PCR-RFLP基因分型方法
江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究
ＡＢＳ ＴＲＡＣ Ｔｈ ｉ ｏ ｈ ｔ ｄ ｏａ ａｙ ｅｔｅｈ ｍｏｏ ｙｏ Ｔ： ｅａｍ ｆｔ ｅｓｕ ｙｔ ｎ ｌｚ ｈ ｏ ｌｇ ｆ Ｅ．ｃ ｌ Ｏ１ ｓｒｉｓｆｏ ｓ ｖ ｒｌｒｇｏ ｓｏ ｎ ｓ ｒ ｖｎ ｅ ｏｉ ７ ｔａｎ ｒｍ ｅ ｅａ ｅ ｉｎ ｆ ｉ ｇ ｕｐ ｏ ｉｃ ５ Ｊａ
钱 慧敏 朱 叶飞 ， ， 董 晨 张平平。 朱凤 才 ， ，
摘 要 ： 目的 对 历 年 从 江 苏省 不 同地 区 分 离 的 肠 出血 性 大 肠 埃 希 菌 Ｏ１７ 以 下 简 称 ： ５ ） 行 分 型 分 析 。 方 法 采 ５（ Ｏ１７ 进 用 多聚 酶 链 反 应一 制 性 片 段 长 度 多态 性 分 析 （ Ｃ － Ｆ ） 法 对 １ ８株 ０ ５ 限 Ｐ ＲＲ Ｉ 方 Ｐ ０ １ ７分 子 分 型 ， 比较 不 同地 区 、 同年 份 菌 型 差 异 。 不 结 果 根 据 Ｅ ０ ｃＲＶ 限 制 性 酶 切 图谱 可 将 菌 株 分 成 Ｊ ０一Ｓ Ｏ十 个 不 同 的 型 别 。 主 要 菌 型 Ｊ０ 占 ６ ． ，Ｓ ２型 与 Ｊ Ｏ Ｓ １Ｊ ｌ Ｓ１ ４９ Ｊ０ Ｓ ｌ型 菌 株 酶 切 图谱 相 似 度 很 高 ，Ｓ ３和 Ｊ ０ Ｊ０ Ｓ ４型 菌 株 数 目较 少 （ ２株 ） 但 近 一 半 属 于 人 源 菌 株 。从 时 间方 面 看 ，９ ９年 分 离 的 菌 １ ， １９
肠 出血 性大 肠埃 希 菌 （Ｅ ｔｒｈ ｍｏｒ ａ ｉ Ｅｓ ｎ ｅｏ ｅ ｒｈ ｇｃ — ｃｅ ｉ ａｃｌ ， ＨＥ ）Ｏ１ ７ 上世 纪八 十 年代 在美 ｈ ｒｃ ｏｉ Ｅ ｈ Ｃ ５ 是
耳聋基因检测 - 2
遵循常染色体隐性遗传模式
在不同人群均具有显著的高发病率
临床表现：绝大多数为先天性重度、
极重度耳聋
2
常见的致聋基因及位点
GJB3基因特点
GJB3基因是我国本土克隆的第一个遗传疾病基因
临床症状主要与GJB3突变基因的外显度有关，表现为正 常听力、轻度耳聋、中度耳聋、重度耳聋及极重度耳聋等
荧光探针法 飞行时间质谱法
测序法
耳聋基因检测常用方法比较
方法
主要设备
检测时间 所需步骤
特点
DNA测序法
PCR仪，测序仪 ＞10H
核酸提取、PCR，金标准，操作繁琐，需
电泳、纯化、测 要专门培训，结果判读
序
复杂
限制性内切酶法 PCR仪，电泳仪 约4H ARMS-PCR法
基因芯片法
P扫C描R仪仪，杂交仪，约5H
荧光PCR法
PDS基因突变 检测 试剂盒
SLC26A4：IVS7-2A>G、1174A>T、、 1229C>T、2168A>G ；
检测位点 （10个）
通量低
厦门致善
GJB2:35delG、167delT、176-
191del16、235delC、299-300delAT
； GJB3：538C>T、547G>A；
12SrRNA：1494C>T、1555A>G；
微阵列 芯片法
微阵列 芯片法
优缺点
检测位点少 （9个） 专用仪器 价格高 耗时长
检测位点 （15个） 专用仪器
价格高 耗时长
凯普
GJB2:35delG、176-191del16、235delC、299-
耳聋易感基因检测 试剂盒
临床免疫学MHC与HLA检测及应用
第二十一章MHC与HLA检测及应用本章要点1.MHC的一般特性2.HLA分型3.HLA分型的实际应用组织相容性是指器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，如相容则不互相排斥，不相容就会出现排斥反应。
诱导同种移植排斥反应的抗原称为组织相容性抗原，也称为移植抗原。
一组对人和各种哺乳动物中诱导排斥反应起决定性作用的抗原称为主要组织相容性抗原（MHA）。
控制主要组织相容性系统（MHS）的基因包括几个不同位点，集中分布于各种动物某对染色体上的特定区域，，是一组紧密连锁的基因群，这组基因群称为主要组织相容性复合体（MHC）。
第一节MHC的一般特性概念：主要组织相容性复合体（MHC）是一组存在于各种脊椎动物某对染色体特定区域的基因。
MHC编码的基因产物为主要组织相容性抗原（MHA）。
人类的MHC即HLA基因复合体位于人的第6对染色体的短臂上，是目前已知最复杂的人类基因系统。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类基因。
HLA由400万碱基组成，传统上分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类基因。
Ⅰ类：包括经典的HLA-A、B、C，非经典的HLA-E、F、G、H、X等；Ⅱ类：包括经典的HLA-DP、DQ、DR，非典型的HLA-DN、D0、DM等；Ⅲ类：位于HLA-Ⅰ、Ⅱ类之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因组成。
截止到l999年，已知的HLA等位基因数已超过l000个，且数量仍在继续增加。
HLA基因复合体所表达的基因产物，除直接构成同种异体移植排斥反应的靶抗原外，在免疫应答的过程中发挥着重要调控作用，也反映着自身免疫性疾病的基因易感性。
一、MHC-Ⅰ类分子MHC-Ⅰ类抗原是一组由非共价键连接的异二聚体分子，在人类包括HLA-A、B、C、HLA-E、F、G、H、X 等。
Ⅰ类分子可广泛地表达于各种组织的有核细胞上，以淋巴细胞、白细胞表面的表达密度最高，肝、肾、皮肤、主动脉和肌细胞次之，成熟的红细胞、神经细胞及滋养层细胞不表达。
血清与其他体液中少量存在。
genotyping原理
genotyping原理基因型(genotype)是指个体或生物体其中一种特定基因的种类或基因组合。
通过对一些生物的基因进行分析，可以确定其基因型，进而了解其遗传特征和相关性状。
基因型分析在遗传学研究、医学诊断和生物技术应用中具有重要的意义。
基因型分析的方法有很多种，其中最常见的是基于DNA序列的分子生物学方法。
基因型分析的原理主要包括DNA提取、基因放大、基因分型和数据分析等步骤。
首先，需要对样本中的DNA进行提取。
DNA提取是分子生物学实验中的第一步，常用的提取方法包括酚/氯仿法、离心法和商用DNA提取试剂盒等。
通过这些方法可以将DNA从细胞或组织中提取出来。
接下来，需要将提取得到的DNA进行放大。
常用的放大方法有PCR（聚合酶链式反应）和SNP（单核苷酸多态性）分析等。
PCR是一种体外的DNA复制技术，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。
SNP分析则是通过扩增特定的基因片段来检测个体间的单核苷酸变异。
基因分型是基因型分析的核心步骤。
常见的基因分型技术有限制性片段长度多态性（RFLP）、序列特定引物扩增（SSP）和基因芯片等。
RFLP分析是基于特定限制性内切酶酶切位点的DNA片段长度变异来进行基因分型的技术。
SSP则是通过引物的特异性扩增决定基因分型。
基因芯片则是一种高通量的基因分型平台，可以同时检测数千个基因的单核苷酸多态性。
最后，需要对分型结果进行数据分析和解读。
根据不同的分型技术可以得到不同的分型结果，需要将这些结果与已知的基因型进行比对。
数据分析包括基因型预测、相关性状分析和基因关联研究等。
基因型分析在包括人类疾病遗传研究、种质资源鉴定、遗传育种和亲子鉴定等领域具有重要的应用价值。
通过基因型分析，可以确定个体或物种的基因型，进而了解其遗传特征和相关性状，对于人类健康和物种保护具有重要的意义。
