细菌药敏试验及其耐药表型检测

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第章细菌药敏试验及其耐药表型检测

第章细菌药敏试验及其耐药表型检测细菌药敏试验是临床细菌感染治疗中非常重要的检测手段，通过该技术可以检测不同抗生素对细菌的敏感性，进而为合理使用抗生素提供科学的依据。

然而，在临床应用过程中，随着抗生素不合理使用的增加，细菌耐药性也随之快速发展。

因此，针对不同耐药表型的检测越来越受到关注。

一、细菌药敏试验细菌药敏试验是一种用于判断细菌对不同抗生素敏感性的方法。

常见的细菌药敏试验方法包括纸片扩散法、E测试、革兰氏染色法、微量稀释法等。

其中纸片扩散法是最常用的一种方法，其原理是将待检细菌涂在琼脂平板上，然后在板上放置一些含有不同抗菌药物的试纸，细菌耐药性差的部分会被试纸上的抗生素杀灭，出现纯净孔（抑菌圈），通过抑菌圈的直径可以初步判断细菌对抗生素的敏感性或耐药性。

细菌药敏试验有很多应用价值，如能够帮助医生选择合适的抗生素治疗细菌感染，避免了不必要的抗生素使用，同时也可作为科研人员研究细菌抗药机制的工具，为抗菌药物的开发提供依据。

二、耐药表型检测随着细菌抗药性问题的不断加重，对不同耐药表型检测的需求也越来越迫切。

耐药表型是指细菌对特定抗生素的耐药情况。

由于不同的细菌及其不同的菌株对抗生素的敏感程度有所不同，因此抗菌药物在应用过程中会出现不同菌株对不同药物的耐药表型。

目前，针对不同耐药表型检测的方法主要有两种：基于分子生物学技术的方法和基于药敏试验的方法。

1. 基于分子生物学技术的方法基于分子生物学技术的方法是检测细菌耐药性最常用的方法之一。

该方法通过检测细菌中特定的基因或者基因片段，以此确定细菌耐药性的表型。

常见的基于分子生物学技术的方法包括PCR检测、基因芯片技术、实时荧光定量PCR等。

2. 基于药敏试验的方法基于药敏试验的方法是已经成熟的检测方法之一，其通过将药敏试验的结果与临床药物疗效相结合，进而确定细菌耐药性表型。

通过检测不同抗生素对不同菌株的敏感性，可以初步反映出细菌的耐药性状态。

当然，这种方法不仅涉及到耗时、耗材、人力等成本的问题，而且还受到试验条件、条件操作等方面的影响。

细菌耐药性检测方法

细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。

也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。

(2)折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC)，而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验. （3）双纸片协同试验:双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β—内酰胺酶（4)药敏试验的仪器化和自动化:全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek—2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β—内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）.临床常用头孢硝噻吩纸片法，β—内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β—内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素(包括氨基、羧基和脲基青霉素)耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因.检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR—SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0。

抗菌药物敏感试验与细菌耐药性检课件

相加作用：它们联用时的效果等于单用两种抗生素效果之和； 60％～70％
无关作用：两种抗生素联用的效果，仅相当于其中一种具有较强作用的抗生素的效果；
拮抗作用：两种抗生素联用时的效果反而小于它们分别使用时的效果之和。 10％～15％
32
抗菌药物协同作用发生原理
两种抗菌药物作用部位不同： β－内酰胺类抗生素（抑制细菌细胞壁合成）与氨
因此细菌培养及药敏试验报告只能作为临床用药的参考，应根据患者用药后的治疗反应和临床病情及时调整用药。
医学检验的灵魂是与临床沟通。
46
新的药敏试验方法探索
流式细胞术检测抗生素最低抑菌浓度分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定
方法研究
47
细菌耐药性的发生过程：
细菌获得与耐药相关的基因基因：537 编码与耐药有关的蛋白表型：书533页
心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
20
7.经过35℃16～24h孵育。 8.取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗生素敏感、耐药、中介。
21
纸片扩散法质量控制
抑菌圈直径？
培养基：M-H平板厚度，4 mm
↗↘
细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度 ↗ ↘
药敏纸片的质量
治疗浓度
治疗浓度的下限即表中的 S
耐药
中介耐药敏感
MIC
6
第一节、抗菌药物敏感性试验方法
需氧和兼性厌氧菌
7
需氧和兼性厌氧菌药敏试验的方法
稀释法 • 肉汤稀释法（试管稀释法） • 琼脂稀释法（平板稀释法）纸片扩散法（纸片法） E-试验联合药物敏感试验
8
稀释法的特点
定量的药敏试验，测定MIC、MBC。方法比较繁琐，手工操作一般不作为常规试验，

