荧光显微镜检测细胞凋亡
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡的检测方法一、细胞凋亡概念：细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。
细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。
选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。
二、细胞凋亡的检测方法：1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法)在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。
荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子2. Caspase-3活性的检测:半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。
其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。
Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa）组成，图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。
使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态、发育和疾病发生中起着重要作用。
因此，准确、可靠地检测细胞凋亡是细胞生物学和生物医学研究中的重要课题。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，希望能为相关研究提供一些参考。
首先，细胞凋亡的形态学特征是细胞体积缩小、细胞核浓缩、细胞膜破裂和细胞内出现凋亡小体等。
因此，通过显微镜观察细胞形态变化是最直观的方法之一。
在实验中，可以使用荧光染料（如荧光素酶、荧光素酶底物等）标记细胞核和细胞膜，然后观察细胞形态的改变。
这种方法简单直观，但不够精确，需要结合其他方法进行验证。
其次，细胞凋亡过程中，细胞内的DNA发生断裂和片段化，产生特征性的DNA ladder。
因此，DNA ladder检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以通过DNA提取、电泳等技术，检测细胞内DNA的片段化情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较准确，但需要较多的细胞样本和专业的实验操作技术。
另外，细胞凋亡过程中，细胞膜上的磷脂会外翻，暴露磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面。
因此，PS外露检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用PS结合蛋白标记或荧光染料标记PS，然后通过流式细胞术或显微镜观察PS的表达情况。
这种方法对于凋亡细胞的检测比较灵敏，但需要较为昂贵的试剂和设备。
最后，细胞凋亡过程中，细胞内的一些蛋白酶活性会发生改变，如半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活化。
因此，caspase活性检测是一种常用的细胞凋亡检测方法。
实验中，可以使用荧光染料标记caspase活性底物，然后通过荧光显微镜或流式细胞仪检测caspase的活化情况。
这种方法可以直接反映细胞内凋亡信号通路的活性，但需要较为复杂的实验操作和数据分析。
综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，各有优缺点。
在实际研究中，可以根据具体的研究目的和条件选择合适的方法进行细胞凋亡检测。
希望本文介绍的方法能够为相关研究提供一些帮助，推动细胞凋亡机制的深入研究，为疾病的防治提供新的思路和方法。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
简述细胞凋亡的检测方法
简述细胞凋亡的检测方法
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细胞凋亡检测方法简述如下：
①形态学检测：利用光学显微镜、荧光显微镜乃至透射电子显微镜观察细胞形态变化，如细胞收缩、核染色质浓缩等。
②Annexin V标记：利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸特异性结合的特性，荧光标记的Annexin V可检测早期凋亡细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸，结合PI可区分早晚期凋亡与坏死细胞。