总之，基因型分析是通过对生物体DNA序列进行分析，确定其基因型从而了解其遗传特征的一种方法。
它在分子生物学、遗传学和医学研究中具有重要的意义，可以为人类健康、物种保护和种质资源利用等领域提供有力的支持。
HLA分型法[指南]
![HLA分型法[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/f09ac84b3a3567ec102de2bd960590c69ec3d8b6.png)
HLA 分型法HLA分型技术主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。
1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。
MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。
HLA基因，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb。
HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。
由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。
按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有13×30＝390种之多。
理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB血型。
事实上，HLA 各基因并非完全随机地槌傻ピ 停 浅氏殖隽 黄胶猓╨inkagedisequilibrium,LD）的特点。
理论推测的HLA 分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。
世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。
总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。
即使在中国，地区间也存在差异。
在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。
在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13单体型频率呈北低南高分布。
PCR-RFLP
步骤
• • • • • ( 1) 选择目标序列 ( 2) 设计特异引物 ( 3) PCR扩增 ( 4) 酶切 ( 5) 琼脂糖电泳分离与鉴定
特点
• (1) 引物与限制性内切酶组合非常多, 增加了揭示多态性的 机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析; • (2) 在真核生物中,CAPS标记呈共显性, 即可区分纯合基因 型和杂合基因型; • (3) 所需DNA的量很少, 且对DNA的浓度要求不严格; • (4) 使用的引物较长, 扩增的结果比较稳定且避免了RFLP 分析中膜转印这一步骤, 又能保持RFLP分析的精确度; • (5) 操作简便、快捷和自动化程度高。
PCR-RFLP
分子标记
• 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的 遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映。 • 某种意义上分子标记也指DNA分子标记, 就是指能反映生 物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。它能 够直接反映基因组DNA间的差异。
原理
• PCR-RFLP是酶切扩增多态性序列标记技术, 又称为 CAPS, 主要是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切分 析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物, 将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。 • 基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异 性的PCR引物( 19~27bp) , 然后用这些引物扩增该位点上 的某一DNA片段,接着用专一性的限制性内切酶切割所得 扩增产物,凝胶电泳分离酶切片SCP的比较
应用
• 植物基因分型、定位、克隆、分子鉴定和动物的遗传多样 性、品种鉴定以及微生物的连锁图谱和品种鉴定等方面。
小概念
• DNA的多态性(不同个体间基因组的核苷酸序列存在的差 异性)可影响限制酶的切割位点，造成限制性片段长度多 态性，即用同一种限制酶消化不同个体的DNA时，会得到 长度各不相同的限制性片段类型。不同个体基因组在同一 段DNA是否有同样的酶切位点，决定了酶切后是否产生同 样大小的片段。当碱基组成的变化改变了限制酶的识别位 点时，就会得到不同的限制性片段类型，这样的位点称为 多态性位点。
cyp2c19基因型分型
cyp2c19基因型分型【最新版4篇】目录（篇1）1.CYP2C19 基因的功能和作用2.CYP2C19 基因的多态性3.CYP2C19 基因型分型的重要性4.CYP2C19 基因型分型的方法5.CYP2C19 基因型分型的应用正文（篇1）CYP2C19 基因是肝脏细胞内一种重要的药物代谢酶，主要负责许多临床药物的代谢，例如，抗肿瘤药物、抗癫痫药物、抗抑郁药物等。
因此，CYP2C19 基因的功能和作用对人体药物代谢具有极大的影响。
CYP2C19 基因存在着多态性，即在不同个体中，CYP2C19 基因的序列存在差异。
这种多态性导致了 CYP2C19 酶活性的不同，进而影响了药物在体内的代谢速度和浓度。
因此，CYP2C19 基因型的分型对于个体化用药具有重要的指导意义。
CYP2C19 基因型分型的重要性体现在其能够帮助临床医生根据患者的基因型，选择最适合的药物和剂量，以达到最佳治疗效果，同时减少药物不良反应的发生。
目前，CYP2C19 基因型分型的方法主要有两种：一种是基于聚合酶链反应（PCR）的技术，另一种是基于基因芯片的技术。
这两种方法各有优缺点，但都能够准确地进行 CYP2C19 基因型的分型。
CYP2C19 基因型分型的应用广泛，除了在个体化用药中的应用外，还在药物研发、药物基因组学、疾病诊断等领域发挥重要作用。
例如，通过CYP2C19 基因型分型，可以预测患者对某种药物的反应，从而指导药物的研发和改进。
目录（篇2）1.CYP2C19 基因的功能和重要性2.CYP2C19 基因的多态性3.CYP2C19 基因型分型的方法4.CYP2C19 基因型分型的临床应用5.CYP2C19 基因型分型的未来展望正文（篇2）CYP2C19 基因是肝脏细胞内最重要的药物代谢酶之一，它对许多临床常用药物的代谢起到关键作用。
因此，对 CYP2C19 基因型的研究具有重要的临床意义。
CYP2C19 基因具有多态性，目前已知有多种等位基因，其中最常见为CYP2C19*1 和 CYP2C19*2。
(完整word)临床分子生物学检验 总
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA)为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1。
