表达载体
基因表达载体的主要构成原件及作用
表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体。
表达载体的主要构成元件及作用为: (1)结构基因:即提取的目的基因核苷酸序列,负责编码目标蛋白。
(2)启动子:位于编码蛋白质结构基因前的一段特殊结构的DNA片段,是RNA聚合酶的识别部位和结合部位。
(3)终止子:位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊结构的DNA片段,具有终止基因转录过程的作用。
(4)复制原点:能够自我复制保证目的基因在受体细胞中复制遗传和表达。
(5)遗传标记基因:检测受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
表达载体的五个基本元件
表达载体的五个基本元件
表达载体是一个完全有效的信息传输系统，它借助五个基本元件（表达者、调节者、受众、时间和地点）来传输和接收信息。
表达载
体的复合体帮助收发信息的正常流程。
首先，表达者一般是消息发布者，它可以是一个个体，也可以是
一个团体。
表达者用自己的力量，通过不同的载体、渠道、工具和设备，把消息发给受众。
其次，调节者负责表达载体中信息的筛选、过滤、加工和编辑，
以便确保消息的内容和形式是恰当的。
调节者的作用是保证信息的传
播和公正性。
第三，受众是该信息最终的目的地，是这种传播行为的接受者。
受众接收传播的信息，对消息的内容做出反应，这可以是肯定、否定，或者介于两者之间。
第四，时间是传播过程中的一个重要元素，涉及到发布消息的时
间和受众接收消息的时间。
时间是形成可控制的环境的重要因素，也
是信息传播的重要因素。
最后，地点决定了受众的接收范围和影响范围，这取决于传播的场所和目的地，以及消息传递的距离和范围。
这反过来又决定着接收者的地理位置，以有效地传播消息，它必须考虑到地点因素。
五个基本元件组成的表达载体可以有效地传播和接收信息，并进行双向交流活动，使一方用以表达思想与意见，另一方便于了解表达者的意思。
传播过程中，受众通过表达者的主观信息，结合表达载体的五个基本元件，理解和了解信息的内容。
由此可见，表达载体的作用是至关重要的。
基因治疗中的表达载体构建与优化方法
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
表达载体的基本条件
表达载体的基本条件
表达载体是指用于传达信息的媒介，例如文字、语言、图像等。
它们必须具备一定的基本条件，才能有效地传递信息：
1. 准确性：表达载体所传递的信息必须准确无误，不能有歧义或误导。
2. 清晰度：表达载体的语言、文字、图像等应该清晰易懂，以便读者或听者能够理解。
3. 适当性：表达载体的形式和内容应该与受众的需求和背景相适应，以达到最佳传达效果。
4. 合适性：表达载体的形式和内容应该与信息的性质和目的相匹配，以达到最佳传达效果。
5. 有效性：表达载体应该能够引起读者或听者的兴趣，激发其思考和反应，以达到最佳传达效果。
以上是表达载体的基本条件，只有具备这些条件，才能达到有效的传达效果。
- 1 -。
表达载体的构建注意事项
表达载体的构建注意事项构建载体是一项重要的任务，它决定了信息传递的质量和效果。
在进行载体构建时，我们需要注意以下几点：1. 独特性：确保文章内容的独一性，避免内容重复出现。
这样可以让读者获得新鲜感，并更好地吸引他们的注意力。
2. 结构合理：为了增强阅读流畅性，我们需要合理安排文章的结构。
可以使用适当的标题来划分段落，使内容更加清晰明了。
3. 避免网络地址：在文章中不得插入任何网络地址，以确保文章的纯文本性质。
这样可以避免读者在阅读过程中被打断或分心。
4. 避免数学公式和计算公式：文章中不应包含数学公式或计算公式。
这些公式对于非专业读者来说可能会造成困扰，降低文章的可读性。
5. 避免使用图片链接：不得使用、插入任何形式的图片链接。
这样可以避免读者在阅读过程中需要打开链接或依赖图像来理解文章的内容。
6. 避免依赖图像的语句：避免使用依赖图像的语句，如“如图所示”等字眼。
这样可以避免读者对文章内容的误解或困惑。
7. 避免重复问题：不得在文章中反复提出同一个问题。
这样可以避免读者产生厌烦或对文章内容产生疑惑。
8. 简洁自然：文章应该尽量简洁自然，避免过多的自我介绍。
这样可以让读者更加专注于文章的主题和内容。
9. 流畅表达：文章应刻画明确，句式流畅，并使用丰富多样的词汇来表达。
这样可以增加文章的可读性和吸引力。
10. 中文描述：请尽可能使用准确的中文进行描述，避免使用拗口或错误的词汇和表达方式。
11. 准确无误：确保文章内容的准确无误，严肃认真。
避免使用歧义或误导的信息，以免给读者带来困惑或误解。
通过以上注意事项，我们可以以人类的视角来构建载体，使文章富有情感，并使读者感到仿佛是真人在叙述。
同时，我们也要确保文章的自然度和流畅度，避免让读者感觉像机器生成的内容。
这样可以提高文章的质量和吸引力，让读者更加愿意阅读和理解。
几种表达载体
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTT TTTTCC….GCTAG CAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
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热诱导
T7 RNA 聚合酶
PL 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
cI857
双质粒系统
一 个 质 粒 带 有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带 有 T7 启动子和目的基因
两个质粒的复制子和抗 性标记不能相同，调控方式 为控制 T7 RNA 聚合酶的启 动子调控类型
ColE1 ori
AmpR
T7 启动子
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四、 表达产物的纯化
1、包涵体蛋白的纯化
通过机械法、超声波处理等方法破碎外源蛋白的细胞 → 离心 → 获得包涵体 → 洗涤 → 去除包涵体结合的 细胞蛋白→ 利用盐酸胍、尿素和SDS等溶解包涵体 → 蛋白质重新折叠
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2、可溶性蛋白的纯化
融合蛋白的表达标签可用于分离纯化目的蛋白
分泌表达载体也有助于分离纯化可溶性的表达产 物。
阻抑转录，高温(40-45℃)下解除抑制。 T7噬菌体启动子：较复杂
12
