实验两对半的检测ppt课件
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乙肝两对半PPT课件
ALT 肝组织无明显异常 肝组织坏死炎症表现 活动性慢性乙型肝炎 肝硬化 肝组织无明显异常 肝组织坏死炎症
Lok ASF. N Engl J Med 2002; 346(22):1682 Yim HJ, Lok AS. Hepatology, 2006,43:S173-S181
活动性慢性乙型肝炎 肝硬化
前S蛋白/抗前S蛋白：前S：出现在急性HBV感染的最早期,在
HBsAg消失之前消失,是病毒清除的最早迹象。抗前S是最早出现的抗 体，前S抗体参与病毒清除机制。最早出现抗前S，可能是病毒将清 除最早标志物。在暴发性肝炎，出现抗前S可能预示垂危中的生机。
HBV的抗原抗体系统HBcAg和抗HBc1
HBcAg：是病毒核壳的结构蛋白，包裹在病毒的核心中，不
短链的5'-末端通过长达250-300个核苷酸的碱基配对而维持分子 的环状结构。DNA多聚酶作用不断延长短链3′端以修补缺口。缺 口可能与HBV的DNA在感染细胞内的整合有关。 总而言之，Dane颗粒是一个完整的乙肝病毒颗粒，存在于乙肝病 毒携带者或乙肝病人的血清或肝细胞中，它只能在电子显微镜下 才能被看到，临床上我们检测乙肝病毒的抗原、抗体以及它的 DNA来判断是否感染了HBV。
园形颗粒和管形颗粒是HBsAg的空壳，而Dane颗粒中存在乙肝病 毒核酸（即DNA）。 Dane颗粒是具有感染性的完整的HBV颗粒，呈球形，Dane颗粒直 径只有42纳米，乙肝病毒有包膜和核心两个部分，外壳厚7—8纳 米，就是HBsAg（乙肝表面抗原）。核心颗粒直径28纳米，呈二 十面体立体对称。
Dane’s 颗粒 小球形颗粒 管形颗粒
乙肝病毒（HBV）是一种DNA病毒，乙肝病毒对人的肝脏“情有独 衷”，在生物学上它是嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）家族中 的一员。这个家族中的病毒成员在哺乳动物和鸟类的身上也都有 发现，它们的结构、基因序列和复制策略都非常相似，但是它们 之间却不会互相交叉。
乙肝两对半定性测定ppt课件
影响检测结果的因素
3.操作技术的影响 3.1 加样吸嘴的洁净 与否和吸量的准确性， 直接影响检测结果。
常见模式及临床意义
HBsAg HBsAb
HBeA g
+
－
+
+
－
－
+
－
－
+
－
－
+
－
+
+
－
－
HBeA b
HBcAb
临床意义
－
+
急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV 复制，传染性强－大三阳
+
+
急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg 携带者；传染性弱－小三阳
夹心法 HBsAg
HBeAg
夹心法 HBeAb
HBeAb
竞争法 HBeAb
HBcAb
竞争法 HBcAg
标记或结合物 HBsAb HBsAg
结果判断 显色(+) 显色(+)
HBeAb
显色(+)
HBeAb及中和抗 原
HBcAb
不显色(+) 不显色(+)
结果判定
2.酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm 或双波长450nm/630nm测定各孔OD 值，根据OD值判定结果
b
临床意义
－
+
+
－
+ 非典型性或亚临床型HBV感染
－
+
－
－
－
注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染； 假阳性
－
+
－
+
+ 急性HBV感染后康复
《乙肝二对半定量检》课件
检测方法流程
样本采集
采集血液样本，并将其转移到实验室进行处理。
试剂配置
根据检测方法的要求，准备所需试剂和材料。
实验操作
按照检测方法的步骤进行样品处理、荧光探针探断乙肝病毒的存在和含量。
结果解读与分析
1 阳性结果
表示样品中存在乙肝病毒，且含量较高。需进一步确认和治疗。
乙肝二对半定量检测介绍
乙肝二对半定量检测是一种常用的乙肝病毒检测方法，用于定量测定血液中 乙肝病毒的含量。
检测方法原理
1
免疫测定法
利用抗体与乙肝病毒抗原的特异性结合来实现乙肝病毒的检测。
2
荧光定量PCR法
通过提取病毒DNA/RNA，使用荧光标记技术进行定量检测。
3
核酸杂交法
基于互补配对原理对乙肝病毒的核酸进行特异性结合和检测。
定期检查和保养实验仪器，确保其正常运行。
