用探针法进行基因分型的方法

用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原

癌基因进行基因分型

RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA 染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。

多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。

之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外，不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制，RET外显子测序保持黄金标准。

测序是一种耗时且昂贵的开管实验，需要生成PCR产物之后的额外操作。相反，高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验，不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之

内的序列变化。对检测PCR扩增子内杂合点突变的高分辨率熔解技术的系统研究发现，检测400bp之内的扩增子的敏感性和特异性是100%。最近，我们证实用高分辨率熔解分析进行RET 外显子突变扫描。虽然这种方法在盲实验中检测100%的突变，但是有些罕见的突变的熔解曲线相似，完全进行基因分型是困难的，在这种情况下，在最初的突变扫描之后需要测序。另一种方法，添加杂交探针可以分出RET突变的绝大多数的基因型，而不需要测序。

荧光标记杂交探针分析是一种快速、闭管操作的实验，可以通过探针/等位基因的熔解温度基因分型序列变化，但是需要昂贵的寡核苷酸修饰。非标记探针也可以通过Tm的不同进行基因分型，也是一种闭管操作的实验，需要LC Green染料。因为用DNA饱和染料检测，非标记探针和扩增数据可以从一个熔解曲线分析。Zhou等最近证实非标记探针基因分型分析可以补充突变扫描。但是，在同一个外显子之内的RET所有突变不能只用一条探针进行基因分型，因为探针下特定突变的熔解温度相似或相同。

为了完成闭管基因分型实验，发明了两步RET基因分型方法，此方法比测序技术成本低，耗时少。用于扩增熔解的第一个PCR阶段（主要实验），扫描RET外显子的序列变化，反之，非标记探针分析位于突变范围内，且分辨可能的基因型。第二个PCR阶段（第二次实验）需要限定数目的特定突变的探针对>50的RET序列突变进行明确的基因分型。用遮蔽技术设计的探针简化了突变分离。当探针下有多重的可能的序列突变使分析变得复杂时，遮蔽技术简化了探针熔解的判断。在多态位点选择含有错配的（缺失、不匹配碱基或一般碱基）可以遮蔽的序列变化。这样的话就在遮蔽多态位点人为的创造了一个与可能的等位基因的错配。野生型与遮蔽突变的等位基因都有一个与探针错配的碱基和相似的Tm。然而，突变等位基因在探针下其它的位置有一个额外的错配，可以通过比仅在遮蔽位置变化的等位基因稍低的Tm值鉴定。材料和方法

样品

此报道中用到的野生型RET基因的DNA基因组样品或有RET序列变化的样品在以前描述过。RET基因序列变化改变RET蛋白的功能引发MEN2综合症的是突变，然而RET序列改变不会引发MEN2综合症是多态。不能确定意义的稀有的或不会引起MEN2综合症的RET基因序列变化成为“序列变化”。在这份报告中，通过密码子数列出RET序列变化，野生型编码DNA序列后面是编码序列改变，伴随着加粗突变核苷酸（例：618（TGC→T A C）），反之多

态及序列变化用下划线标出。所有测试的RET序列变化的样品均有单个核苷酸改变，并且是杂合的除非有另外的阐明。RET突变基因型和多态性及序列变化基因型列于表1。

引物和探针

用完整DNA技术合成寡核苷酸。用Primer3设计引物。选择引物和探针检测所有已知RET突变，不包括分析中的普通多态（表2）。非标记探针包含有3’磷酸化或3’氨基修饰（整合DNA技术），避免PCR反应中的延伸。设计的探针用于分析每个外显子的突变热点。

RET基因分型实验中用了4种非标记探针（表2）：野生型（WT）探针，特定突变（MS）探针，只遮蔽单一多态核苷酸的遮蔽探针，遮蔽3个多态核苷酸的位置探针（一个密码子）。比如说，外显子13遮蔽探针（遮蔽1bp 769）在多态核苷酸位置有单个碱基的缺失。（WT13探针的“T”位置，表2）。外显子10和11位置探针与野生探针序列相比有3个核苷酸缺失，遮蔽一个致病密码子分辨密码子突变的位置。外显子10和11在致病密码子位置有同样的序列改变。比如说：外显子10，MS618/620T A C探针在密码子618-620有T A C序列，如表2描述。

PCR

用之前描述的不对称快速PCR扩增样品DNA，除了用表2中给出的引物浓度反应55个循环。外显子14反应包括2个探针，0.5μmol/L的WT14A探针和0.25μmol/L的WT14B探针。在主要实验和第二次实验一个野生型对照与每个探针一起参加反应。外显子13， WT13主要的实验反应用2个额外的对照：杂合和纯合密码子769样品。外显子10主要实验反应用620（TGC→A GC）突变样品作为正对照。

高分辨率熔解

在高分辨率熔解仪器HR-1（爱荷华科技，盐湖城，犹他州）上进行分析，将LightCycle 毛细管加入HR-1中，0.3℃/s加热。主要的实验中，RET外显子的扩增及非标记探针熔解数据从60℃到95℃采集。主要实验分析了每个外显子的扩增子及探针数据，除了外显子14。因为