荧光分光光度法

3）Kc受环境因素的影响最为强烈， 主要影响是T。
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
应用范围与常用方法 3.优势
1.与UV异同点
1)构造与UV很相似. 属于分光光度法,光源.单色器等 2)组件的布置稍有不同 荧光采用激发光和发射光 成直角的直角光路., 3)原理也不一样.这在后面介绍
一态；
B .激发过程中自旋方向被倒转或改变了，
则为三重态； C.三重态的能量比相应的单一态高，但 能量差要低 .应该到三重态 .
D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒，
跃迁几率为单重态向单一态的 10-6。
3）振动驰豫 Vibratory Relaxation 溶质分子向溶剂转移过剩的振动能
吸收跃迁所需的时间很短 (10-15S)， 分子具有的几何形状及所处的环境还 来不及改变 ，可能发生两种变化
荧光发光的原理:
激发和发射过程 1.激发过程： ①基态：能量最低状态 S0 ②激发态:电子处于反键轨道上为激 发态
最有意义的为 π ?π *和n?π *过程
电子激发过程很快，10-15 S， 不稳定。
2.发射过程
当激发态在返回基态时，伴有光子 的辐射称为发光过程，又称发射过 程。
荧光和磷光均为此种光致发光 过程。(又称冷光)
4）荧光 Fluorescence
分子处于受激态的最低振动能 级后，变化之一发射光子回到基态 ---荧光
波长：荧光光谱>吸收光谱
量子效率 φ : 受激单一态的寿命在 10-9~10-7 ，若无其他竞争，则全部 受激分子发射荧光，φ =1；
实际有竞争，0---1之间
5）内转换:
(IC)Inter Crossing
①直接从激发回到基态（发射光子） 10-9~10-7S ②发射辐射前改变振动能级.
10-11~10-13S
溶质分子向溶剂转移过剩的振动能 而发生的分子驰豫是相当快的，在 10-11~10-13S 就能无辐射而降落到 受激态最低振动能级，因为快，所 以溶液中分子快速振动驰豫后，光 子发射总是由受激态的最低振动能 级发生的。
1）单一态 激发过程中,当S=0时为单一态. ①S原子光谱谱项符号量子数 S 的 2S+1表示谱项的多重性， ②自旋量子数ms（电子） 可取值只有± 1/2（即顺旋或反旋） ③自旋的两种状态: 当自旋配对时.S=0，不配对则S=1
2）三重态. S=1则2S+1=3
A.跃迁时通常自旋不变，即单一态 ? 单
总结:原理2步 ①激发λ ex, ②发射λ em,发时竞争
(jablonskii)杰不朗斯基的图解
三.量子效率:(在定量计算先讨论 Ф)
? 影响发生的因素总的是内交换.(IC 和ISC)。衡量发生的效率如何前已 提到，以量子效率Ф 来判断；数值 在0—1。其公式为
? 公式 Ф=
kf
kf ? kc ? kx
Kf大小影响Ф f的大小
3.影响k的因素:
1）Kf为最低受激单一态与基态之间 跃迁几率大小的量度。
Δ ε max(摩尔吸光系数)
当ε max变小时.可预期Kf也相应变小； π ?π *吸收带的ε max大于n?π *, 大约大10倍. ∴π ?π *的Kf远比后者大
2）Kx ISC的几率的大小强烈依赖单 一态和三重态之间的能量大小。能量 差愈小，则ISC几率大，Kx变大
A. 全部激发能转变为热 .而本身 回到基态 ,即受激单一态与基态 间转换，为低效率过程 ;
B. 受激单一态间 (能量不同的单 一态 )的内转换则为多得多的几 率过程.(主要）
6）系内转换(ISC)
ISC:单一态与三重态间的转换
对三重态布居粒子的高效途径 是与回到基态发生争夺。
状态的改变是禁戒的，但发射 光子回到基态需要 10-9--10-7S, 而内交换只需 10-13S,比发射光 子的时间更短.所以系内交换可 与荧光发射进行竞争。
? k：为速率常数,竞争由时间的快慢 起重要作用,因此以其各影响因素的 速率常数体现.
?
Hale Waihona Puke fФ= k f ? k c ? k x
Kf:荧光发生过程 Kx: 系内交联的ISC过程
Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失 过程或讲将其激发能转变为热能过程的 IC过程。
Kf>>Kc和Kx Ф f-?1， Kc或Kx>> Kf 则Ф f-?0 无荧光
实际从激发态回到基态过程充 满竞争。
(jablonskii) 杰不朗斯基的图解
S: 基态 S*激发态 S0、基态 F :荧光 P:磷光 S1:为单一态的低能级 T: 三重态Three VR:振动驰豫Vibratory Relaxation 内转换 ： Inter Crossing 系内转换：
Inter System Crossing