质量控制管理
为保证检测结果的准确性和可靠性，需要进行质量控制管理，包括： • 设立质控样本，定期进行质控测试。 • 记录和分析质控结果，及时调整实验方法和操作。 • 培训实验人员，提高操作技能和质量意识。
实验常见问题与处理方案
问题 假阳性结果 检测结果不稳定
样品处理失败
处理方案 进行重测，注意排除实验操作中的污染。 检查试剂和仪器是否正常，重复实验并进行质 控。 重新采集样本，注意操作流程和操作技巧。
2 阴性结果
表示样品中未检出乙肝病毒，但不能完全排除感染的可能性。
3 边缘结果
表示样品中乙肝病毒含量较低，需要进一步检测以确定感染情况。
实验操作注意事项
严格遵守无菌操作
避免样品污染和交叉感染。
准确使用试剂和仪器
遵守使用说明，确保实验结果的准确性。
乙肝两对半检验报告解读教学讲义PPT
个人卫生
保持良好的个人卫生习惯，勤洗手、避免与他人共用餐具等物品 ，以降低病毒传播风险。
防护措施
在公共场所、医院等地方，应采取必要的防护措施，如佩戴口罩、 保持社交距离等，以降低感染风险。
避免接触血液和体液
避免直接接触乙肝患者的血液和体液，尤其是皮肤有破损时更应注 意防护。
THANKS
感谢观看
判断传染性
HBeAg阳性表示病毒正在复制， 并且具有传染性。若HBeAg阴性 ，则表示病毒复制相对较低，传 染性较弱。
评估治疗效果
监测抗病毒治疗的效果
在接受抗病毒治疗后，患者需要定期 进行乙肝两对半检验，以监测治疗效 果。若治疗后HBsAg、HBeAg等指 标逐渐降低，则表明治疗有效。
指导后续治疗方案
CHAPTER
04
乙肝两对半检验报告的注意事 项
报告的时效性
01
乙肝两对半检验报告的有效期通 常为1-2个月，超过这个时间，报 告的结果可能不再准确反映受检 者的乙肝病毒感染状态。
02
如果在报告有效期内，受检者出 现乙肝病毒感染症状或接触过乙 肝病毒携带者，建议重新进行乙 肝两对半检验。
报告的准确性
选择正规的医疗机构进行乙肝两对半 检验，以确保检验结果的准确性。
在进行乙肝两对半检验前，应避免饮 酒、过度疲劳或服用可能影响肝脏功 能的药物，以免影响检验结果。
报告的隐私保护
乙肝两对半检验报告涉及个人隐私，应妥善保管，避免泄露 个人信息。
如发现报告结果异常，应及时咨询专业医生，并遵循医生的 建议进行治疗和复查，以免延误病情。
乙肝两对半检验报告解 读教学讲义
CONTENTS
目录
• 乙肝两对半检验报告概述 • 乙肝两对半检验报告解读 • 乙肝两对半检验报告的临床意义 • 乙肝两对半检验报告的注意事项 • 乙肝两对半检验报告的后续处理建议
乙肝两对半检测相关问题 PPT课件
变异率高 ，自然变异和免疫逃避，变异无 地域性。
HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型 HBsAb所识别。 此时用一般的国产试剂盒可能 检不出。
能导致HBsAg阴性的S区变异
145甘氨酸
精氨酸
aa124 半胱氨酸
酪氨酸
aa129 谷氨酸 天冬氨酸
aa131 苏氨酸 天冬氨酸
aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失
乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨
HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的 检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。
乙肝两对半： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。
检测结果：定性、半定量、定量。 试剂原材料：抗原（天然抗原、重组抗原）、抗
体（单抗、多抗、Fab）。 就一定漏检。很多时 候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变， 同样可以检出 。
4)RF引起的假阳性
RF是一种自身抗体，能和多种动物IgG的Fc段结 合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG，双抗体夹心 法测抗原可能有RF的干扰，产生假阳性。
固相IgG
固 相 载 体
固相McAb
标记McAb
固 相 载 体
人抗鼠抗体
Human Anti-Mouse Antibodies (HAMA)
HAMA效应的假阴性模式:
