黄曲霉毒素净化柱使用手册最新

黄曲霉毒素B/G免疫亲和净化柱使用手册

目录

1、AflaCLEAN TM黄曲霉毒素免疫亲和柱说明书

2、样品处理方法

3、柱后衍生技术

4、实验操作注意事项

5、主要技术指标和参数

6、黄曲霉毒素分析实验室配置

7、参考文献

8、欧盟相关规定中黄曲霉毒素的限量表

9、附件

AflaCLEAN TM黄曲霉毒素

免疫亲和柱说明书

LCTech 公司的AflaCLEAN TM免

疫亲和净化柱采用单克隆抗体技术，

预先在净化柱壁涂布了黄曲霉毒素B

和G的抗体，当提取样品液过净化柱

时，黄曲霉毒素就会被吸附保留在柱

子上，而其他杂质则被排除，然后再

用甲醇将黄曲霉毒素从净化柱上洗脱

下来进行黄曲霉毒素检测分析的前处

理，适用于食品，饲料以及相关原料

中黄曲霉毒素检测时，样品的净化处

理，特点是适用范围广，平行性好，

回收率高，重新性好，操作简单，性

价比高。

一、AflaCLEAN TM黄曲霉毒素免疫亲和柱产品组成

1、AflaCLEAN TM净化柱25支/盒

2、批次证书和使用说明书

二、实验准备

1、样品处理方法：详见：“样品处理方法”

2、试剂配制

（1）样品提取溶剂：甲醇/水（4/1，v/v）

（2）5mmol磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH7.2）母液配制：

1）称取50.14gNa2HPO4.12H2O溶解于700ml水中。

2）称取9.66gNaH2PO4.1H2O溶解于350ml水中。

3）将上述两种溶液进行混合并加入42.5gNaCl，配制成pH7.2 5mmol 磷酸盐缓冲溶液

（3）1mmol磷酸盐缓冲溶液(PBS)（pH7.2）工作液配制：

取200ml 的5mmol磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）稀释于800ml水中。

（4）磷酸盐缓冲溶液（PBS）/吐温(Tween)配制：

取8ml吐温-20稀释于92mlpH7.2磷酸盐缓冲溶液中

（5）HPLC 流动相配制：水/甲醇/乙腈（60/30/15,v/v）

三、实验步骤

1、净化柱平衡：将净化柱于室温中放置15min以上，平衡至室温。

2、过柱：取5-50ml的样品提取稀释液上AflaCLEAN TM净化柱，在过柱中可以对净化柱进行加压或抽真空，但必需保证柱流速1-2滴/秒。该净化柱最大上样量以黄曲霉毒素B1计为150ng。

3、清洗：用10ml蒸馏水清洗净化柱。

4、除水：用气体吹扫或抽真空除去柱子中的残余的水份。

5、洗脱：每次用1ml甲醇洗脱柱子，可洗2次，第一次加入的甲醇需在柱子中保持5min进行活化柱子。

6、检测：将洗脱液进行稀释或浓缩，以便达到您的直接进行HPLC检测要求；或将洗脱液小心地浓缩至干，在低温避光条件下进行保存。

7、HPLC参考分析方法：

黄曲霉毒素检测需要一台配有荧光检测器的HPLC系统。

黄曲霉毒素HPLC分析检测条件可参照以下设定：

流动相：水/甲醇/乙腈 60/30/15 (v/v)；流速：1.2ml/min

进样量：10-100µL；柱温：36℃

HPLC分析柱：150×4.6mm；RP C18（货号：10522）

荧光检测器设置：EX.:365nm;Em.:460nm (使用柱后衍生系统，

详见柱后衍生技术)

或Em.:430nm用于黄曲霉毒素B类的检测和455nm用于黄

曲霉毒素G类的检测

四、AflaCLEAN TM柱贮存

1、4-30℃贮存，不能过低或过高温度贮存。

2、有效期12个月

五、食品中黄曲霉毒素限量标准参阅（欧盟EC No 1881/2006）

六、相关检测依据：（A. Papadopoulou-Bouraoui, J. Stroka, E. Anklam, J. AOAC Intl. 85, No. 2, 2002, 411-416 & FAPAS 0490/2006 “Aflatoxin Analysis in Pistachios”）五、批号：见产品包装

样品处理方法

为得到比较好的结果，要考虑不同样品的基质区别（主要考虑脂肪和一些特殊组分），相应的样品处理方法有所差异。如下介绍三种样品处理方法：方法一标准方法；方法二：标准方法加正己烷分层；方法三：标准方法加正己烷分层和PBS/Tween稀释。表2是一些具体样品采用三种处理方法得到的结果。

样品处理时，以下事项需要注意：

●上样量：不大于2g/柱

●上样量/上样体积：最大1g/10ml粗提液

●上样体积：0-50ml/柱（最终上柱提取液中最大甲醇含量不超过14%）

●黄曲霉毒素/上样体积：最大2ng/ml粗提液

●如果AflaCLEAN TM柱和缓冲溶液是在低温下储存，在使用前需放置室温再

使用。

●上柱样品中基质尽量少，可以减少杂质干扰和减少柱堵塞的风险。

●分析方法的灵敏度不仅与样品最终杂质含量有关，还和柱净化处理后的过程

有关（浓缩或稀释，分析进样体积）

●使用甲醇作为提取溶剂和洗脱溶剂的效果要比乙腈的好

●不同样品处理方法最终测出的结果会有显著差异的，为保证样品处理方法选

用正确，可参考“实验操作注意事项”。

方法一：标准方法

该处理程序适用于样品基质中没有干扰，主要适用于大多数谷类样品的处理。

1、取20g样品加入100ml提取液（甲醇/水，4/1，v/v）放入匀浆机中，并高速搅拌5分钟。

2、用滤纸过滤上述提取液

3、取14ml过滤后的提取液加入86ml的1mmolPBS缓冲溶液（pH 7.2）。如果样品量比较少，取样品体积可以适当减少（如1.4ml+8.6ml缓冲溶液）。如混合过程中有沉淀产生，样品需要用注射过滤器进行过滤或进行离心。

4、打开净化柱上密封盖和下面堵头后，柱中的缓冲溶液会排出，直到缓冲溶液液面达到柱中填料上层处。