菌种鉴定：PCR—测序和PCR—DNA探针杂交;缩短检测时间2。
确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效3.病毒分析:基因型变异产生不同临床症状4。
细菌耐药监测和分子流行病学调查 :随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1。
致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3。
肿瘤相关基因单基因病1。
致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2。
致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2。
疾病诊断和遗传咨询3。
多基因病的研究4。
器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI） 3。
日本国立遗传研究所(DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等.蛋白质数据库常用的有SWISS—PROT、 PIR、 PDB数据库。
分子生物学(1)
第一章（绪论）1.目前临床分子生物学检验最常用的分子靶标是( )（本题1分）A.基因组DNAB.cDNAC.RNAD.蛋白质E.代谢物[解析]正确答案：A2. 某DNA片段与5＇-ATCGT的互补片段是( )（本题1分）A.5＇-TAGCAB.5＇-ACGATC.5＇-ACGAUD.5＇-UAGCAE.5＇-ATCGT[解析]正确答案：B3.真核mRNA的特点不包括( )（本题1分）A.有5＇-m7GpppG帽B.有3＇-polyA尾C.含量多，更新慢D.包含有遗传密码E.为单顺反子结构[解析]正确答案：C4.关于microRNA（miRNA）的特征描述不正确的是( )（本题1分）A.大小长约20~25ntB.主要发挥基因录后水平的调控C.在血清中稳定存在D.不具有组织特异性E.初始产物具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴[解析]正确答案：D5. 下列关于原核生物基因结构的说法错误的是( )（本题1分）A.一般以操纵子形式存在B.由编码区和非编码区组成成C.编码区可能含多种蛋白遗传信息D.编码区通常是不连续的，分外显子和内含子E.启动子、终止子、操纵元件均位于非编码区[解析] 正确答案：D6. 下列关于真核生物基因结构的描述，不正确的是( )（本题1分）A.真核生物的基因大多数是由非编码序列隔开的断裂基因B.编码区能够转录为相应的RNA，经加工参与蛋白质的生物合成C.非编码区对基因的表达起调控作用D.启动子、侧翼序列均位于非编码区E.只有内含子序列是不能编码蛋白质的序列[解析]正确答案：E7. 下列哪种情况不属于表观遗传现象？( )（本题1分）A.DNA插入/缺失突变B.组蛋白乙酰化修饰C.DNA甲基化修饰D.RNA干扰E.miRNA调控[解析] 正确答案：A8. 在人类基因组DNA序列中，DNA甲基化主要发生在( )（本题1分）A.腺嘌呤的N-6位B.胞嘧啶的N-4位C.鸟嘌呤的N-7位D.胞嘧啶的C-5位E.鸟嘌呤的C-5位[解析] 正确答案：D9.下列不属于原核生物基因组结构特点的是( )（本题1分）A.基因组相对较小，基因数目少B.结构基因多以操纵子形式存在，不含内含子C.转录产物为多顺反子D.具有编码同工酶的基因E.基因组序列不可移动[解析]正确答案：E10. 下列哪项不能被列入可移动基因的范畴( )（本题1分）A.插入序列B.质粒C.染色体DNAD.转座子E.可转座噬菌体[解析]正确答案：C11. 病毒的遗传物质是( )（本题1分）A.DNAB.DNA和蛋白质C.RNA和蛋白质D.RNA和DNAE.DNA或RNA[解析] 正确答案：E12. 在人类基因组中指导蛋白质合成的结构基因大多数为( )（本题1分）A.单一序列B.散在重复序列C.串联重复序列D.多基因家族成员E.回文结构[解析] 正确答案：A第二章1. 一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子双链，这一过程称为( )（本题1分）A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针[解析]正确答案：D2.硝酸纤维素膜的最大优点是( )(本题1分）A.脆性大B.本底低C.共价键结合D.非共价键结合E.吸附核酸能力强[解析]正确答案：B3.以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针结合，则该样本为( )（本题1分）A.正常人B.杂合体患者C.纯合体患者D.携带者E.不能确定[解析]正确答案：D4.最常用的DNA探针标记方法是( )（本题1分）A.随机引物标记B.DNA缺口平移标记C.全程RNA探针标记D.PCR法标记E.末端标记[解析]正确答案：A5.下列关于Southern印迹杂交的描述正确的是( )（本题1分）A.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定基因，而且还可以获得基因片段大小及酶切位点的分布信息B.检测目标是RNAC.常用于基因定位分析D.可用于阳性菌落的筛选E.可用于蛋白水平的检测[解析]正确答案：A6.荧光原位杂交可以用于( )（本题1分）A.快速确定是否存在目的基因B.检测目标是RNAC.常用于基因定位分析D.常用于阳性菌落的筛选E.常用于蛋白水平的检测[解析]正确答案：C7.下列关于核酸探针的描述正确的是( )（多选题）A.可以是DNAB.可以是RNAC.可用放射性标记D.可用非放射性标记E.必须是单链核酸[解析]正确答案：A,B,C,D8. 关于RNA探针的优点描述正确的是( )（本题1分）A.制备方法简便B.不易被降解C.标记方法比较成熟D.杂交效率和杂交体的稳定性高E.非特异性杂交较少[解析]正确答案：D,E9. DNA分子中A-T含量越高，Tm值越高。
淋病奈瑟菌的分子生物学检验
一、淋病奈瑟菌的基因组结构特征
淋病奈瑟菌FA1090菌株是最早被完成测序研 究的淋病奈瑟菌菌株之一，它的染色体DNA长度 为2.15Mbp，其中G+C含量为52.68%。编码区的 DNA长度占总长度的78%。共含有2069个基因，包 括2002个具有编码功能的基因和67个编码结构性 RNAs基。Chung GT等人在2008年报道了淋病奈瑟 菌新菌株NCCP11945的基因组结构。他们发现 NCCP11945染色体的DNA长度为2.23Mbp，据估计 可以编码2622个开放性阅读框。同时，NCP11945 含有一个能编码12个ORFs的质粒，其DNA长度为 4153bp。据他们估计，整个基因组的编码基因的 密度约为87%。全基因组平均G+C含量为52.4%。 这与FA1090菌株相类似。
4．链替代扩增技术
SDA是一种基于酶促反应的新的DNA体外等 温扩增技术。目前使用较多的是Becton Dikinson公司生产的Probe Tec ET，可以同时 对CT和NG进行检测，Probe Tec ET特异性扩增 NG染色体PivNg基因，然后用荧光标记的探针 检测其相应的DNA靶序列，2小时可以完成96份 标本检测。与培养法相比具有很高的敏感性和 特异性。
1．克服了淋球菌培养时间长等缺点，提高 了临床样本检测的阳性率和准确性。
2．通过分子生物学技术可以进行淋球菌感 染的分子流行病学调查。