实验七++细菌的药敏试验与耐药性检测

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。

对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。

市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。

不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4. 0.5%麦氏比浊管配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。

用前混匀。

有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。

在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测

实验七细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.2~7.4）。

对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。

市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。

不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

用前混匀。

有效期为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。

【实验内容】一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验1．原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。

在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。

2．方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

细菌药敏试验及其耐药表型检测

细菌
抗菌药物
嗜麦芽窄食单胞甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、米诺环素、氯霉素、头孢他啶、替卡西林/克拉维
菌
酸）
肠球菌属
氨苄西林、替考拉宁、环丙沙星或左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、高浓度庆大霉素（CN120）或高浓度链霉素（STH300）、青霉素、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
肺炎链球菌
苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素b(MIC)、头孢噻肟或头孢曲松b (MIC)、万古霉素、美罗培南（脑脊液标本）
• 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。即抑菌圈愈大，MIC愈小。
纸片扩散法
试验方法 1 于纯培养平板上，挑取相同的菌落4~5个 2 用无菌生理盐水制成0.5麦氏单位（真菌为2.0麦氏单位）的
细菌悬液
纸片扩散法
3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC
R v
I
S
耐药
中介敏感
抑菌圈直径（mm)
现有主要标准
• 临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）
• 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会 EUCAST • 参考标准 ISO 20776-1 （国际微量肉汤稀释法的参考方
氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、利福平、磷霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、环丙沙星或左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、苯唑西林、替考拉宁、万古霉素(MIC)、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星或环丙沙星、阿米卡星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素、庆大霉素、哌拉西林、多粘菌素

菌药物敏感性试验和细菌耐药性的检查

1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组：临床实验室标准化研究所（Clinical Laboratory
Standards I，CLSI）将抗菌药物分成A、B、C、U四组
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组 • A组：常规药敏试验的首选药物，应常规报告
1.概述
1.3.2 药敏试验用药的分组
• B组：包含针对医院感染的药物，亦可作为首选药物，选择性报告临床。（csf、多种细菌、多部位感染、A组药物过敏或耐药，流行病学目的向感控部门报告）
细菌耐药性的检测31细菌的耐药机制311细菌产生灭活抗生素的各种酶内酰胺酶氨基糖苷修饰酶312细菌改变药物作用的靶位青霉素结合蛋白pbp肽聚糖交联靶位改变dna拓扑异构酶313细胞膜通透性改变及对药物主动外排314细菌生物膜的形成3
内容与要求
• 抗菌药物敏感性试验适应症(了解) • 药敏试验常用抗菌药物选择与分组(了解) •TH药A敏N试K 验YO结U果表示及其临床意义 (掌握) • 细菌耐药机制及常见耐药菌检测(了解)
4.1.2 MRSA的检测 • 厚度为4mm的M-H琼脂平板 • 30μ g/d的头孢西丁纸片 • 0．5麦氏浊度的待测菌液 • 35℃培养24小时 • 结果判定：
抑菌环直径≤21mm即为MRSA 抑菌环直径≥22mm即为MSSA
4.重要耐药菌的检测
4.2 万古霉素耐药和低敏感性的葡萄球菌
• 1997年日本发现1株VISA
1.2.1 药敏试验目的： 1）为临床选用抗菌药物提供信息 2）对常见病原菌耐药状况监测，经验用药 3）评价新药的抗菌药效 4）分析医院感染流行株药敏谱，为单株流行提供依据。
1.概述
1.2 抗菌药物敏感性试验目的与适应症