③TUNEL染色法：检测细胞DNA断裂情况，通过标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的DNA缺口，荧光显微镜下观察凋亡细胞的DNA片段化。
④Hoechst染色：使用荧光染料如Hoechst 33342染色细胞核，观察凋亡细胞核形态的改变，如浓缩、碎裂。
⑤DNA Ladder电泳：提取细胞DNA进行凝胶电泳，凋亡细胞DNA呈现特征性的梯状条带，反映DNA在核小体间的特定位置断裂。
AOEB双荧光染色法检测细胞凋亡
AOEB双荧光染⾊法检测细胞凋亡悬浮细胞AO/EB双染步骤
1.调整细胞密度为106/ml，将细胞种⾄6孔板，每孔2ml细胞；
2.向每孔加⼊相应浓度药物，培养⾄不同时间点；
3. 1000转/min离⼼10min收集细胞，PBS洗涤1次；
4. PBS重悬细胞，使悬浮细胞浓度达106/L左右；
5.取100µl受检细胞悬液，各加5µl AO和EB；
6.取上述染⾊液⼀滴，滴在洁净玻⽚上，加盖玻⽚后⽴即置荧光显微镜下观察。
注：
1. AO/EB染料配制：精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品 )各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中，使之配
成100µg/ml的储备液， 4℃保存，⽤前等量混合；
2.可以省略上述步骤3、4，以避免离⼼造成细胞物理性损伤，直接取细胞悬液加AO/EB孵育观察；
3. AO/EB有毒，可致癌，注意保护；
4.上述⽅法只适⽤于悬浮细胞，如果是贴壁细胞，可以考虑爬⽚，或者在培养板中直接染⾊，或者⽤胰酶消化后，按悬浮
细胞⽅法操作；
5. AO/EB虽然可以初步计算凋亡率，但是过于主观，最好采⽤Annexin V FITC/PI双标法进⾏定量；
6. Annexin V FITC/PI双标法对于早期凋亡⽐较敏感，因此可以先通过AO/EB形态学⽅法，摸索药物⼲预后开始出现凋亡的
时间，以确定合适的药物⼲预时间，进⾏Annexin V标记。
细胞凋亡的形态学检测1
荧光显微镜下检测细胞凋亡作者：2010级生物技术许春燕摘要：细胞凋亡是生命科学目前的一个研究热点．检测细胞凋亡的方法和技术取得了很大的进步．从早期细胞内某些基因转录表达的变化、代谢生理的变化，到晚期细胞形态的确诊、细胞内代谢物质的转变，从定性、定量到原位定性定量等，都发展了相对成熟的检测技术．相比于其他检测方法，荧光染色法检测细胞凋亡具有经济、快速、敏感等特点。
关键词：细胞凋亡荧光显微镜观察法正文：下面是荧光显微镜下检测细胞凋亡的四种方法：1、吖啶橙染色法用吖啶橙溴化乙锭混合染色法。
吖啶橙对DNA有特异的亲和力。
结果判定。
荧光显微镜下，可见到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色荧光，胞质呈橘黄色或者橘红色荧光，出现凋亡细胞时，核染色质的黄绿色荧光浓聚在核膜内侧，凋亡细胞核的特征性形态可被清晰地辨认。
坏死细胞的细胞质内黄绿色或者橘黄色荧光减弱，有的甚至消失。
具体方法如下：（1）．制备活细胞悬液，浓度约为107/ml。
（2）．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。
（3）．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
（4）．荧光显微镜选用激发滤片BG 12或BV等，阻断滤片用515nm 或。
对体外培养的活细胞经荧光素处理后，可在荧光显微镜下直接观察细胞形态的改变．结果；用吖啶橙染色后正常细胞核DNA呈黄色或黄绿色的均匀荧光，细胞质和核仁的RNA呈桔黄或桔红色荧光；凋亡细胞的细胞核或细胞质内有致密浓染的黄绿色荧光，甚至有黄绿色碎片；坏死细胞的细胞质内的荧光较弱或无。
2、Hoechst33258染色法Hoechst33258能够穿过完整的细胞膜，所以可以用来染活细胞，在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。
在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。
具体方法如下：（1）．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
（2）．细胞固定液4℃固定5min。
（3）．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。
通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。
此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。