3．可以准确、快速评价药物治疗的效果。 4．有利于淋病的鉴别诊断。
谢谢！
二、淋病奈瑟菌的分子生物学检验内容
（一）淋病奈瑟菌核酸的检测
1．聚合酶链反应
PCR是分子生物学中最常用检测基因的技术 手段，也是淋病奈瑟菌基因诊断中最基本的方法。 PCR引物的设计应选择与其相应的靶基因，多采 用：①隐蔽质粒cppB基因(cppBH01/3、1/2及 cppBN3/4)；②16s rRNA基因(SL67/59、NGPl/2)； ③porA假基因；④编码外膜蛋白基因（omp基 因）；⑤opa基因等；⑥胞嘧啶DNA甲基转移酶基 因(Roche Cobas Amplicor)。不同靶基因设计引 物对PCR的敏感性和特异性有一定的影响。
PCR技术及应用
2、引物的设计： 引物包括两条，即5/端引物和3/端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度
引物设计的基本要求： （1）引物长度: 15~30 nucleotides （2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌 呤或嘧啶碱基的堆积现象。 No GGG or CCC at 3’-end (G+C) 45%~ 55% Tm=4(G+C)+2(A+T)
（3）dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+ 浓度降低
5）镁离子浓度 TaqDNA聚合酶的激活剂 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响；在一般的 PCR反应中，各种NTP浓 度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜； Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非 特异扩增， 浓度过低会降低，Taq DNA聚合酶的活性 不够，使反应产物减少。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
• 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 • 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪 • 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
复制的起始
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
复 制 过 程 简 图
高级卫生专业资格正高副高输血技术专业资格(正高副高)模拟28)_真题-无答案93
高级卫生专业资格（正高副高）输血技术专业资格(正高副高)模拟题2021年(28)(总分100,考试时间120分钟)A1/A2题型1. 淋巴细胞毒实验中染色和固定特性描述错误的是A. 实验前应先对曙红染料进行预实验B. 曙红染色时间一般为2～10分钟C. 甲醛能使死细胞有更大的折光性D. 长时间染色将使活细胞死亡而着色E. 染色后可以有效区分死细胞和活细胞2. HLA基因分型与血清学方法比较的特性描述错误的是A. 基因分型检测的是个体HLA座位等位基因的核苷酸序列B. 血清学技术检测的是HLA座位上的抗原情况C. 两种方法均不需要新鲜标本D. 基因分型错误率远低于血清学方法E. 两种方法在临床应用上互相补充3. 有关HLA基因分型PCR-SBT方法描述错误的是A. 采用双向测序引物对扩增片段进行测序分析B. 检测HLA等位基因核苷酸多态性位点碱基情况C. HLA-Ⅰ类基因一般检测第2、第3和第4外显子D. 直接双链测序过程不存在模棱两可结果E. 分型结果属于高分辨分型方法4. 有关血清学方法鉴定粒细胞抗原描述错误的是A. 操作过程大多相对繁琐B. 需要分离粒细胞C. 血清学方法可以采用陈旧标本D. 粒细胞需要有一定的纯度E. 抗原指定准确性与抗血清质量相关5. 有关微量淋巴细胞毒试验的特性描述错误的是A. 死细胞明亮折光性强B. 需要活性淋巴细胞C. HLA抗原指定的标准方法D. 一般在相差显微镜下观察结果E. 准确性很大程度取决于抗血清的质量6. 血清学方法指定HLA抗原描述错误的是A. 血清学方法可以检测HLA-Ⅰ类抗原B. 血清学方法可以检测HLA-Ⅱ类抗原C. HLA-Ⅰ类抗原需要系统分离纯化B淋巴细胞D. HLA-Ⅱ类抗原需要系统分离纯化B淋巴细胞E. HLA-DPB1抗原表达弱，很难采用血清学确定抗原型7. HLA低分辨分型是指A. 检测到HLA命名*后第1位B. 检测到HLA命名*后第2位C. 检测到HLA命名*后第3位D. 检测到HLA命名*后第4位E. 检测到HLA命名*后第5位8. HLA基因分型方法中结果最准确的是A. 基因芯片B. PCR-SSOPC. PCR-SSPD. PCR-SBTE. Luminex检测技术9. 有关粒细胞凝集实验描述错误的是A. 早期建立的方法B. 需要分离粒细胞C. 方法灵敏度最高D. HLA抗体会导致假阳性结果E. 高滴度免疫复合物导致假阳性结果10. 微量淋巴细胞毒试验的NIH计分法中8分表示A. 阴性B. 可疑阴性反应C. 可疑阳性反应D. 阳性反应E. 强阳性反应11. HLA抗体流式细胞检测技术描述错误的是A. 流式细胞仪比淋巴细胞毒实验方法敏感性要好B. 流式细胞仪比淋巴细胞毒实验方法特异性要差C. 流式细胞仪能同时检测所有的免疫球蛋白型D. 依据荧光值大小判断是否存在HLA抗体E. 以淋巴细胞作为靶细胞抗原12. HLA基因分型PCR-RFLP方法有关特性描述错误的是A. 早期应用于HLA-A、B位点基因分型B. 利用限制性核酸内切酶消化C. 可能受实验条件影响导致消化不完全D. 部分碱基差异难以找到合适的限制性核酸内切酶E. 为早期的HLA基因分型方法13. 截至2011年7月发现的HLA等位基因数为A. 4810个B. 5810个C. 6810个D. 7810个E. 8810个14. 有关粒细胞免疫荧光试验描述错误的是A. GIFT可分为直接法和间接法B. 间接法仅可用于检测粒细胞抗原C. 需要分离出新鲜的粒细胞D. 敏感性均优于GAT法E. 常采用流式细胞计数仪检测15. 微量淋巴细胞毒试验的NIH计分法中1分表示死亡细胞比例为A. 0%～10%B. 11%～20%C. 21%～40%D. 41%～60%E. >80%16. HLA抗体检测的ELISA方法特性描述错误的是A. 可检测补体依赖的HLA抗体B. 可检测非补体依赖的HLA抗体C. 可鉴定出HLA-Ⅰ类抗体D. 可鉴定出HLA-Ⅱ类抗体E. 不能区分免疫球蛋白型17. 有关HLA基因分型参比链介导的构象分析描述错误的是A. 扩增产物与参比链杂交产生不同构象的稳定DNA双链B. 实验中需要用荧光标记参比链C. 等位基因的确认完全依赖于参比链确定的标准梯度D. 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳E. 杂交双链峰值的荧光强度由标本的PCR产物决定18. 有关CWD原则错误的是A. CWD原则分型中将常见等位基因和确认等位基因合并为CWDB. 为目前实验室较常用的一种HLA高分辨指定方法C. 出现罕见等位基因组合应进行区分D. CWD原则依据数理统计分析，根据现有分型结果和原则进行选择判断E. 采用统计学原则估算存在较少概率指定错误的可能19. 有关单克隆抗体粒细胞抗原捕获试验描述错误的是A. MAIGA方法不区分粒细胞抗体种类B. 