细菌药敏试验及其耐药表型检测课件

药敏试验的分类
纸片扩散法
将抗菌药物纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，通过测量抑菌圈大小来确定细菌对药物的敏感
程度。
稀释法
通过不同浓度的抗菌药物与细菌在琼脂平板上接触，观察细菌生长情况，以判断药物的抑菌浓度。
E-test法
将抗菌药物浓度梯度试纸贴在接种了待测菌的琼脂平板上，根据抑菌圈边缘与试纸条的交汇点读出最低抑菌浓度值。
点，是临床常用的药敏试验方法之一。
04
药敏试验的结果解读
结果判读标准
敏感（Susceptible）
01
表示细菌对药物敏感，通常为≤2μg/ml或≤10μg/ml，具体标
准根据药物种类和实验方法而异。
中介（Intermediate）
02
表示细菌对药物中度敏感，通常为2μg/ml＜MIC＜10μg/ml或
某些细菌可以产生酶类，将药物分解或灭活，从而降低或消除药物的抗菌作用。
抗菌药物作用靶点的修饰
细菌通过增加或改变靶点蛋白的数量或修饰状态，降低药物与靶点的结合能力。
03
药敏试验的方法
纸片扩散法
总结词
一种常用的药敏试验方法
详细描述
纸片扩散法是一种简便、快捷的药敏试验方法，通过将含有一定浓度的抗菌药物的纸片贴在接种了待测菌的琼脂平板上，观察细菌周围的抑菌圈大小，判断细菌对药物的敏感程度。
细菌药敏试验及其耐药表型检测课件
目录
• 细菌药敏试验概述 • 细菌耐药性及耐药表型 • 药敏试验的方法 • 药敏试验的结果解读 • 耐药表型检测的应用 • 展望与未来发展方向
01
细菌药敏试验概述
药敏试验的定义
• 药敏试验：指通过实验室方法检测细菌对抗生素等抗菌药物的敏感程度，为临床医生提供抗菌药物选择依据的过程。

抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测

13
操作方法：
1. 将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm
的平板，其厚度 4mm。
14
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。
15
3. 将菌置于无菌生理盐水中，校正其浊度于 0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
1.5×108CFU /ml
16
4.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
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纸片扩散法质量控制

