细菌药敏试验及其耐药表型检测

2020/11/3
17
纸片扩散法－标准化
CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)
每年修订更改
包括质控 新药的判定标准 特殊耐药性的检测
2020/11/3
Βιβλιοθήκη Baidu
18
CLSI的法规
规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控；
在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药
物选择原则。
2020/11/3
9
敏感性分类(CLSI的定义)
敏感（Susceptible）
用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的
2020/11/3
13
纸片扩散法
1. 水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.2～7.4，做成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板；
2. 挑取孵育16 ～ 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。
2020/11/3
14
纸片扩散法
3. 用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液； 4. 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度； 5. 最后沿平板内缘涂抹1周； 6. 平板在室温下干燥3～5min，用无菌镊子或商品化的纸片分配
细菌药敏试验及其耐药表型检测
药敏试验的意义
预测抗菌治疗的效果；
指导抗菌药物的临床应用；
发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临 床医生选择合适的药物，避免产生或加重细 菌的耐药；
监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握 耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药 菌感染的发生和流行。
2020/11/3
缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误
2020/11/3
11
药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
2020/11/3
12
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。
12
258
1
1
12
小误差
敏感 5
1 0.5
1
25
9
0.25 2020/11/36
8 10 12 14 18 20 22 24 26 28 30 32 348
不同国家的判定折点 －可能不同
原因：
用药剂量不同，服药的间隔不同 评价敏感时较保守 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） 技术因素：接种、培养基
规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。
2020/11/3
19
常规测试并报告的药物分组(1)
肠杆菌科
绿脓和非肠杆菌科
一级
氨苄西林
头孢他啶，庆大霉素
头孢唑林，庆大霉素
替卡西林，哌拉西林
二级
阿米卡星
阿米卡星
氨苄西林/舒巴坦
头孢吡肟，头孢哌酮
阿莫西林/克拉维酸
氨曲南
MIC 5倍以上。
耐药（Resistance）
用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
2020/11/3
10
敏感性分类（2）
中介 (Intermediate)
MIC接近血、体液中药物的浓度，治 疗反应率低于敏感株
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
2
药敏试验
MIC：在与微生物生长速率有关的特定 时间间隔内，通常是18～24小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓度。
对倍稀释的优点：
操作容易 敏感株的MIC呈正态分布 区分异常(R)与敏感(S)的菌群
2020/11/3
3
药敏试验折点的建立
1. MIC的分布 2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 3. 临床疗效和细菌清除率 4. 抑菌圈直径的分布 ………定抑菌圈折点
2020/11/3
6
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC R I
S
2020/11/3
耐药
中介 敏感
D 1 d2 抑菌圈直径（mm)
7
抑菌圈直径与MIC的关系
MIC (ug/ml)
>256
12
3
5
256 128
2 2 耐药
22
2
1
小误差
极重要误差
64
32
1
1
小误差
中介
小误差
16
8
4
2
重要误差
二级 红霉素类
万古霉素
克林霉素，万古霉素
三级 氯霉素
庆大霉素
2020/11/3
21
常规测试并报告的药物分组(3)
一级 二级 三级
流感嗜血杆菌
氨苄西林，青霉素 复方磺胺 头孢呋肟，头孢噻肟 头孢他啶，氯霉素 阿奇霉素，头孢克罗 环丙沙星，亚胺培南
肺炎链球菌
青霉素，红霉素 复方磺胺 氧氟沙星，四环素 万古霉素 氯霉素，利福平 利福平，四环素
统计学的线性回归 计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率)
2020/11/3
4
2020/11/3
20 15 10 5 0
MIC的分布
0.008 0.032 0.125
0.5
2
8
32 128 512
5
药代动力学和药效学
药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄 药效学：药物对机体的作用
时间依赖型（％T>MIC〕：β-内酰胺类，大环内酯类 浓度依赖型（AUC/MIC比率〕：AGS, FQ 这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案
器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm， 纸片距平板内缘大于15mm。
2020/11/3
15
纸片扩散法
7. 35℃孵育16～24小时量取 抑菌圈直径；
8. 根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感、 中介、耐药。
2020/11/3
16
纸片扩散法－影响因素
MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间
头孢呋肟，头霉素
环丙沙星，亚胺培南
头孢噻肟，头孢曲松
替卡西林/克拉维酸
环丙沙星，亚胺培南
妥布霉素，复方磺胺
替卡西林，哌拉西林
三级
氨曲南，头孢他啶
头孢曲松
卡那霉素，奈替米星
氯霉素，奈替米星
妥布霉素
四环素，氯霉素
2020/11/3
20
常规测试并报告的药物分组(2)
葡萄球菌
肠球菌
一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林