心脏成纤维细胞原代细胞培养

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原代小鼠心肌成纤维细胞提取

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

大鼠原代心肌细胞提取方法

大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。

乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。

新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。

因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。

建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。

2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。

常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。

3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。

新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。

消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。

4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。

分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。

成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。

溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。

由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。

5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。

操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。

成纤维细胞原代培养

利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。

培养中应该注意以下事项：①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出．②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养．③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成．④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度．⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．。

原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)

原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。

体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。

其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。

目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。

非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。

近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。

心脏大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。

腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。

C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细胞间质。

CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功能、细胞因子分泌和血管生成。

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

人成纤维细胞的原代培养方法及步骤

人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
材料准备
成纤维细胞
人成纤维细胞完全培养基
实验步骤
水浴锅37℃预热。

完全培养基温浴到37℃。

在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。

从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。

注意融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；且晃动时应避免水没过管盖造成污染；管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。

继续晃动冻存管，至冰晶融化。

用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。

在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。

用1mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。

细胞悬液以250×g，离心4min。

离心后去除上清。

加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。

加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。

摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。

注意接种2h内不可移动、观察细胞。

这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。

复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。

之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。

通常用人成纤维细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。

请根据细胞实际生长情况调整传代比例。

原代成纤维细胞培养基配方

原代成纤维细胞培养基配方1.引言1.1 概述成纤维细胞是一类常见的细胞，广泛存在于人体各个组织中，包括皮肤、血管、肌肉和内脏等。

在细胞培养技术的发展过程中，原代成纤维细胞培养基的配方变得越来越重要。

原代成纤维细胞培养基是一种提供养分和适宜环境的培养液，可以维持原代成纤维细胞的生长和增殖。

原代成纤维细胞培养基的配方包括多种关键成分，如培养基基础成分、生长因子、附加物等。

不同的组分可以提供细胞所需的营养和信号物质，使细胞能够在体外环境下继续生长和繁殖。

原代成纤维细胞培养基配方的研究对于细胞生物学、组织工程和再生医学等领域具有重要意义。

通过优化培养基的配方，可以提高原代成纤维细胞的增殖速度和存活率，同时改善其功能和特性，为细胞研究和临床应用提供更好的工具和基础。

然而，目前关于原代成纤维细胞培养基的配方研究还比较有限。

不同实验室和研究者之间存在着很大的差异，配方的选择和调整仍然依赖经验和试错。

因此，进一步的研究和探索仍然是十分必要和迫切的。

本文将深入探讨原代成纤维细胞培养基配方的概念和重要性。

我们将详细介绍培养基的组成、各种成分的作用机制，并总结现有研究的进展和局限性。

最后，我们将展望未来的研究方向，希望通过进一步的研究和探索，为原代成纤维细胞培养基的配方优化和应用提供更好的指导和支持。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括以下内容：文章结构部分的主要目的是为读者提供对整篇文章的摘要和框架。

通过描述文章的组织结构，读者可以更好地理解文章的内容和逻辑顺序。

首先，本文将介绍原代成纤维细胞培养基的概念和重要性。

这一部分将讨论成纤维细胞在生物医学和生命科学研究中的重要作用，以及为什么培养基对于细胞培养的成功和细胞功能的研究是至关重要的。

其次，本文将详细介绍原代成纤维细胞培养基的组成。

这一部分将讨论培养基中各种组分的作用和功能，如营养物质、生长因子、酶和血清的添加等。

读者将了解到培养基中各种组分的重要性和对细胞生长和功能的影响。

原代培养中成纤维细胞的抑制

猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养
尽量除去杂质细胞：现在一般的做法是：将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时，然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞，再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速，而心肌通常在4h后才开始贴壁，这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
（2）机械划除法
原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。
（3）反复贴壁法
成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠,大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中，用眼科剪去除非胰腺组织，4℃Hanks液清洗三次后，用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块，取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中，于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min，加入两倍体积4℃Hanks液终止消化，用吸管反复吹吸后过80目筛网，滤液以800rpm低速离心70s去上清液，并用4℃Hank's液低速离心清洗2次，除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇）中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后，用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h，转瓶弃去贴壁细胞，用无血清培养液低速离心洗涤两次，沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧，可长成胰岛单层细胞。

原代心肌细胞培养

原代心肌细胞培养曾石秀;廖伟【摘要】目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2012(032)002【总页数】3页(P167-169)【关键词】原代心肌细胞;培养;存活率;纯度【作者】曾石秀;廖伟【作者单位】南昌大学医学院,江西南昌330000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000;赣南医学院第一附属医院心内科,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1原代细胞培养是分子生物学和细胞生物学研究的一项基本技术。