如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。
需结合其它的方法来检测细胞凋亡。
)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
细胞凋亡测定_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
细胞凋亡检测方法和实验标准
细胞凋亡检测方法和实验标准常用的细胞凋亡检测方法1. DNA片段化检测DNA片段化是细胞凋亡的一个明显特征。
常用的DNA片段化检测方法包括：- 凝胶电泳：将凋亡细胞的DNA提取出来，通过凝胶电泳可以观察到DNA片段化的特征。
- TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP接头标记）：使用TUNEL试剂可以标记凋亡细胞的DNA断裂端，通过显微镜观察可以检测到凋亡细胞的存在。
2. 细胞色素c释放检测细胞凋亡时，线粒体内的细胞色素c会释放出来。
常用的细胞色素c释放检测方法包括：- 免疫荧光染色：使用特定抗体标记细胞色素c，通过荧光显微镜观察可以检测到细胞色素c的释放情况。
- Western blotting：使用特定抗体检测细胞色素c的蛋白表达水平，可以间接判断细胞色素c的释放。
3. 细胞内和细胞外凋亡标志物检测细胞凋亡过程中会产生一些特定的标志物，可以用于凋亡检测。
常用的细胞内和细胞外凋亡标志物包括：- 单克隆抗体检测：使用特定抗体识别和检测细胞内和细胞外的凋亡相关标志物，如凋亡相关蛋白、凋亡相关受体等。
- 酶标记法：利用特定的酶标记物标记凋亡相关标志物，通过酶标仪测量酶的活性来判断凋亡的发生。
实验标准为了保证细胞凋亡检测的可靠性和精确性，在进行实验时应遵守以下标准：1. 样本准备：样本的准备应严格遵循实验方案，包括细胞培养、药物处理、提取样本等步骤。
同时，应采用质量控制措施，确保样本的一致性和可比性。
2. 试剂选择：选择具有高灵敏度和特异性的试剂，确保能够准确检测细胞凋亡的发生。
3. 方法验证：在进行细胞凋亡检测之前，应先进行方法验证和优化，确保所选择的方法可以准确、可重复地检测细胞凋亡。
4. 阳性和阴性对照：在每个实验中都应包括阳性和阴性对照，以确认实验结果的准确性和可靠性。
5. 数据分析：对实验结果进行准确的数据分析和统计处理，确保结果的可解释性和可靠性。
6. 结果报告：结果应准确、清晰地呈现，包括实验方法、样本信息、数据分析和统计结果等信息。
心肌细胞凋亡tcc法
心肌细胞凋亡tcc法心肌细胞凋亡TCC法是一种用于检测心肌细胞凋亡的方法，TCC（Terminal DeoxynucleotidylTransferase-mediated dUTP Nick End Labeling）法又称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法，是一种检测细胞凋亡的常用方法。
心肌细胞凋亡TCC法的基本原理是利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）将带有荧光标记的dUTP连接到凋亡细胞DNA链的3'-OH末端，形成多聚核苷酸尾，从而可以在荧光显微镜下观察到凋亡细胞。
这种方法具有高灵敏度和特异性，可以检测到单个凋亡细胞，并且可以在细胞悬液、组织切片等多种样本中进行检测。
在心肌细胞凋亡TCC法中，首先需要收集心肌细胞样本，并进行固定和透化处理，以便让TdT酶能够进入细胞内与DNA 链结合。
然后，将带有荧光标记的dUTP和TdT酶混合后加入到样本中，进行孵育反应。
在反应过程中，TdT酶会将带有荧光标记的dUTP连接到凋亡细胞DNA链的3'-OH末端，形成多聚核苷酸尾。
最后，通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，即可检测到凋亡细胞。
心肌细胞凋亡TCC法在心肌病、心肌梗死等心血管疾病的研究中具有重要的应用价值。
通过检测心肌细胞凋亡情况，可以了解心肌损伤的程度和机制，为疾病的预防和治疗提供重要的参考依据。
同时，该方法还可以用于评估药物对心肌细胞凋亡的影响，为药物研发和治疗方案的优化提供重要的实验手段。
请注意，心肌细胞凋亡TCC法虽然具有高灵敏度和特异性，但也存在一定的局限性。
例如，该方法只能检测到凋亡细胞，而不能区分坏死细胞和其他类型的细胞死亡。
因此，在实际应用中，需要结合其他方法和技术进行综合分析和判断。
此外，该方法还需要一定的实验操作技能和经验，以确保结果的准确性和可靠性。
细胞凋亡途径实验报告
细胞凋亡途径实验报告一、引言细胞凋亡（apoptosis）是一种重要的细胞死亡方式，对于维持组织与器官的正常发育和功能起着关键作用。
在细胞凋亡过程中，多种调控因子和途径参与其中，包括外源性凋亡途径和内源性凋亡途径。