Figure 3-6 How HAMA generates a false negative
3) S基因突变引起的HBsAg漏检：
基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个 氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg 蛋白质氨 基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。
产生HAMA的原因：
HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型 HBsAb所识别。 此时用一般的国产试剂盒可能 检不出。
能导致HBsAg阴性的S区变异
145甘氨酸
精氨酸
aa124 半胱氨酸
酪氨酸
aa129 谷氨酸 天冬氨酸
aa131 苏氨酸 天冬氨酸
aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失
乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨
HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的 检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。
乙肝两对半： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。
检测结果：定性、半定量、定量。 试剂原材料：抗原（天然抗原、重组抗原）、抗
体（单抗、多抗、Fab）。 就一定漏检。很多时 候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变， 同样可以检出 。
4)RF引起的假阳性
RF是一种自身抗体，能和多种动物IgG的Fc段结 合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG，双抗体夹心 法测抗原可能有RF的干扰，产生假阳性。
固相IgG
固 相 载 体
固相McAb
标记McAb
固 相 载 体
人抗鼠抗体
Human Anti-Mouse Antibodies (HAMA)
HAMA效应的假阴性模式:
Figure 3-6 How HAMA generates a false negative
3) S基因突变引起的HBsAg漏检：
基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个 氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg 蛋白质氨 基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。
产生HAMA的原因：
如何看懂“乙肝两对半”PPT课件
如何看懂“乙肝两对半”
第二军医大学长征医院南京分 院肝脏科
第1项（HBsAg）:乙肝病毒感染。 第2项（HBsAb）:感染后免疫，对疫苗的免疫应答；
或乙肝免疫球蛋白的被动免疫。 第3项（HBeAg）:反映乙肝病毒复制，有病毒血症， 血液有高传染性。 第4项（HBeAb）:ALT持续正常者表示乙肝病毒低复 制或不复制，HBsAg(+)血液低传染性，ALT波动者表 示病毒变异。 第5项（HBcAb）:低滴度表示过去感染，高滴度表示 现行感染。
1，2，4，5项阳性，多为病毒变异引起，分
析等同于“小三阳”。
2，3，5项阳性，为病毒变异引起，为乙肝病
毒变异株活动期表现。
1项阳性，反映为乙肝病毒携带者；或处于乙
肝病毒急性感染期，应注意复查。
5项阳性，反映为既往有乙肝病毒感染，现已
完全清除，但对乙肝病毒无免疫性，应注意 复查，必要时注射乙肝疫苗。
1,2,3,4,5项均阴性，为正常但对乙肝病毒无
免疫力的人群，应及时注射乙肝疫苗进行保 护。
2，4，5项阳性，多考虑急性乙肝病毒感染的
恢复阶段，应注意复查；或有合并其他肝炎 病毒感染，应加以排除。
2，5项阳性，多考虑因感染乙肝病毒，而出
现保护性抗体，应注意复查。
1，3，5项阳性，俗称“大三阳”，表示乙肝
祝 您SUCCESS
2019/4/20
病毒处于活动期。应进一步检查，以确定治 疗方法。
1，4，5项阳性，俗称“小三阳”，如结合肝
功能正常，则考虑乙肝病毒处于非活动期； 如肝功能异常，则多考虑有病毒变异株活动。