原代心肌细胞可保存其结构和功能上的某些特点，有自发性搏动，不受神经、体液因素的干扰，有利于直接进行生理、病理及药理等多方面的研究［1］。

本研究目的为探讨一种实用的原代心肌细胞培养方法。

1 材料与方法1.1 实验试剂与配制高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco 公司)，Ⅱ型胶原酶、BrdU(5-溴-2＇-脱氧尿苷)、0.4%台盼蓝(Sigma公司)、胎牛血清(Hyclone公司)，α横纹肌肌动蛋白(α-SA)单克隆抗体、免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物工程有限公司)。

1.2 实验动物出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，雌雄不限［清洁级，江西中医学院，许可证号 SCXK(赣)2010-0001］。

1.3 实验仪器超净工作台(上海博迅公司，型号SW-CJ-2FD)、CO2培养箱(Thermo公司，型号Forma311)、低速离心机(江苏环宇公司，型号80-2型)、高精度恒温水浴箱(上海博迅公司，型号SSW-600-2S)、倒置相差显微镜(Olympus公司，型号CKX 41)等。

乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

１３实验仪器超净工作台（海浦东物理光学．上
仪器厂）Ｃ培养箱（国ＳＥＬＬＢ公司）普、Ｏ美ＨＬＡ、
通光学显微镜（日本Ｏｙｕ）离心机（大利ＡＣｌｍｐｓ、意Ｌ公司）。等
胎牛血清为接种培养液，加入１％新生牛血清为交０
换培养液。酶消化液：将胰蛋白酶溶于ＰＳ缓冲液Ｂ（Ｈ７２～．），ｐ．７４中配成０１．％胰蛋白酶消化液；将
Ｉ型胶原酶溶于ＰＳ缓冲液（Ｈ７２～７４中，Ｂｐ．．）配成００％的胶原酶消化液。０１胰蛋白酶及．８．％
１４方法．
维细胞培养常存在污染、消化不全和纯度不够等现象。为此，们参照Ｓｍｓｎ等的培养方法并作我ｉｐｏ
了改进，摸索出一种简便、可靠，且同时能培养出心肌细胞和心脏成纤维细胞的方法，心肌细胞和心为脏成纤维细胞的体外研究提供了更有效Байду номын сангаас的技术手段，作报道。现
００％Ｉ型胶原酶以２１．８：混合，配现用。现１２实验动物１～Ｆ龄Ｓ．３ｔＤ大鼠１２０～５只，由本院实验动物中心提供。
［收稿日期］２０－６３０９０－０［作者单位］１蚌埠医学院药理学教研室，．安徽蚌埠２３３２蚌３００；．埠医学院第一附属医院心血管内科，安徽蚌埠２３０３０４［作者简介］张乃菊（９１一）女，士研究生．１８，硕［通讯作者］祝晓光，研究生导师，教授．

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

原代心肌细胞培养

1 材料1.1动物出生后 1-4 天 SD 乳鼠 15 只。

1.2 试剂低糖 DMEM、胰酶(含 EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。

0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精。

培养液：培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。

1.3 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共 2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和 50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。

2 方法2.1 将胰酶用 D-Hank's 液配成 0.06%的浓度，并放置于 37℃水浴中温育好。

2.2 解剖取材：将乳鼠放入 0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。

这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。

然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的 D-Hank's 液中。

重复以上过程。

取材完毕后，撤掉取材的手术器械。

注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。

2.3 用第二套手术器械进行下列操作。

用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成 1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取 2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在 37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。

人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定

人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。

方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免疫荧光鉴定。

结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。

结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。

建立了一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。

【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。

当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。

我们参照Neuss等学者差速贴壁分离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。

一、材料与方法（一）、材料:取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步细胞分离培养。

（二）、主要试剂及配制胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠α-SMA单克隆抗体（美国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。

心包膜成纤维细胞原代培养报告---细胞定制案例

心包膜成纤维细胞的分离、培养和鉴定材料和试剂：来源：c57小鼠心脏手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）清洗液：PBS培养液：DMEM添加20%FBS 200IU双抗破红液：常规配方具体操作：1、将100uL的4％戊巴比妥注入C57小鼠体内，待小鼠麻醉至昏厥状态时，将小鼠转入75%的酒精最浸泡5min。

2、在无菌条件下，将小鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。

3、用左手持直头眼科镊子夹住小鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将小鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至小鼠下颚。