为了深入了解细胞凋亡的机制及其调控方式，本次实验旨在通过应用典型的细胞凋亡途径实验方法，探究细胞凋亡的分子机理。
二、材料与方法1. 细胞系：本实验使用人类肺癌细胞株A549；2. 细胞培养基：DMEM培养基；3. 细胞处理试剂：Apo-BrdU TUNEL试剂盒（用于检测细胞凋亡指标DNA断裂）；4. 荧光显微镜：用于观察荧光标记的细胞；5. 细胞培养器具：含培养皿、离心管、培养瓶等。
三、实验步骤1. 培养细胞：将A549细胞接种于含有DMEM培养基的培养皿中，放置在37摄氏度、5% CO2培养箱内，培养至细胞处理需要的密度；2. 细胞处理：使用指定浓度的药物（如化学药物或生物试剂）处理A549细胞，不同药物处理组设有对照组；3. 细胞凋亡检测：使用Apo-BrdU TUNEL试剂盒，按照生产商指南进行操作，检测细胞内DNA断裂的程度；4. 获得结果：使用荧光显微镜观察处理后的细胞，记录并存储图像；5. 数据分析：根据实验结果，进行统计学分析和绘图。
四、结果与讨论1. 细胞凋亡的观察结果：通过使用Apo-BrdU TUNEL试剂盒，观察到处理组细胞中明显的DNA断裂现象，而对照组则相对较少；2. 细胞凋亡比较分析：对不同处理组的细胞进行统计学分析，得出细胞凋亡率的比较结果；3. 讨论细胞凋亡的调控机制：根据实验结果和已有研究，讨论细胞凋亡途径中的关键分子和信号通路。
五、结论通过本实验的细胞凋亡路径研究，我们得出了以下结论：1. 细胞凋亡途径在A549细胞中能够被有效触发，导致DNA断裂；2. 细胞凋亡途径中的关键分子和信号通路起到调控细胞凋亡的重要作用。
六、进一步研究建议基于本次实验结果，我们提出以下进一步研究的建议：1. 探究细胞凋亡途径与肿瘤发生发展的关系；2. 研究细胞凋亡途径的调控因子在治疗肿瘤等疾病方面的应用潜力。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（ph osphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin -Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、P E）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×） 60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。
2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心103．重复步骤2两次。
(整理)常用细胞凋亡检测方法(图)
常用细胞凋亡检测方法（图）一、细胞凋亡的形态学检测1、光学显微镜和倒置显微镜①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3、透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。
细胞凋亡 凋亡小体检测
细胞凋亡凋亡小体检测细胞凋亡指的是细胞主动发生程序性死亡的过程。
它是维持机体正常生长发育和组织稳态平衡的重要方式之一。
凋亡可以通过多种途径进行，其中一种重要的途径是形成凋亡小体。
凋亡小体是指在细胞凋亡过程中形成的特殊的细胞结构，也被称为细胞死亡小体。
它由细胞质中的一系列蛋白质组成，包括凋亡诱导因子、执行凋亡过程的蛋白酶和结构蛋白。
凋亡小体的形成是细胞凋亡的标志之一，可以通过多种实验方法进行检测。
目前常用的方法包括电镜观察、DNA凝胶电泳、荧光显微镜观察等。
其中，电镜观察是一种直接观察凋亡小体结构的方法。
通过电镜观察，可以清晰地看到细胞凋亡发生时形成的典型凋亡小体结构，包括致密的核状结构、细胞质内出现的小体等。
另外，DNA凝胶电泳也是一种常用的检测凋亡小体的方法。
在DNA凋亡过程中，细胞核内的DNA发生断裂和降解，形成典型的DNA片段，并在电泳时表现为一系列明显的特征条带。
荧光显微镜观察是一种比较常用的方法，可以通过染色和标记技术直接观察细胞凋亡小体。
例如，可以使用荧光DNA染料如4’,6-Diamidino-2-Phenylindole （DAPI）对细胞进行染色，凋亡小体会呈现出明亮的蓝色荧光。
此外，也可以使用特异性凋亡标记物如caspase-3蛋白的荧光标记来检测凋亡小体的形成。
在凋亡过程中，激活的caspase-3会积聚在细胞内形成凋亡小体，并发出荧光信号。
除了上述的直接观察方法外，还可以通过流式细胞术、Western blot等间接方法来检测凋亡小体。
流式细胞术是一种通过细胞上特定标记物的表达情况来间接判断凋亡小体形成的方法。
例如，可以使用荧光标记的抗凋亡标记物如Annexin V和propidium iodide（PI）来标记凋亡细胞，然后通过流式细胞术对凋亡细胞进行定量分析。
Western blot是一种通过检测特定蛋白质的表达水平来间接判断凋亡小体形成的方法。