THANK
YOU
SUCCESS
2019/4/20
1，2，3，5项阳性，主要是病毒变异引起，
第二军医大学长征医院南京分 院肝脏科
第1项（HBsAg）:乙肝病毒感染。 第2项（HBsAb）:感染后免疫，对疫苗的免疫应答；
或乙肝免疫球蛋白的被动免疫。 第3项（HBeAg）:反映乙肝病毒复制，有病毒血症， 血液有高传染性。 第4项（HBeAb）:ALT持续正常者表示乙肝病毒低复 制或不复制，HBsAg(+)血液低传染性，ALT波动者表 示病毒变异。 第5项（HBcAb）:低滴度表示过去感染，高滴度表示 现行感染。
1，2，4，5项阳性，多为病毒变异引起，分
析等同于“小三阳”。
2，3，5项阳性，为病毒变异引起，为乙肝病
毒变异株活动期表现。
1项阳性，反映为乙肝病毒携带者；或处于乙
肝病毒急性感染期，应注意复查。
5项阳性，反映为既往有乙肝病毒感染，现已
完全清除，但对乙肝病毒无免疫性，应注意 复查，必要时注射乙肝疫苗。
1,2,3,4,5项均阴性，为正常但对乙肝病毒无
免疫力的人群，应及时注射乙肝疫苗进行保 护。
2，4，5项阳性，多考虑急性乙肝病毒感染的
恢复阶段，应注意复查；或有合并其他肝炎 病毒感染，应加以排除。
2，5项阳性，多考虑因感染乙肝病毒，而出
现保护性抗体，应注意复查。
1，3，5项阳性，俗称“大三阳”，表示乙肝
祝 您SUCCESS
2019/4/20
病毒处于活动期。应进一步检查，以确定治 疗方法。
1，4，5项阳性，俗称“小三阳”，如结合肝
功能正常，则考虑乙肝病毒处于非活动期； 如肝功能异常，则多考虑有病毒变异株活动。
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2019/4/20
1，2，3，5项阳性，主要是病毒变异引起，
乙肝五项指标二对半ppt课件
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9
9、急性感染早期或者慢性乙肝 表面抗原携带都传染性弱。
09.12.2020
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10、慢性乙肝表面抗原携带者易转阴 或者是急性感染趋向恢复。
09.12.2020
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11、早期乙肝惑染或者慢性携带者， 传染性强。
09.12.2020
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12、急性乙肝感染趋向恢复。 或者为慢性携带者。
09.12.2020
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09.12.2020
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2
2、急性乙肝感染阶段或是慢性 乙肝表面抗原携带者。 传染性弱些。
09.12.2020
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5
3
3、乙肝已趋向恢复，属于慢性携带者。 传染性弱，长期持续此状态可转变为 肝癌。
09.12.2020
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4
4、既往感染过乙肝，现仍有免疫力， 属于不典型恢复期。 也可能为急性乙肝感柒期。
乙肝五项指标(二对半)的说明
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
乙肝五项正常检验结果
1.
乙肝表面抗原
(HBsAg)
2.
乙肝表面抗体
(HBsAb)
3.
乙肝e抗原(HBeAg)
4.
乙肝e抗体(HBeAb)
5.
乙肝核心杭体
09.12.2020
(HBcAb)·
2
乙肝检验结果
09.12.2020
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3
1
1、俗称三大阳: 说明患者是慢性肝炎，有传染性. 处于活动期。
09.12.2020
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5、既往有乙肝感染。 属于急性感染恢复期，少数人仍有传染性
(精选课件)ELISA2-乙肝两对半PPT幻灯片
(450nm处测定吸光度)。
.