分离获取的粒细胞需多聚甲醛固定C. MAIGA方法灵敏度和特异性好D. 反应板中包被物为针对单克隆抗体的第二抗体E. HNA抗体特性鉴定常用方法20. 微量淋巴细胞毒试验中淋巴细胞特性描述错误的是A. 需要高纯度淋巴细胞B. 需要新鲜标本制备C. 肿瘤患者HLA抗原可减弱D. 淋巴细胞与血清比例可以任意调整E. 无效等位基因淋巴细胞表面抗原不表达21. HLA抗体检测的Luminex检测技术特性描述错误的是A. 以包被抗原的微球磁珠作为靶细胞B. 每种磁珠上包被一种抗原C. 多种磁珠可以在同一体系内反应D. 不能区分HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ抗体E. 有HLA抗体筛选和HLA抗体确认两种试剂22. 有关HLA基因分型PCR-SSP方法描述错误的是A. 是目前大多数临床实验室常用的方法之一B. 可能出现假阳性带或漏带现象C. 具有快速、耗时较短和结果判断简便的特点D. 引物5'端第一个碱基是否与模板配对起关键作用E. 有低分辨和高分辨分型试剂23. 确认等位基因是指等位基因至少在几个独立非亲缘个体中被检测到，而在人群中尚无准确的频率A. 2个B. 3个C. 4个D. 5个E. 6个24. 有关HNA系统基因分型方法描述错误的是A. 理论上能够区分SNP的方法均可用于HNA基因分型B. HNA系统抗原的差异均为单核苷酸多态性引起C. 所有HNA系统多态性均可利用PCR-RFLP进行基因分型D. PCR-RFLP需要合适的特异性限制性内切酶E. PCR-RFLP存在消化不完全引起实验失败的可能25. 分离淋巴细胞中红细胞污染严重时，常用处理破坏红细胞的溶液是A. 1.0g/L次氯酸B. 2.0g/L尿素C. 0.9g/L氯化钠D. 8.3g/L氯化铵E. 1.0g/L氯化钙26. 有关HLA抗体检测技术特性描述错误的是A. 补体依赖的淋巴细胞毒方法检测敏感性最高B. 补体依赖的淋巴细胞毒方法是最早的方法C. 流式细胞术需要特殊设备D. ELISA方法能同时检测HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ抗体E. Luminex检测技术可以指定HLA抗体的抗原特性27. 有关HLA基因分型PCR-SSOP方法描述错误的是A. 分为正向PCR-SSOP和反向PCR-SSOPB. 探针5'端第一个碱基与模板配对起关键作用C. 是核酸杂交的代表性技术D. 可分为高分辨方法和低分辨方法E. 近年来大多采用非放射性标记探针28. 有关单链DNA抽提技术描述错误的是A. 遵循碱基序列互补的原则B. 可将个体两个等位基因进行分离C. 分离后将得到双链基因组DNAD. 针对不同等位基因需要选择特定的探针E. 可用于确认新等位基因的实验29. 有关HLA-1系统描述错误的是A. HLA-1系统有HLA-1a、-1b、-1c三个等位基因B. 编码FcyRⅢa的FCGR3A基因与FCGR3B高度同源C. FCGR3B*1和FCGR3B*2有5个碱基不同D. FCGR3B*2和FCGR3B*3有2个碱基不同E. FCGR3A与FCGR3B*1有3个碱基相同30. 微量淋巴细胞毒试验中孵育时间和温度特性描述错误的是A. 孵育时间不足将产生假阴性B. 孵育时间过长将产生假阳性C. 孵育的温度以37℃最为适宜D. 温度过低出现细胞毒冷抗体干扰E. HLA抗血清条件应进行优化31. 有关HLA细胞学检测描述错误的是A. 细胞分型技术指定了多个HLA-Ⅰ类抗原B. 有纯合细胞分型方法C. 常见的方法为混合淋巴细胞培养方法D. 细胞分型指定偏差较大E. 分型细胞来源较困难32. 有关HLA基因分型Luminex检测技术描述错误的是A. 具有高通量检测技能B. 在同一微孔内进行反应C. 用微球磁珠作为载体D. 不同微球磁珠上颜色比例不同E. 绿色激光束下区分微球磁珠33. 有关单链扩增技术描述错误的是A. 引物只扩增HLA座位上的某些等位基因或某组等位基因B. 利用HLA座位组（型）的核苷酸碱基序列差异性设计引物C. 部分等位基因需要采用两次扩增技术才能有效区分D. 单链扩增后将得到两个等位基因组合的扩增片段E. 常用于新位点的确认实验34. HNA常见基因分型方法中结果最准确的是A. PCR-RFLPB. PCR-SBTC. PCR-SSPD. 多重SNaPshotE. PCR-SSOP35. HLA研究早期常采用检测抗原的分型方法是A. 微量细胞分型法B. 试管离心法C. 血清学分型法D. 基因分型法E. 微量培养法36. 微量淋巴细胞毒试验中补体特性描述错误的是A. 补体对淋巴细胞毒实验存在影响B. 实验前应先对补体进行预实验C. 补体天然细胞毒性产生假阴性D. 补体活性偏高产生假阳性E. 补体活性偏低产生假阴性37. 纯合细胞分型方法描述错误的是A. 以纯合抗原细胞为刺激细胞B. 以未知抗原检测细胞为反应细胞C. 转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大D. 采用单向混合淋巴细胞培养反应E. 受检细胞与纯合细胞反应阳性时才能指定抗原38. 有关Luminex检测HLA基因描述错误的是A. 已知序列特异性探针固定在微球磁珠上B. 每一种探针固定在已知颜色比例的微球磁珠上C. 在同一孔内进行特异性杂交D. 采用微球磁珠作为载体E. 红色激光束检测杂交信号39. 有关组特异性测序引物技术描述错误的是A. 实验中选择特异性测序引物进行测序反应B. 利用等位基因核苷酸碱基序列差异性设计测序引物C. 测序反应引物只与其中一个等位基因的序列互补D. 测序得到序列为与引物不互补的某个特定等位基因的序列E. 常用于PCR-SBT方法中模棱两可结果的区分。
分子生物学检验完整版
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。
特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。
功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。
临床特征：生长发育障碍，智力低。
呆滞面容，又称伸舌样痴呆。
40%患者有先天性心脏畸形。
肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。
核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX(XY),+212.5%患者为嵌合型：46，XX(XY)/47，XX(XY),+215%患者为易位型：46，XX(XY),-14，+t(14q21q)4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。
2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。
3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。
分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等。
DNA条形码技术
T
G
ASO探针
聚合酶链式反应（PCR）
1.PCR技术的创建 2.PCR的原理 3.PCR的反应体系和方法 4.PCR技术的近现代运用
基因组DNA
引物
DNA聚合酶
DNA片段体外扩增
PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引 物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得 到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了 PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无 脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞 色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I ，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物 Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种 内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出 可以用单一的小片段基因来代表物种；他们 将超市用以区分成千上万种不同商品的条形 码概念引入，把这种小片段基因序列称作物 种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为 全球生物编码的计划。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要 构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入 细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选; 这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培 养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时 间。
PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多 聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起 点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火 和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30 次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物 进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带。
PCR-RFLP方法鉴定ABO血型基因型
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2020, 10(2), 13-18Published Online April 2020 in Hans. /journal/hjbmhttps:///10.12677/hjbm.2020.102003ABO Genotypes Were Identified byPCR-RFLP MethodChenhang Wang, Yujia Kang, Jinlei Shi*School of Life Science and Technology, Shanghai Tech University, ShanghaiReceived: Mar. 29th, 2020; accepted: Apr. 13th, 2020; published: Apr. 20th, 2020AbstractThe substitution of several bases in ABO gene and the deletion of single base lead to the produc-tion of A, B and O alleles, which can make the erythrocyte membrane surface with different anti-gens, and thus form four blood type phenotypes. According to the differences of the key loci of the three alleles, the PCR-RFLP method was used to amplify the DNA fragments and perform specific enzyme digestion. The genotype could be preliminarily determined based on the enzyme diges-tion results, and then the enzyme digestion results are verified by sequencing method. In this study, ABO genotypes were identified for the first author and another student, and the results showed that the PCR-RFLP results were consistent with the sequencing results.KeywordsPCR-RFLP, ABO GenetypesPCR-RFLP方法鉴定ABO血型基因型王晨航，康宇佳，石金磊*上海科技大学，生命科学与技术学院，上海收稿日期：2020年3月29日；录用日期：2020年4月13日；发布日期：2020年4月20日摘要ABO基因中几个碱基的替换、单碱基缺失导致A、B、O三种等位基因的产生，可使红细胞膜表面带有不同抗原，进而形成四种血型表型。
基于SNP的连锁不平衡分析
SNP1(A，a)
药物基因组学教研室
SNP2(B，b)
假设：位于同一条染色体相邻两个SNP：
SNP1(A，a)
SNP2(B，b)
3组合方式（单体型）：AB，Ab，aB：ab。 3如果A与B无LD：两个SNP的等位基因相互独立， 随 机组合，概率为AB:Ab:aB:ab=0.25: 0.25:0.25:0.25， AB组合的频率：fAB= fA×fB（等位基因频率） 3如果A与B存在LD：A与B连锁，当完全连锁时概率 为AB:ab=0.5:0.5， AB组合的频率fAB= fA×fB +D， （D表示两位点间LD程度)
药物基因组学教研室
已知SNPs 突变错配扩增检验 实时定量PCR技术 焦磷酸微测序技术 荧光偏振光技术 基因芯片技术
可用于基因型的分析
SNPs分析: 基于公共数据库的方法
5 利用数据库中的大量序列信息，采用生物信息学软 件， 用计算机自动识别,是发现SNPs的新策略和重要方法。 5 与癌症和肿瘤相关的候选SNP数据库： http://cgap. ncbi. nih. gov/ GAI 5 适于生物医学研究的SNP数据库： http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ SNP 5 人类SNP数据库： http://hgbas. cgr. ki.sei 或http//hgbase.interactiva.de /
药物基因组学教研室
2(B，b)
LD的度量