例如，可以检测caspase家族蛋白的表达，特别是caspase-3的激活程度，来判断细胞是否存在凋亡小体形成。
细胞凋亡检测实验总结
细胞凋亡检测实验总结1.1 AnnexinV/PI双染色法磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将AnnexinV进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶（propidineiodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
实验方法：XXX细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液。
用孵育缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min。
用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
1000r/min 离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
细胞凋亡 凋亡小体检测
细胞凋亡凋亡小体检测细胞凋亡：凋亡小体检测细胞凋亡（apoptosis）是一种程序性细胞死亡形式，它在维持机体正常发育、维护组织稳态以及免疫应答等过程中起到重要作用。
凋亡小体（apoptotic bodies）是细胞凋亡的标志物之一，其检测是研究细胞凋亡机制的重要手段。
一、凋亡小体的形成过程细胞凋亡是一个高度规范化的过程，可分为三个主要阶段：收缩期、核碎裂期和凝固期。
在收缩期，细胞体积缩小、细胞核发生凝缩和DNA切割。
在核碎裂期，细胞核DNA发生断裂，形成典型的DNA断裂片段。
在凝固期，细胞表面形成凋亡小体，包括孔洞结构和细胞膜残骸。
二、凋亡小体检测方法1. 相差干涉显微镜观察可以通过相差干涉显微镜观察凋亡小体的形态特点。
凋亡小体通常呈圆形或椭圆形，内部结构明显可见。
2. 荧光显微镜观察荧光染色技术是广泛应用的凋亡小体检测方法之一。
利用DNA结合染料，如荧光素磷酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）或乳香红酸盐（propidium iodide，PI）等，可对凋亡小体进行染色，观察其形态和分布情况。
3. 流式细胞术检测流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，可用于凋亡小体检测。
在流式细胞仪中，通过染色标记，利用细胞大小和复杂度参数识别凋亡小体，进一步进行数量和形态分析。
4. 电子显微镜观察电子显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可直接观察细胞中的凋亡小体。
通过电镜技术，可以观察到凋亡小体的细胞器残留结构和表面形态。
5. 其他检测方法除了上述几种常用的凋亡小体检测方法外，还有一些其他技术可以用于凋亡小体的检测。
如DNA断裂末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）可以标记DNA断裂片段；凋亡小体标记法（apoptotic bodies labeling）可以利用特定抗体对凋亡小体进行标记，进而进行分析。
常用细胞凋亡检测方法
常用细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种基本的细胞程序性死亡过程，对于维护正常组织结构和功能发挥重要作用。
因此，准确检测凋亡是研究细胞生物学、药物作用以及疾病发生机制的关键。
以下是几种常用的细胞凋亡检测方法。
1.同步体细胞凋亡分析法同步体细胞凋亡分析法基于DNA片段化的原理，通过载荷量测定等手段评估细胞死亡。
其中，凝胶电泳法可以评估DNA的片段化，而在DNA降解过程中也会释放核酸碱基和低分子量的寡糖，可以通过典型的化学制剂检测其蓄积量。
2.DAPI染色法4',6-二胺-2-苯并咪唑（DAPI）是一种DNA特异性荧光染料，它可以与DNA结合并发射蓝色荧光。
细胞凋亡时，DNA会发生片段化并形成形态特异的核质凝块，称为凝胶体(GC)。
DAPI染色后，健康细胞呈现规则形状的核，而凋亡细胞则呈现出碎裂的DNA染色残基。
3.DNA碎片检测法DNA碎片检测法利用凋亡细胞释放到细胞外的DNA碎片，通过测量DNA浓度的改变以评估细胞凋亡。
可以通过比色法、荧光染料测量或特定酶的检测来定量DNA。
4. Annexin V-PI（propidium iodide）双荧光染色法Annexin V是一种能够选择性结合凋亡细胞的磷脂。
同时，PI可以穿透受损的细胞膜并与细胞核DNA结合。
所以，通过联合使用这两种染料，可以区分正常细胞、凋亡细胞以及坏死细胞。
5. TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）法TUNEL法是一种特异的DNA断裂终端标记法，它能够用于检测细胞死亡领域的DNA片段化。
具体而言，该方法依赖于终端脱氧核苷酸转移酶（TdT），它能够与DNA链上的未配对的碱基发生共价连接。
通过在DNA 链的断裂末端引入二脱氧尿嘧啶三磷酸（dUTP），再使用碱性棕榈酸蓝（APB）进行染色，TUNEL法可以在荧光显微镜下检测出碎片化的DNA。
细胞凋亡 凋亡小体检测
细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，通常包括细胞收缩、核形态改变、染色质凝聚和最终形成凋亡小体等特征。
检测凋亡小体是判断细胞是否正在经历凋亡的一种方法。
以下是一些常用于凋亡小体检测的技术：
1. 荧光显微镜观察：可以使用荧光染色剂，如荧光显微镜观察凋亡小体的形成。
例如，使用DNA染色剂，如DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）或者荧光标记的DNA结合染料，如Hoechst 33342，可以用来观察细胞核的变化。
2. 流式细胞仪：流式细胞仪是一种用于分析细胞的工具，可以通过流式细胞仪测定荧光标记的凋亡小体。
一些可用于凋亡小体检测的标记物包括荧光标记的DNA结合染料和特定的抗体。
3. 电镜观察：透射电镜可以提供高分辨率的图像，用于观察凋亡小体的超微结构。
这对于详细研究细胞内部的变化非常有用。
4. 凋亡小体DNA片段检测：凋亡小体形成通常伴随着DNA的断裂。
通过凝胶电泳或PCR等技术，可以检测到凋亡小体中的DNA片段，这也是一种常见的凋亡检测方法。
5. TUNEL染色法：终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP辅助染色法（TUNEL）是一种用于检测DNA断裂的方法，可以通过荧光或酶标记观察。
选择适当的方法取决于实验的具体需求和可用的实验设备。
在实验设计和执行中，注意选择合适的控制组，确保结果的准确性。
细胞培养中的细胞凋亡检测技巧
细胞培养中的细胞凋亡检测技巧细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在细胞生物学研究中具有重要的意义。
细胞凋亡的检测对于了解细胞生物学过程、疾病发生机制以及药物筛选等方面都有着重要的应用价值。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡检测技巧。
一、荧光染料法荧光染料法是一种简单、快速且常用的细胞凋亡检测方法。
常用的荧光染料有荧光素酶染料、荧光素酶底物、乙锭溴化物（EB）、Hoechst染料等。
这些染料可以通过荧光显微镜观察到细胞凋亡的特征，如染色体凝聚、核形态改变等。
此外，还可以通过流式细胞术进行荧光染料的定量检测，得到更加准确的结果。
二、DNA断裂检测法DNA断裂是细胞凋亡的一个重要特征，因此可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。
目前常用的DNA断裂检测方法有单细胞凝胶电泳法（Comet assay）和TUNEL法。
单细胞凝胶电泳法通过检测DNA断裂后DNA片段在电泳过程中的迁移情况来判断细胞凋亡程度。
TUNEL法则是通过检测DNA断裂后的3'-OH末端与荧光标记的核苷酸发生连接反应来判断细胞凋亡。
三、蛋白质检测法细胞凋亡过程中，一些特定的蛋白质会发生变化，因此可以通过检测这些蛋白质的表达水平来判断细胞是否发生凋亡。
常用的蛋白质检测方法有Western blot和免疫组化。
通过这些方法可以检测凋亡相关蛋白如caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白等的表达水平，从而判断细胞凋亡的程度。
四、细胞形态观察法细胞凋亡过程中，细胞形态会发生明显的改变，如细胞体积缩小、细胞膜出现凹陷等。
因此，通过观察细胞形态的改变可以初步判断细胞是否发生凋亡。
这种方法简单易行，但是结果相对主观。
五、细胞周期分析法细胞凋亡与细胞周期密切相关，因此可以通过细胞周期的变化来间接判断细胞是否发生凋亡。
常用的细胞周期分析方法有流式细胞术和细胞核染色法。
通过这些方法可以检测细胞在不同周期的分布情况，从而判断细胞是否发生凋亡。
综上所述，细胞凋亡的检测方法多种多样，每种方法都有其优势和局限性。
荧光显微镜检测细胞凋亡
荧光显微镜检测细胞凋亡实验报告五（2015.5.27）荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染⾊）姓名：王亚斌班级：⽣物技术12（1）学号：2012332860026实验五：荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染⾊)⼀实验⽬的：1 了解荧光显微镜的构造并且学会使⽤荧光显微镜；2 通过荧光显微镜学会分析数据图⽚。