二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强 的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建 的表达系统称为 T7 表达系统。
13
T7 表达系统
T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活 T7噬菌体启动子的转录。
，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。
2
3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何
保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。
措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列
3
4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别
pGEX-1T—凝血酶 pGEX-2T---凝血酶 pGEX-3T---X因子
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2、组氨酸标签表达载体：如Novagen公司的pET系 列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的 标签和Xa因子酶切位点，多聚组氨酸能与镍等二 价金属离子结合，纯化目的蛋白，用Xa因子处理 可得到纯的目的蛋白。
大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架
基因克隆表达系统成熟完善
繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工
程受体生物
7
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
T7 启动子
目的基因
T7 RNA 聚合酶
？启动子 T7 RNA 聚合酶基因
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化学诱导型
噬菌体 DE3 是λ噬菌体
的衍生株，一段含有 lacI启
动子和T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其中。
用 噬 菌 体 DE3 的 溶 源 菌 作 为表达载体的宿主菌，调控方 式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。
在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒 导入表达系统，它能明显降低本底转录。
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三、表达融合蛋白的表达载体
表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故 通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 (3)产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝 胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切 下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。 (4)有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外， 这有助于蛋白质的分离和纯化。
E.Coli （DE3）
T7 启动子
目的基因
IPTG 诱导ຫໍສະໝຸດ T7 RNA 聚合酶lac 启动子 T7 RNA 聚合酶基因
温度诱导型
PL 启动子控制T7 RNA 聚
合酶基因，通过热诱导方式激 发T7 噬菌体启动子的转录。
E.Coli （CE6）
T7 启动子
目的基因
这种方式可以使本底转录 降到很低的水平，尤其适用于 表达对大肠杆菌宿主有毒性的 重组蛋白质。
4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙， 可避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠， 或去除N-端甲硫氨酸，以维护活性。
信号肽(signal peptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋 白质A信号肽（如Amersham公司的pEZZ18系统）。
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分泌型融合表达载体----pEZZ18
Plac：Lac启动子 Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动 子 S：蛋白A的信号肽序列 两个合成的Z功能域（结合免疫球 蛋白G，琼脂糖层析柱）
固定在琼脂糖树脂上
谷胱甘肽
形成亲和层析柱
表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱
融合蛋白吸附在树脂上
其他细胞蛋白被洗脱出来 融合蛋白被释放出来
获得纯化的目的蛋白
用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱 用凝血蛋白酶切割融合蛋白
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融合型载体----pGEX系列
位相载体 Ptac：IPTG诱导 GST融合蛋白—直接纯化 产物，切割方便：
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3、表达的控制
诱导表达系统：IPTG 防渗漏表达系统：lacIq，一种能产生过量的 LacI 阻
遏蛋白（阻遏转录过程）的 lacI 基因的突变体。 PL启动子受cⅠ基因（阻遏溶菌周期基因表达）产物
的抑制，在λ噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 cⅠ基因的温度敏感突变体cI857（ts）：低温(30℃)下
trc，都受IPTG诱导。 T7噬菌体启动子 λ噬菌体的PL启动子。
2）终止子：依赖于ρ因子或不依赖于ρ因子（遇茎环 结构而终止）。
3）核糖体结合位点(ribosome binding side, RBS)： 是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这 一序列来启动翻译过程。