6 LD的度量一般不直接使用LD定义式, 而对D进 行归一化后，用LD系数D’和r2进行检验。 ︱D′︳＝D2／min(fA fb, fa fB) (D＜0) ︱D′︳＝D2／min(fA fB, fa fb) (D＞0) r 2＝D2／fA fa fB fb 6 取值范围：0（无LD）——1（完全LD）。
PCR-RFLP基因分型方法
基因型 泳
基因序列查找
/Genbank
http://www.genomatix.de/
/sprot/
/home/Neil_Crickmore/Bt/
PCR-RFLP 基因分型方法
---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析
概念
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP):
是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。
两条引物之间的GC含量不宜相差太大
引物一般原则
Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最
好相差不要大于5 度
引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5
最好不要位于3’末端 否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的 影响了
线性DNA分子大小（kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
电泳
157bp 132bp
相差25bp
344bp 310bp
相差34bp
结果分析
ห้องสมุดไป่ตู้
频率统计
H-W平衡分析
统计检验 最终结果
祝大家实验顺利
发夹结构
二聚体
错配
交叉二 聚体
Primer Premier 5.0
更高级应用：
参数的设置
手动搜索或者修改引物
搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）
引物纯化方式的选择
去盐（ RPC 、Desalted）纯化 它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除 盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、 DNA测序等实验。 PAGE纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE 纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化 后的纯度 大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。 适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需用引物， 各种探针等。 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。 适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、 长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。
最新SNP检测技术
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有:
1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等
DNA测序法
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及荧 光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本 身出错的概率非常低；
（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都 能被检测出来；
（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突 变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体 位置。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。
Sanger法测序在HLA-SBT分型中应用知识分享
套峰
原因：1、模板不纯；2、模板 上有两个引物结合位点；3、 加入两个引物；4、退火温度 过低；5、纯化时污染
第33页
解决方案：1、优化PCR反应条 件；2、重新设计引物；3、提 高测序反应的退火温度；4、 加 样及纯化时要防止污染
CCME 03
读长短
原因：1、太多的模板量；2、 Bigdye稀释过度；3、模板 量 过少；4、引物过量；5、 模 板纯化不好；6、模板上 有不 容易测通的区域（如 poly G）
185g
第30页
CCME 03
测序引物问题：
现象：每个峰后面有个同样荧 光信号的小“尾巴”。 原因：合成是引物多一个碱基。 对策：重新合成引物。
现象：每个峰前面有个同样荧光 信号的小“尾巴”。 原因：合成时引物少一个碱基。 对策：重新合成引物。
引物或模板不纯：
现象：整个峰图噪音都比较高； 原因：引物或模板不纯； 对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。
加水量=(储存液体积×储存液浓度/使用液浓度)-储存 液体积
按预算的体积在1.5mL离心管中加入millipore水， 吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振 荡30秒，离心10秒，备用。
第19页
CCME 03
稀释引物注意事项
back
1、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm 离 心30s,干粉引物12000rpm离心2min。
加样时注意事项：
1. 使用前检查移液器量程设定是否准确； 2. 使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内 不能有残留； 3. 在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂.
加样时注意事项：
back
4. 加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应 板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色 背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足， 确认无误后方可进行下一步操作；
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PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
引物设计 酶切位点 分析
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
自动搜索 引物
手动编辑 引物
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
前引物的位置（必 须超过突变位点）