结果判断及解释
COV=2.1 × OD阴性对照（ OD阴性对照低于0.05 按0.05计算）
阳性：OD样品≥COV 阴性：OD样品＜COV
检测有效性
OD阴性对照≤0.10，OD阳性对照≥1.0 OD空白对照≤0.015（双波长检测）
15
.
e抗体检测(竞争抑制法)
1. 准备：试剂盒各组份在37℃平衡30min； 2. 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 3. 加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性
12
.
e抗原检测(夹心法)
1. 准备：试剂盒各组份在37℃平衡30min； 2. 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 3. 加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性
对照和空白对照（不加样品）； 4. 加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）； 5. 孵育：贴上封膜，37 ℃反应30min；
13
6. 洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留 时间10-15s，并注满反应微孔；
.
7. 显色：先加显色液A50ul，再加入显色液 B50ul，贴上封膜，37℃反应15min(避 光)；
（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）
8. 终止：加终止液50ul；
9. 判读：终止反应后10min内完成。
14
处测定吸光度)。 8
.
结果判断及解释
COV=2.1×OD阴性对照 阳性：OD样品≥COV 阴性：OD样品＜COV
检测有效性
OD阴性对照≤0.10， OD阳性对照≥1.0 OD空白对照≤0.04（双波长检测）
9
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表面抗体检测(夹心法)
1. 准备：试剂盒各组份在37℃平衡30min； 2. 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 3. 加样品：每孔加50ul，同时设阳性对照、阴
两对半ppt下载
VIP专享文档下载特权自VIP生效起每月发放一次， 每次发放的特权有效期为1个月，发放数量由您购买 的VIP类型决定。
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服务特 权
共享文档下载特权
VIP用户有效期内可使用共享文档下载特权下载任意下载券标价的文档（不含付费文档和VIP专享文档），每下载一篇共享文
体是既往感染的标志
包括抗-HBc IgM 抗-HBc IgG
临床工作中,比较常 见的检测结果
e抗原阳性的乙肝 (大三阳)
HBsAg
（+）
HB病eAg毒正在体（内+）复制，
抗-HBs 抗-HBe
传染性（ 强） （）
抗-HBc
（+）
抗-HBC IgM
（）
e抗原阴性的乙肝 (小三阳)
H1Bs.A急g 性HBV感染（趋+）于恢复
乙型肝炎病毒血清标 志物的临床意义
吉林医药学院附属医院传染病科
我院二对半的化验单
HBsAg HBeAg 抗-HBs 抗-HBe 抗-HBc 抗-HBC IgM
（） （） （） （） （） （）
HBsAg
是病毒外壳成分 证本明身患无者感一染定性携带病毒
有抗原性,可诱发机体产生 相应抗体
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱBsAb
抗-HBe
（）
抗-HBc
（+）
抗-HBC IgM
（）
1H.B既sAg往感染过（乙肝）
HBeAg
（）
2抗.-急HBs性乙肝感染（+后）康复中
抗-HBe
（+）
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• 操作简单、无需昂贵的仪器投入，价格便 宜。
• 对环境几乎没有污染。
4
ELISA技术的应用
• 检测抗原的方法： • 检测抗体的方法：
• 双抗体夹心法 • 竞争法
• 双抗原夹心法 • 间接法 • 竞争法 • 捕获法
5
实验目的
• 掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、 操作步骤及注意事项。
• 掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
10
E EE
E
E
E
E EE
+
双抗体夹心法测抗原 -
11
竞争抑制法测抗体
待测抗体
酶标
抗体 *
Anti-HBc Anti-HBe
包被抗原
12
中和竞争法测抗体
* 酶标抗体
待测抗体 Anti-HBe
中和抗原
包被抗体
13
试剂盒组成
6
什么是“乙肝二对半”？
“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表
面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体 （HBeAb）、核心抗体（HBcAb）
① HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性 ② 保护性抗体： HBsAb ③ 传染性指标： HBeAg ， HBcAg ④ HBeAb， HBcAb不是保护性抗体，而是反
ELISA）
酶联：抗原或抗体的酶标记。 免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。 吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。
在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底 物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的 抗原或抗体的量直接相关。
3
ELISA技术特点
• 具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床 需要，应用广泛。
15
实验操作
1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对 照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检 测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀 释）。
2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul
3、加酶结合物：每孔50ul
4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟
） 19
ELISA的注意事项
• 标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）
• 试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度°C30分钟）、摇匀 • 加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。 • 温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用） • 洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。 • 显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。 • 比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。 • 结果判定：反应终止后10分钟内 • 质量控制：内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识） • 表面抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见模式均须复查 • 生物安全：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置 或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一 定要拍干）
6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混 匀后置37°C水浴10分钟
7、中止显色：每孔加入中止液50ul
8、判断结果：
16
①目测法：
•HBsAg， HBsAb， HBeAg
① 包被反应板：固相的抗原或抗体 ② 酶结合物：酶标记的抗原或抗体 ③ 显色剂：分A、B二瓶 ④ 终止液 ⑤ 对照：阳性对照，阴性对照 ⑥ 浓缩洗涤液 ⑦ 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才
有）
14
实验准备
• 配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩 洗涤液。
• 为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb ）组外，其余组可在加样后的温育时间中才 配制洗涤液。
ELISA检测“乙肝二对半”
(Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA)
1
酶 免
酶免疫组化
均相酶免疫测定
疫
技
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
术
分
固
液
类
相
相
酶
酶
免
免
疫
疫
测
测
定
定
2
ELISA的概念
酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，
• HBsAb：双抗原夹心法
• HBeAg：双抗体夹心法
• HBeAb：中和竞争法（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗
原）
• HBcAb：竞争抑制法
9
双抗原（体）夹心法测抗体（原 ）
待测抗体
* 酶标抗原
包被抗原
双抗原夹心法
Anti-HIV, Anti-HBs
* 酶标抗体
待测抗原
包被抗体
双抗体夹心法
17
•HBeAb ， HBcAb
18
②比色法：波长450nm读取各孔OD值
• HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 阳性
• HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 阳性
（建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验
指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同
映曾被HBV感染的重要指标。 7
为什么不检测核心抗原（HBcAg）
• HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 • 机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的
HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。 • 血清中， HBcAg可丢失部分氨基酸。
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“乙肝二对半”的检测原理
• HBsAg：双抗体夹心法
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常见的检测模式（临床意义2）
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思考题
• sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照 孔也出现颜色？
• 为什么建议用双波长比色。
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• 对环境几乎没有污染。
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ELISA技术的应用
• 检测抗原的方法： • 检测抗体的方法：
• 双抗体夹心法 • 竞争法
• 双抗原夹心法 • 间接法 • 竞争法 • 捕获法
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实验目的
• 掌握ELISA法检测“乙肝二对半” 的原理、 操作步骤及注意事项。
• 掌握检测“乙肝二对半”的临床意义。
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
10
E EE
E
E
E
E EE
+
双抗体夹心法测抗原 -
11
竞争抑制法测抗体
待测抗体
酶标
抗体 *
Anti-HBc Anti-HBe
包被抗原
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中和竞争法测抗体
* 酶标抗体
待测抗体 Anti-HBe
中和抗原
包被抗体