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2、表达形式
表达载体构建的一般原则
1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的
基因本身必须置于正确的阅读框架之中。 用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接
头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。
1
2、启动子（关键因素） 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞
中高效表达的关键步骤之一。 因此，选择强的启动子及其相关的调控序列
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融合型表达载体
P
SD
Foreign DNA
融合型表达载体
融合基因
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技术关键：克隆基因可插入标签肽序列的3’或5’端， 但必须维持正确的ORF。
• 选择合适酶切位点 • 加人工合成的DNA接头 • 构建位相载体
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位相载体----含有3种读码框的系列载体
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常用的融合表达载体
1、GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶) 表 达 载 体 ： 如 Amersham 公 司 (阿莫仙医药公司) 的 pGEX 系 列，其GST来自于血吸虫，融合蛋白下保持酶学活性，对 谷胱苷肽有很强的结合能力，融合蛋白纯化出来后用凝血 蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。
选择性降解
（2）构建成可分泌的蛋白：不是所有的外源蛋白都可 以通过基因操作成为可分泌蛋白。
（3）使外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
5
总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选 择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的 一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元 件。
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第一节 大肠杆菌表达载体
T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠 杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被 大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
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T7 表达系统转录调控的机理
T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统
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一、大肠杆菌表达载体的结构
原核表达载体：适用于在原核细胞中表达 外源基因的载体。
均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的 基本要求，然后增加表达元件。
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1、表达元件(expression elements)
1）启动子(promoter)：三类，即 lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或
mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。
5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控
制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。 由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程 中，一般采用UAA作为终止码。
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6、外源蛋白的稳定性
可采取以下措施避免克隆的蛋白被选择性降解： （1）构建融合基因，产生融合蛋白，使外源蛋白不被
将2价重金属阳离子固定在树脂上，便可 对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。纯化 的融合蛋白再用Xa因子处理可去除标签多肽，从 而获得纯化的目的蛋白。
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3、内含肽表达载体(即蛋白质内含子,是存在于前 体蛋白质中的一段氨基酸序列) ： 如 NEB 公 司 的 Impact-Twin系统，将目的蛋白放在两个可自裂 解的内含肽(intein)中间，在得到融合蛋白以后 不通过蛋白酶消解、只需要调节pH值等条件就将 标签蛋白切除。
可溶性的表达产物一般可展现应有的蛋白质活性 。
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不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差 异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。
如70%的抗生素来源于放线菌，如以寻找抗菌抗 肿瘤活性物质为目标，选择链霉菌为宿主较理想 ，而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。
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目的基因
热诱导
T7 RNA 聚合酶