4、左手换一个无菌的弯头眼科镊子夹住最下方的腹腔，右手拿另一个无菌的手术剪将小鼠的腹腔剪开，剪开胸膜，找到心脏。

5、在无菌条件下，左手拿弯头眼科镊子将心脏轻轻固定，右手拿手术剪，剪去连在心脏上的结缔组织，取C57小鼠心脏，去除多余的组织，用预冷的PBS清洗3次。

6、左手拿直头眼科镊子，轻轻心脏固定，右手拿弯头眼科镊子撕取心脏的两层外包膜，尽量不带其他组织，若不小心带上其他组织，可用镊子轻轻的将其他组织捋去。

7、左手拿直头眼科镊子将分离的心包膜轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，用破红液浸泡2分钟，去除血细胞，再用PBS清洗2-3次。

8、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3 mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养7天，7天即可观察到心包膜成纤维细胞爬出，如图所示。

9、7天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。

结果展示：1.从细胞形态学：成纤维细胞为长梭形状，且从心包膜组织块中爬出，知道长满整瓶图1.成纤维细胞正从心包膜组织块中爬出2、荧光鉴定：使用波形蛋白Vimentin抗体进行荧光鉴定图2，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果图3，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果武汉云克隆诊断试剂研究所。

原代培养心肌细胞

原代培养心肌细胞1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.。

风湿性心脏病患者心房成纤维细胞的原代培养

风湿性心脏病患者心房成纤维细胞的原代培养陈建泉;张建成;许春萱;吴国盛【期刊名称】《中国心脏起搏与心电生理杂志》【年(卷),期】2011(25)6【摘要】Objective To develope a simple and effective method of culturing primary human atrial fibroblasts. Methods Aseptic right atrial appendage tissue specimen were obtained from adult patients who underwent surgery for rheumatic heart disease. Fresh atrial appendage tissue specimen were cut into small pieces and digested with 0.25% trypsin and 0.2% collagen II. Cell suspension was cultured in DMEM containing 20% fetal bovide serum. Cultured human atrial fibroblasts were characterized by microscope. Cells were analyzed by immunofluorescence technique withthe following antibodies ;vimentin,a-smooth muscle alpha-actin and VWF. Results The appearance of cell was typical and a great number of cells were collected. The cultured human atrial fibroblasts were positive both for vimentin antigens and for α-SMA, negative for VWF. Conclusions Trypsin and collagen II digestion is simple and effective for isolation of human atrial fibroblasts.%目的建立一种人心房成纤维细胞原代培养简单有效的方法.方法新鲜右心耳组织取自心外科风湿性心脏病手术患者,采用0.25％胰蛋白酶和0.2％Ⅱ型胶原酶消化法分离细胞,用含20％胎牛血清的DMEM培养液进行培养并传代,显微镜下观察心房成纤维细胞生长状况.波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅷ因子(VWF)抗体对细胞进行免疫荧光鉴定.结果获取大量细胞,形态典型；Vimentin、α-SMA表达阳性,VWF 阴性,鉴定为心房肌成纤维细胞.结论胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化法是一种简单有效的人心房成纤维细胞原代培养方法.【总页数】3页(P522-524)【作者】陈建泉;张建成;许春萱;吴国盛【作者单位】福建省立医院心血管病研究所福建医科大学省立临床医学院心血管内科福建福州 350001;福建省立医院心血管病研究所福建医科大学省立临床医学院心血管内科福建福州 350001;福建省立医院心血管病研究所福建医科大学省立临床医学院心血管内科福建福州 350001;福建省立医院心血管病研究所福建医科大学省立临床医学院心血管内科福建福州 350001【正文语种】中文【中图分类】R541.7+5;R541.2【相关文献】1.风湿性心脏病心房颤动患者心房组织碱性成纤维细胞生长因子及转化生长因子β1的表达及意义 [J], 肖骅;雷寒;覃数;马康华;胥雪莲;叶强2.采用组织块法培养心房颤动患者心房成纤维细胞 [J], 张建成;程显禄;黄宇坚;许春萱3.风湿性心脏病心房颤动患者心房纤维化程度与心房颤动复发的相关性 [J], 范广慈;付莉娜;王永军4.风湿性心脏病心房纤颤和非心房纤颤患者心房肌细胞内钙离子浓度变化 [J], 周更须;蔡振杰;梁延春;张荣庆;贾国良5.瑞舒伐他汀对风湿性心脏病伴心房颤动患者心房成纤维细胞体外增殖与凋亡的影响 [J], 段长恩;秦卫玲;智明星;郭晓亮;周朝元;韩培立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成纤维细胞原代分离