⼆实验原理：Hoechst 33258，分⼦式为C25H24N6O·3HCl，分⼦量为533.88, ⽔溶解度可达10mg/ml。
Hoechst 33258是⼀种可以穿透细胞膜的蓝⾊荧光染料，对细胞的毒性较低。
Hoechst 33258为特异性DNA染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经70%冷⼄醇固定的细胞可⽴即染⾊。
⽽活细胞的着⾊是渐进性的，在10min内可达饱和。
在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
三实验器材：1ml移液枪及枪头，荧光显微镜，培养贴壁细胞，PBS缓冲液，Hoechst 33258 染⾊液六孔板，培养箱四实验步骤和⽅法：1：加⼊适当量Hoechst 33258 染⾊液，注意必须充分覆盖住待染⾊样品。
通常六孔板加1ml/孔，96孔板加100µl/孔。
2：放⼊37°C培养箱中培养30min。
3：⼩⼼吸去染⾊液，⽤1ml PBS洗涤2-3次。
4 ：置于荧光显微镜下，选⽤340nm的激发光观察：在荧光显微镜下，活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎⽚被认为是凋亡细胞。
五实验结果防⼰诺林碱浓度为0uM 防⼰诺林碱浓度为2uM防⼰诺林碱浓度为2uM防⼰诺林碱浓度为4uM防⼰诺林碱浓度为6uM防⼰诺林碱浓度为8uM防⼰诺林碱浓度为10uM在上图可以看出，在防⼰诺林碱浓度为2um/ml的时候出现了染致密的颗粒块状荧光，也就是说在这个浓度下，细胞开始放⽣了凋亡，⽽且，在不断提⾼防⼰诺林碱浓度的情况下，视野⾥的凋亡细胞开始变多了，⽽且凋亡细胞数⽬要多于活细胞数⽬。
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实验报告五（2015.5.27）
荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色）
姓名：王亚斌 班级：生物技术12（1） 学号：2012332860026
实验五：荧光显微镜检测细胞凋亡（Hoechst 33258 染色)
一 实验目的：
1 了解荧光显微镜的构造并且学会使用荧光显微镜；
2 通过荧光显微镜学会分析数据图片。
二 实验原理：
Hoechst 33258，分子式为C25H24N6O ·3HCl ，分子量为533.88, 水溶解度可达10mg/ml 。
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。
Hoechst 33258为特异性DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经70%冷乙醇固定的细胞可立即染色。
而活细胞的着色是渐进性的，在10min 内可达饱和。
在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
三 实验器材：
1ml 移液枪及枪头，荧光显微镜，培养贴壁细胞，PBS 缓冲液，Hoechst 33258 染色液 六孔板，培养箱
四 实验步骤和方法：
1：加入适当量Hoechst 33258 染色液，注意必须充分覆盖住待染色样品。
通常六孔板加1ml/孔，96孔板加100μl/孔。
2：放入37°C 培养箱中培养30min 。
3：小心吸去染色液，用1ml PBS 洗涤2-3次。
4 ：置于荧光显微镜下，选用340nm 的激发光观察：在荧光显微镜下，活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
如果见到3个或3个以上的DNA 荧光碎片被认为是凋亡细胞。
五 实验结果
成绩 优秀 良好 中等 及格 不及格
防己诺林碱浓度为0uM 防己诺林碱浓度为2uM
防己诺林碱浓度为2uM防己诺林碱浓度为4uM
防己诺林碱浓度为6uM
防己诺林碱浓度为8uM
防己诺林碱浓度为10uM
在上图可以看出，在防己诺林碱浓度为2um/ml的时候出现了染致密的颗粒块状荧光，也就是说在这个浓度下，细胞开始放生了凋亡，而且，在不断提高防己诺林碱浓度的情况下，视野里的凋亡细胞开始变多了，而且凋亡细胞数目要多于活细胞数目。
六．分析与讨论
在荧光显微镜下，用340nm的激发光观察活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。
如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞，图中，随着防己诺林碱浓度的升高，凋亡细胞数目逐渐增多，当浓度在10um/ml 的时候，视野中几乎看不到有活细胞的存在，可以说，在这个浓度下，抑制细胞数目增殖的作用是最强的。