基因工程一轮复习

(3)限制性核酸内切酶 Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶 EcoR Ⅰ的识
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别序列及切割位点分别是
和
。如图
—CAATTG— —GAATTC—
表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切
酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目
的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。
提示 适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适 合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的 识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作 载体。
原核细胞
将目的基因插入到Ti 将含有目的基因的 Ca2＋处理细胞→
质粒的T－DNA上→ 表达载体提纯→取 感受态细胞→重
导入农杆菌→侵染植 卵(受精卵)→显微注 组表达载体与感 转化过程
物细胞→整合到受体 射→受精卵发育→ 受态细胞混合→
细胞的染色体DNA上 获得具有新性状的 感受态细胞吸收
ຫໍສະໝຸດ Baidu
→表达
动物
DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
1.下列物质或过程哪一项不影响磷酸二酯键数目变化？请逐项分 析说明。
①RNA聚合酶、逆转录酶、Taq酶 ②DNA聚合酶、DNA连接 酶、DNA酶 ③遗传信息的翻译、PCR中DNA解链 ④cDNA文库的构建、基因突变过程 提示 ③ RNA聚合酶、逆转录酶和Taq酶的作用都会导致磷 酸二酯键的数量增加，DNA聚合酶和DNA连接酶的作用都会 导致磷酸二酯键的数量增加，而DNA酶的作用会导致磷酸二酯 键的数量减小，遗传信息的翻译会增加肽键的数目，PCR中 DNA解链会减少氢键的数目，这两个过程都不会影响磷酸二酯 键的数目，cDNA文库的构建需要使用逆转录酶，这会导致磷 酸二酯键数目增加，基因突变是指基因中碱基对的增添、缺失 和替换，其中增添和缺失会导致磷酸二酯键数目改变。
如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是 GAATTC ， 切割位点在 G和A 之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是
CCCGGG ，切割位点在 G和C 之间；说明限制酶具有 专一性 。
(2)DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段 拼接成DNA分子 。 ②类型
常用类型 E·coli DNA连接酶
2.(教材P4“寻根问底”改编)根据你所掌握的知识，你能分析出 限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 提示 原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物 在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来 病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源 DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身 的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使 之失效，从而达到保护自身的目的。
RNA聚合酶
转录
目的基因
转录
③构建过程
同种限制酶
DNA连接
(3)将目的基因导入受体细胞 受体细胞种类不同，导入方法不同
生物种类 常用方法 受体细胞
植物细胞
农___杆__菌__转__化__法__
体细胞或受精卵
动物细胞
_显__微__注___射__法___ ___受___精__卵_____
微生物细胞
____转__化__法_____
②其他载体：λ噬菌体衍生物、 动植物病毒 等。 ③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
(1)基因工程2种工具酶的化学本质分别是什么？运载体的种类有 哪些？ 提示 限制酶、DNA连接酶其化学本质均为蛋白质。运载体的 种类有质粒(常用)、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
(2)限制酶为何不切割自身DNA? 提示 限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序 列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原 因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3.(教材P6“旁栏思考题”解答)想一想，具备什么条件才能充当 “分子运输车”？ 提示 能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因及对 受体细胞无害等。
1.(2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA 插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青 霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体 用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合， 加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠 杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大 肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含 有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1) 质 粒 载 体 作 为 基 因 工 程 的 工 具 ， 应 具 备 的 基 本 条 件 有 ________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基 本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠 杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分 的，其原因是______________；并且________和________的细胞 也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础 上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落， 还需使用含有________的固体培养基。 (3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复 制所需的原料来自于____________________________________。
T4 DNA连接酶
来源 功能
_大__肠__杆__菌___ 只“缝合”_黏__性__末__端___
T4噬菌体 “缝合”_黏__性__末__端__和__平__ __末__端___
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_磷__酸__二__酯__键__
(3)载体
双链环状DNA分子
割位点
限制酶切 标记基因
2.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的获取 ①目的基因：主要指 编码蛋白质 的基因，也可以是一些具 调控 作用的因子。 基因文库
mRNA反转录 DNA合成仪
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心 ①目的：使目的基因 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗 传给下一代 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 ②基因表达载体的组成
基因工程
[最新考纲] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。 2.基因工程的原理及技术(含PCR技术Ⅱ)。 3.基因工程的应用(Ⅱ)。 4.蛋白质工程(Ⅰ)。 5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
考点一 基因工程的基本工具及操作过程
1.基因工程的基本工具 (1)限制性核酸内切酶(限制酶) ①来源：主要从 原核 生物中分离纯化而来。 ②作用：识别 特定的核苷酸序列 并切开特定部位的两个核 苷酸之间的 磷酸二酯键。 ③结果：产生 黏性末端 或平末端。