有去想过这种方法的不便之处。
1993年诺贝尔化学奖 Kary mullis
PCR 技术
The method of polymerase chain reaction
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）一个非常简 单，然而却是很有用的体外DNA聚合 反应。PCR技术在生命科学中掀起了 一场革命，它可以使人们通过几个 小时的试管内的DNA聚合反应，就可 将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅 可以扩增存在于样品中的DNA，也可 以富集混合DNA分子中的任一种。 PCR的重要价值在于扩增存在微量而 特殊的DNA序列。
凯利·穆利斯（Kary Mullis 1944—） 1944年12月28日出生于美国北卡罗来纳 州的勒诺。穆利斯在南卡罗来纳州的一 个小镇度过了童年，成长环境非常宽松， 使他享有充分的自由和空间，这为他性 格的形成提供了条件。
1962年他在佐治亚州理工学院学习 化学，获学士学位；1966—1972在加州 大学伯克利分校攻读生物化学博士学位； 接着，先后在堪萨斯大学医学院和加州 大学旧金山分校作博士后；1979年任职 于Cetus公司，其间发明了PCR技术。
有成功。他再次更换模板改用实验室合成的 100碱基对的寡核苷酸作模板，对ß珠蛋白基因 进行扩增，结果得到扩增产物。这期间Cetus公 司成立了PCR小组，经全体成员的共同努力， 1984年11月，终于得到与预期分子完全符合的 扩增量，首次取得可信的结果，证明了PCR的 可行。
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆 菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是： ①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活， 每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱 基错配，其PCR产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的 PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出 的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA
1971 年 ， Khorana 曾 提 出 ： 经 过 DNA 变性，与合适引物杂交，用DNA聚合 酶延伸引物，并不断重复该过程便 可克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
Baidu Nhomakorabea
因此，30年来没有人去改 革这个方法，人人都满足于这 个方法。就连Mullis本人在大 学做基础研究时，也没有想到 要去开发一种更简便的方法， 以取代Khorana的方法。
再有，经常使用计算机使他注意到了 “循环”，他也想到DNA呈指数增长的 趋势；最后他还想到扩增是否具有专一 性的问题，因为在合成第一次反应中， 人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但 穆利斯注意到在第二次及后续的链反应 中，由第一次反应得到的那些“长反应 产物”只能被扩延到另一引物与模板 DNA相结合的部位，过了那个位点，扩 延反应就无法进行了（没有模板）。所 以PCR产物的长度是确定的。
上。PCR的点子，也就是在这样的情 况下诞生的。
1983年4月一个周末的晚上，他 驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒 的乡间公路上开着车，，他思绪不 断，一段DNA反复复制的景像，在 他的脑海里冒了出来。他萌发了 PCR的构想。
整个周末他都在思考着PCR问题， 他想DNA合成起始于DNA解链，在一段 寡核苷酸作为引物下，聚合酶沿着模板 从引物的末端开始进行DNA的扩增，这 需要人工加入核苷酸，这一过程在实验 室可以实施。他还反复思考能否用两个 引物来代替现行的单引物法？如果两个 引物的大小不同，结果两条链的序列将 同时被测定，而且互为印证；其次，他 想能否分两次加入聚合酶，以防止新合 成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错 搭到新生链中的现象。
耐高温，不需每次加入，大大提高了扩
增片段特异性和扩增效率。此酶被命名
为TagDNA聚合酶。此酶的发现使PCR 广泛的被应用。
原理简介： PCR 技术的基本原理是 DNA的半保留复制。由于DNA复制是 半保留的，两条链都可以作为模板。在 体内，DNA复制是周期性的，所以基因 扩增的数量有限；PCR技术在体外利用 人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和 一些合适的底物和因子，通过对温度的 控制，使DNA不断位于变性、复性和合 成的循环中，达到扩增DNA的目的。
模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加
入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR技术操作程序添了不少困难。
这使得PCR技术在一段时间内没能 引起生物医学界的重视。1988年初， Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR， 其扩增的DNA片段很均一，真实性较高， 只有所期望的一种DNA片段。但每循环 一次，仍需加入新酶。1988年,Cetus公 司的Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜 热杆菌（thermus aquaticus）中提取到 一种耐热DNA聚合酶，此酶最大特点是
他开始用人类神经生长因子作为目标序列
进行扩增，没有结果。转而他选择PBR322质
粒作为模板，实验中通过缩小反应体积来增加 各成分的浓度，并将复性温度降低到32℃，减 少每次加入的聚合酶的量，在10次循环后停止，
结果他看到一条浅的带。接着，他又对方法进
行了改进，增加几次循环，得到的带还是较浅。 他又尝试用50kb碱基对的λ噬菌体做模板，用 限制酶将模板降解为2000碱基对左右，扩增没