抑菌圈直径？
↗ ↗ ↘ ↘
培养基：M-H平板厚度，4 mm

细菌悬液：0.5麦氏标准的细菌浓度
药敏纸片的质量

各抗菌纸片中心距离应大于24mm，
纸片距平板内缘应大于15mm。 ↘ 9cm的平板贴6个
↗

培养时间 ↗ 质控菌株
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纸片扩散法的特点

根据抑菌圈的直径，依照CLSI标准，作出敏感、耐药、和中介的判断。为‘‘ 定性”结果。

缺点：E试条较昂贵;
29
四、联合药物敏感试验
联合药物意义

用于病原菌尚未确定的急、重症感染的经验治疗,以扩大病原治疗的覆盖面治疗多种细菌所引起的混合感染

对于某些耐药菌可取得协同抗菌作用
减少或推迟治疗过程中细菌耐药性的产生
避免药物达到毒性剂量。
30
两种药物的联合使用的效果

增强作用：两种抗生素联用的效果大于它们单独使用时的效果之和； 20％～25％
4 格平板
耐药：含药格菌落数≧1%对照格。

抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测

2.试验方法及结果判读
三、实验内容
1、实验材料
（1）药敏纸片： ① 用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考
拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢西丁 ② 用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、阿莫西林/棒酸
（2）菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；
3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验）的检测方法及结果判读。
二、实验原理
（一）抗菌药物敏感性试验检测
（二）细菌耐药表型检测
（一）抗菌药物敏感性试验
四种方法
1、纸片琼脂扩散法（K-B法） 2、稀释法（1）肉汤稀释法（2）琼脂稀释法 3、E-test法 4、联合药敏试验
纸片琼脂扩散法
1.基本原理
2、试验方法
MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常用。
头孢西丁纸片扩散法解释标准
葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测（D-test）
1.基本原理：
对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林霉素耐药。
2、什么叫D-test？该项检测有何意义？
2.试验方法
7
3.结果判读
用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介（I）还是耐药（R）。
4.注意事项
（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位；（2）菌液调配好后应在15min内接种完；（3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴
药敏纸片；（4）贴完纸片后不能再移动纸片；
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验

细菌耐药表型的检测方法

（5）大肠沿着菌株划线的生长表明碳青霉烯水解酶的产生。
6.改良的Hodge试验：检测碳青霉烯酶活性的表型试验，在检测KPC方面有>90％的敏感性/特异性，检测其他碳青霉烯酶时敏感性/ 特异性不定（如：低水平的金属酶）。
7. 改良Hodge试验的质量控制(2009年 CLSI:M100-S19.APPB.124)：随患者菌株每天检测。
＊＊NA：不可用（本试验不适用于筛查）
4.什么时候做改良Hodge试验？
• 如果头孢噻肟、头孢他啶和 /或头孢曲松全部“R”。
• 注：头孢比肟对于碳青霉烯酶产生株的结果是不稳定的。
•
MIC（μg/ml) 抑菌圈(mm)
• 厄他培南 2
19-21
• 亚胺培南＊ 2-4
NA ＊＊
• 美洛培南 2-4
16-21
（3）35℃孵育18-24h，如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。
D-Test试验耐药表型判断
耐药机制
红霉素克林霉素基因型
―――――――――――――――――――――――
泵出(MS)
R
S
MSRA
核糖体基因诱导变异（ermC为主）
(iMls) R
D-Test(+)
核糖体基因结构变异 (cMLS) R
※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法).
AmpC酶新的检测方法
4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测（1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法
操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，
在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。（3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。（4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。

(推荐)细菌耐药性检测方法

（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。

检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。

药敏实验常见问题、常见耐药机制及耐药表型解读

药敏实验常见问题、常见耐药机制及耐药表型解读药物敏感性试验可以监测细菌对抗药物的敏感性，为临床合理用药、新药研究、监测耐药变迁、发现耐药机制等提供客观依据。

常见问题为什么临床微生物学实验室有时候出具的报告只有细菌名，而没有出具药敏结果？目前国内药敏报告主要参照CLSI M100标准出具药敏报告。

该标准只给出了临床常见细菌诸如肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、某些厌氧菌的判读标准。

若鉴定细菌不在该文件范围内，则无法给出药敏结果。

如单核细胞增生李斯特菌、诺卡菌、布鲁菌等特殊细菌，需要特殊的培养基或培养条件，而许多实验室不具备这些条件，因此只能出具细菌名。

尽管只有细菌名称，但对临床抗感染治疗依然具有指导意义。

在条件允许的情况下，检验人员可以尽可能多地向临床提供该菌相关的知识，如该菌的染色性质（革兰阳性还是阴性）、球菌还是杆菌、药敏情况等。

如何解释部分抗菌药物体外敏感试验的药物种类与临床实际使用抗菌药物种类不一致？抗菌药物体外敏感试验中，由某一药物的药敏结果可以“预测”或“指示”其他药物敏感或耐药的药物。