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试剂盒组成
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什么是“乙肝二对半”？
“乙肝两对半”是指：表面抗原（HBsAg）、表
面抗体（HBsAb）、e抗原（ HBeAg ）、e抗体 （HBeAb）、核心抗体（HBcAb）
① HBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性 ② 保护性抗体： HBsAb ③ 传染性指标： HBeAg ， HBcAg ④ HBeAb， HBcAb不是保护性抗体，而是反
ELISA）
酶联：抗原或抗体的酶标记。 免疫：以抗原抗体特异性反应为基础。 吸附：抗原或抗体包被于固相载体表面。
在固相载体表面实现抗原抗体的反应，通过酶标记的手段，酶催化底 物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的 抗原或抗体的量直接相关。
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ELISA技术特点
• 具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床 需要，应用广泛。
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实验操作
1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别加入阴、阳对 照50ul。其余各孔为样品孔，各加入待测标本50ul（检 测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀 释）。
2、加中和试剂（只有检测HBeAb时才需要）：每孔50ul
3、加酶结合物：每孔50ul
4、温育：封板→充分混匀后置37°C水浴30分钟
） 19
ELISA的注意事项
• 标本：内源性（RF、补体、嗜异性抗体等） 外源性因素（溶血、细菌污染、保存不当、凝集不全、防腐剂NaN3等）（P229）
• 试剂：试剂质量、批号、是否失效（冰箱温度）、平衡（37度°C30分钟）、摇匀 • 加样：加样准确、不可太快，避免加在上部和产生气泡。 • 温育：温度（定期观察与登记）、时间、湿度、封片（不可重复用） • 洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要拍板。 • 显色：加试剂时不可重复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。 • 比色：建议用双波长（可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响）。 • 结果判定：反应终止后10分钟内 • 质量控制：内对照、室内质控、室间质评等（全程质控意识） • 表面抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见模式均须复查 • 生物安全：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
5、洗涤：弃去反应条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置 或振荡1分钟，弃去拍干→反复5次（注意：最后一次一 定要拍干）
6、显色：每孔先加显色剂A 50ul，再加显色剂B 50ul，混 匀后置37°C水浴10分钟
7、中止显色：每孔加入中止液50ul
8、判断结果：
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①目测法：
•HBsAg， HBsAb， HBeAg
① 包被反应板：固相的抗原或抗体 ② 酶结合物：酶标记的抗原或抗体 ③ 显色剂：分A、B二瓶 ④ 终止液 ⑤ 对照：阳性对照，阴性对照 ⑥ 浓缩洗涤液 ⑦ 中和试剂（只有检测HBeAb的试剂盒才
有）
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实验准备
• 配制洗涤液：用蒸馏水按1：20稀释浓缩 洗涤液。
• 为节省试验时间，除检测核心抗体（HBcAb ）组外，其余组可在加样后的温育时间中才 配制洗涤液。
ELISA检测“乙肝二对半”
(Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA)
1
酶 免
酶免疫组化
均相酶免疫测定
疫
技
酶免疫测定
非均相酶免疫测定
术
分
固
液
类
相
相
酶
酶
免
免
疫
疫
测
测
定
定
2
ELISA的概念
酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，
• HBsAb：双抗原夹心法
• HBeAg：双抗体夹心法
• HBeAb：中和竞争法（血清中的e抗体与固相e抗体竞争结合e抗
原）
• HBcAb：竞争抑制法
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双抗原（体）夹心法测抗体（原 ）
待测抗体
* 酶标抗原
包被抗原
双抗原夹心法
Anti-HIV, Anti-HBs
* 酶标抗体
待测抗原
包被抗体
双抗体夹心法
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•HBeAb ， HBcAb
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②比色法：波长450nm读取各孔OD值
• HBsAg， HBsAb， HBeAg 样品OD值/阴性对照OD值≥2.1 阳性
• HBeAb ， HBcAb 阴性对照OD值/样品OD值≥2.1 阳性
（建议双波长比色（450/630nm）；临界值的确定请参考实验
指导，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同
映曾被HBV感染的重要指标。 7
为什么不检测核心抗原（HBcAg）
• HBcAg主要位于病毒颗粒中，只有少数游离。 • 机体免疫系统对HBcAg很敏感，易产生高滴度的
HBcAb,与HBcAg 形成免疫复合物。 • 血清中， HBcAg可丢失部分氨基酸。
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“乙肝二对半”的检测原理
• HBsAg：双抗体夹心法
20
常见的检测模式（临床意义2）
21
思考题
• sAg检测时，有哪些因素可能导致阴性对照 孔也出现颜色？
• 为什么建议用双波长比色。
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