叶片叶绿素含量的测定

植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法

1、原理

叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm，据Lamber-Beer 定律，可得浓度C与光密度D间的关系式：

D663=82.04Ca +9.27Cb

D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位：g/mL）

叶绿素a的浓度：Ca= 12.72D663 – 2.59D645

叶绿素b的浓度：Cb= 22.88D645 – 4.68 D663

总叶绿素的浓度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L）2、试剂与材料

2.1 试剂：

丙酮、石英砂、碳酸钙

2.2 材料：

新鲜叶片。

2.3 仪器与器皿：

分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管

3、实验步骤

称1.25g叶用丙酮研磨

↓

匀浆过滤（用80%丙酮洗研钵及残渣，合并滤液）

↓

滤液用80%丙酮定容至25mL

↓

适当稀释后测A645、A663

3.1 取样：称取1.25g剪碎的叶片（提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片）放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。

3.2 研磨提取：向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许（约0.002g）CaCO3 (中和酸性，防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。

3.3 读取吸光度：取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2~3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉（注意不能擦），再用擦镜纸擦干擦净。将比色

皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述2个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。

4、结果计算

总叶绿素的浓度：Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位：mg/L）

叶绿素含量：Chl(mg/g叶)=Ct(mg/L)×提取液总量（L）×稀释倍数/材料鲜重（g）