后引物的位置 （必须在突变位
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
突变位点，找不 到合适的内切酶
tctcaacaaaaTcaaaactgtaag
tctcaacaGaaTcaaaactgtaag
Hinf I 可以使用PCR-RFLP的
方法基因分型
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
基本原则：
人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的 合适的酶切位点
引物设计
引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
基本原则：
1. 引物要跟模板紧密结合， 2. 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在， 3. 引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。
需要考虑的因素：
引物长度（primer length）、 产物长度（product length）、 序列Tm值(melting temperature)、 ΔG值(internal stability)、 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site）、 引物及产物GC 含量（composition）
PCR-RFLP:
是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技 术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再 选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳， 可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型 的目的。
PCR-RFLP基因分型方法
概念
PCR-RFLP基因分型方法
几种特殊类型的引物设计
引入酶切位点引物设计 Takara定点诱变试剂盒 定诱变引物设计
PCR-RFLP基因分型方法
引入酶切位点引物设计
为什么要引入酶切位点？
突变位点没有内切酶 或者合适的内切酶
通过人为的在引物上改变一个碱基从而使 之与突变位点的碱基构成新的酶切位点
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
工欲善其事，必先利其器
Primer Premier 5.0 引物设计
Oligo 6.0 引物评价
PCR-RFLP基因分型方法
引物设计
新建窗口
输入序列
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
突变位点
选取突变位点 前后约500bp 长度的碱基
概念
Step by step
电
选择内切酶
设计引物
确定基因序列
PCR-RFLP基因分型方法
基因型 泳
基因序列查找
PCR-RFLP基因分型方法
PCR-RFLP基因分型方法
基因序列查找
选择 gene
输入基因名 称
PCR-RFLP基因分型方法
基因序列查找
基因的全称
PCR-RFLP基因分型方法
基因的物 种来源
PCR-RFLP 基因分型方法
---关于序列查找、引物设计和酶切位点分析
PCR-RFLP基因分型方法
概念
聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析
限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP):
是指由限制性酶切位点间的插入﹑缺失﹑重排或 点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp
太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度
引物末端要求：3’端的序列要比5’端重要，
引物3’端的碱基一般不用A A在错误引发位点的引发效率相对比较高 ， 5’端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。
点之后）
PCR产物 的长度
PCR-RFLP基因分型方法
引物的长度
Primer Premier 5.0
引物的综合评分， 分越高引物越好
引物序列
PCR-RFLP基因分型方法
引物的详细信息
Primer Premier 5.0
发夹结构 二聚体 错配
交叉二 聚体
PCR-RFLP基因分型方法
Primer Premier 5.0
引物的GC含量 ：一般为40-60%，以45-55％为宜
两条引物之间的GC含量不宜相差太大
PCR-RFLP基因分型方法
引物一般原则
Tm 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最
好相差不要大于5 度
引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5
最好不要位于3’末端
否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致 PCR 正常反应不能进行 ，如果在5’末端对反应就没有多大的 影响了
ΔG值: 反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的
ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高而 3’端ΔG值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发
PCR-RFLP基因分型方法
PCR-RFLP 引物特殊要求
PCR产物的长度：200-1000bp 酶切后产物片断的大小差距：100bp以上
更高级应用：
参数的设置 手动搜索或者修改引物 搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）
PCR-RFLP基因分型方法
引物纯化方式的选择
去盐（ RPC 、Desalted）纯化 它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除 盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、 DNA测序等实验。 PAGE纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE 纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化 后的纯度 大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。 适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需用引物， 各种探针等。 HPLC纯化 采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。 适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、 长链DNA、PCR克隆，PC定R-RF点LP基因突分型变方法，人工合成基因等。