成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离是指从组织中分离出成纤维细胞并进行初次培养的过程。

成纤维细胞广泛存在于各种组织中，如皮肤、肌肉、内脏器官等，它们在生理和病理过程中具有重要作用。

原代分离成纤维细胞有助于研究其生物学特性、功能及在疾病发生发展中的作用。

成纤维细胞原代分离的具体步骤如下：
1.选择实验动物或组织来源：根据研究需要，选择合适的实验动物或组织来源。

例如，研究心脏成纤维细胞，可以选择新生小鼠心脏作为组织来源。

2.取材：从实验动物或组织中获取成纤维细胞所在的部分，如心脏、皮肤等。

3.酶消化：使用适当的酶（如胶原酶、胰蛋白酶等）分解组织，以暴露成纤维细胞。

酶消化过程中，需要控制温度、时间和酶的浓度，以保证细胞充分分离。

4.分离细胞：将酶消化后的组织悬液通过离心、过滤等方法，分离出成纤维细胞。

此过程中，应注意保持细胞活力，避免过度剪切和机械损伤。

5.培养：将分离出的成纤维细胞接种到培养皿或培养瓶中，加入适当的培养基，置于适当的培养条件（如温度、湿度、气体环境等）下进行原代培养。

此时，成纤维细胞会开始生长、繁殖。

6.观察与检测：在培养过程中，通过倒置显微镜观察细胞形态、数量、生长速度等，以评估分离效果和细胞活力。

此外，还可以采用特定方法（如免疫细胞化学、细胞计数等）对细胞进行鉴定和功能研究。

成纤维细胞原代分离的成功与否取决于实验设计、操作技巧和细胞生物学知识。

为了获得高活力的成纤维细胞，需要在实验过程中严格控制条件，并熟练掌握相关技术。

心脏成纤维细胞原代细胞培养

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

乳兔心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定*顾建军，朱业，张维，顾翔△（扬州大学临床医学院附属苏北人民医院心内科，江苏扬州225001）［摘要］目的：探讨并建立乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。

方法：选取新出生1 d 的新西兰白兔，采用胰蛋白酶和II 型胶原酶消化心脏组织，差速贴壁法分离和纯化心脏成纤维细胞；使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，绘制细胞生长曲线；采用CCK -8法检测细胞活力；波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞纯度；Western blot 法检测异丙肾上腺素刺激心脏成纤维细胞后I 型胶原蛋白（Col I ）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）水平。

结果：差速贴壁90 min 后在相差显微镜下可见部分成纤维细胞已贴壁生长；3 d 后成纤维细胞数量较前增多，形态多样，多为不规则的多边形及扁平形；5 d 时成纤维细胞数量显著增多（P <0.05），细胞形态趋于多样性，细胞间完全融合；细胞生长曲线类似“S ”形。

波形蛋白阳性率可达95%。

CCK -8实验结果显示在4~5 d 细胞活力最强（P <0.05）；给予第2代心脏成纤维细胞异丙肾上腺素刺激48 h 后，Col I 及α-SMA 水平显著增加（P <0.05）。

结论：本研究建立了乳兔心脏成纤维细胞原代培养方法。

［关键词］乳兔；原代培养；心脏成纤维细胞；细胞鉴定［中图分类号］ R363； R -332 ［文献标志码］ Adoi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.03.025Primary culture and identification of neonatal rabbit cardiac fibroblastsGU Jianjun ， ZHU Ye ， ZHANG Wei ， GU Xiang △（Department of Cardiology ， Subei People's Hospital Affiliated to Yangzhou University Clinical School of Medicine ， Yang⁃zhou University ， Yangzhou 225001， China. E -mail ： guxiang@ ）［ABSTRACT ］ AIM ： To explore and establish a method for primary culture of neonatal rabbit cardiac fibroblasts. METHODS ： Cardiac tissues from one -day -old New Zealand white rabbits were digested with trypsin and collagenase type II. Cardiac fibroblasts were isolated and purified with the differential adhesion method. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope ， and the growth curve of the cells was plotted. Cell viability was detected by CCK -8 assay ， and cellular purity was checked by immunohistochemical staining for vimentin. The protein levels of col‐lagen type I （Col I ） and α-smooth muscle actin （α-SMA ） induced by isoproterenol were determined by Western blot. RE⁃SULTS ： After 90 min of differential adhesion ， some fibroblasts were observed to attach to the plate and start to grow under a contrast microscope. After 3 d of culture ， fibroblasts were amplified and exhibited various morphological phenotypes with the majority of irregular polygon and flat shape. After 5 d ， the number of fibroblasts was increased significantly （P <0.05）， and the cells were confluent with morphological diversity completely. The growth curve presented nearly "S" shape. The positive expression rate of vimentin was 95%. The CCK -8 assay results indicated that the highest cell viability was at 4 and 5 d （P <0.05）. The levels of Col I and α-SMA were up -regulated notably at the second generation of cardiacfibroblasts induced by isoproterenol for 48 h （P <0.05）. CONCLUSION ： Primary culture method for neonatal rabbit car‐diac fibroblasts is established.［KEY WORDS ］ neonatal rabbits ； primary culture ； cardiac fibroblasts ； cell identification心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts ， CFs ）是心脏组织的主要组成部分，且体外培养不受神经、体液因素影响，是研究心血管疾病（如心肌纤维化、缺血缺氧再灌注等）的重要实验素材［1-4］。

SD胚鼠心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定

•论著 •SD胚鼠心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定沈俊1,2，袁平1，唐俊明2，杨建业2，李兴元2，张蕾2，赵继先1，张焕鑫1，薛仕珍1，冯怡1，王家宁1,2基金项目：国家自然科学基金(81270221)作者单位：1 442000 十堰,湖北医药学院附属人民医院心内科1病区;2 442000 十堰,湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所通讯作者：王家宁,E-mail:rywjn@ doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.08【摘要】目的建立适用于胚胎大鼠心脏成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。

方法从SD孕19 d大鼠子宫中分离出胚胎鼠，再从胎鼠中分离出心脏，将心脏剪成肉糜状，用胰蛋白酶加上Ⅱ型、Ⅳ胶原酶联合消化法分离心脏成纤维细胞，再通过差速贴壁分离法分别收集、培养胚胎大鼠心脏成纤维细胞。

在光学显微镜下观察心脏成纤维细胞形态特征的变化，用第2代心脏成纤维细胞用波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）、血管性血友病因子（vWF）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光鉴定。

结果差速贴壁法分离的心脏成纤维细胞原代培养120 min已经完全贴壁，培养第3~5代细胞生长良好，24 h心脏成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%，培养2~3 d时心脏成纤维细胞增殖活力最强。

结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离胚胎大鼠心脏成纤维细胞，此种方法可得到产量大，纯度高，活力好的心脏成纤维细胞，适用于细胞水平上的心血管疾病发病机制的研究。

【关键词】心脏成纤维细胞；原代培养；胚鼠；鉴定【中图分类号】R322.1 【文献标志码】A 【文章编号】1674-4055(2016)12-1441-04Primary culture and identification of embryonic rat cardiac fibroblasts SHEN Jun *, YUAN Ping, TANG Jun-ming, YANG Jian-ye, LI Xing-yuan, ZHANG Lei, ZHAO Ji-xian, ZHANG Huan-xin, XUE Shi-zhen, FENG Yi, WANG Jia-ning. *Department of Cardiology and Institute of Clinical Medicine , Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei 442000, China.Corresponding author: WANG Jia-ning, E-mail: rywjn@[Abstract ] Objective To establish a suitable method for the isolation, culture and identification of embryonic rat cardiac fibroblasts in vitro. Methods Embryos of pregnant SD rats (19 days) were taken to get its heart, then the heart were cut into meat paste and digested with trypsinase plus collagenase Ⅱ/Ⅳ to isolate cardiac fibroblasts. Cardiac fibroblasts from embryonic rat hearts were harvested by differential adherent separation. The morphological changes of cardiac fibroblasts were observed under light microscope. The second generation of cardiac fibroblasts was identified by immunofluorescence with vimentin, desmin, von Willebrand factor (vWF) and smooth muscle actin (α-SMA). Results The primary culture of cardiac fibroblasts isolated by differential adherence method was completely adherent for 120 min, and the cells were cultured well in the third to fifth passage. The purity of cardiac fibroblast vimentin immunofluorescence was up to 97% after 24 hours. Cultured for 2 to 3 days, the proliferation of cardiac fibroblasts was the strongest. Conclusion Differential adherence assay combined with immunofluorescence assay can be used to separate embryonic rat cardiac fibroblasts. A great quantity, purity and high survival rate of cardiac fibroblasts can be effectively cultured by this method. And it is useful to explore the pathologic mechanisms of cardiovascular disease in cellular level.[Key words ] Cardiac fibroblasts; Primary culture; Embryonic rat; Identification体外培养的心脏成纤维细胞，作为一种体外实验研究模型，已用于多种心血管疾病的研究，如心肌梗死后心脏纤维化、缺血缺氧再灌注模型等，是心血管疾病基础研究的基本方法之一，应用前景广阔[1-3]。