若存在这种预测药或指示药，则无须加做药敏试验。

临床需要掌握相关专业知识，实验室需向临床解释结果。

表1 药敏试验常用试验药物及代表药物如何解释抗菌药物在体外敏感试验显示敏感，临床治疗却无效？常见原因如下：①分离株如果是定植菌、污染菌，则无须抗菌药物治疗。

治疗无效是正常情况。

②患者免疫力、基础性疾病不改善，临床治疗常无效。

③如果有感染灶未发现或未予清除，单纯的抗菌药物治疗可能无效。

④实验室结果应准确无误。

如果耐药错误判断为敏感，则治疗无效。

⑤“90~60规则”提示，有10%的患者敏感时治疗无效。

如果临床统计结果与该规则比较一致，则应该视为正常情况。

⑥药敏试验适用于浮游菌感染。

如果是生物膜感染，则药敏试验不适用。

⑦药物使用要符合说明书剂量，与CLSI M100等文件剂量一致或更高。

低于CLSI M100等文件的剂量建议，则敏感可能无效。

细菌耐药性检测方法

（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。

2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。

临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。

如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。

检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。

抗菌药物敏感性试验和细菌耐药性检查课件

细菌的外膜上特殊的药物泵出系统使菌体内的药物浓度不足导致耐药。铜绿假单胞菌外膜上有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素，是产生耐药的重要机制。
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细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变通过靶位的改变使抗生素不易结合，是耐药发生的重要机制。
1.核糖体靶位酶亲和力的改变导致对四环素、红霉素、喹诺酮、氨基糖苷类、甲氧嘧啶、磺胺类抗生素耐药。
2.核糖体位点的改变引起对大环内酯类和林可霉素类抗生素耐药。
3. DNA螺旋酶的改变是对喹喏酮类抗生素耐药的重要机制。
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细菌耐药性的生物化学机制
. 药物作用靶位的改变 4.核酸合成途径中序列靶位酶的改变对磺胺- 甲氧嘧啶
耐药，二氢叶酸还原酶改变致甲氧嘧啶耐药。 5. PBP发生改变 , β - 内酰胺类抗生素不能结合或亲和
. K-B法试验程序
挑取菌落转种肉汤
比浊
涂布平板上放置药敏纸片量取抑菌圈大1小
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1、常见菌 2、苛氧菌 3、厌氧菌 4、酵母菌 5、真菌
. E试验法
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. 联合药物敏感试验意义 . 联合抑菌试验 . 最低杀菌浓度测定
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常用敏感性试验的方法
• 监控治疗效果试验：
• 1、血清抗菌药物浓度测定(serum antimicrobial level)
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四、铜绿假单胞菌
• 铜绿假单胞菌对多数抗生素不敏感，呈现明显的固有耐药性。长期以来假单胞菌的固有耐药性认为是由于该菌具有外膜的低通透性(主要是外膜
微孔蛋白突变，阻止抗生素由外膜进入胞质)，最近的研究表明，假单胞菌耐药的产生机制与细菌具有能量依赖性的主动外排系统有关，也可能同时存在其他耐药机制。由于在长期抗生素治疗过程中铜绿假单胞菌可能发生耐药，因此，初代敏感的菌株在治疗3~4周后，测试重复分离株的抗生素敏感性是必要的。目前，对假单胞菌感染多采用联合治疗，如选用一种 β 内酰胺类抗生素与一种氨基糖苷类或一种喹诺酮类抗菌药物联合。

细菌耐药表型的检测方法

四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法
1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。（2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。
附：鉴定卡他球菌方法
1.40%KNO3浸湿滤纸条，贴于羊(马)血平板上，周围点种待测菌，如果菌落周围出现大的绿色环，即为阳性。 2.丁酸酯酶检测法：购买丁酸酯酶检测纸片(梅里埃公司生产)，涂细菌于纸片上，如几分钟内出现绿色为阳性。
金属β-内酰胺酶的表型检测方法
2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H 平板上。（2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。（3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。
耐药机制红霉素克林霉素基因型 ―――――――――――――――――――――――
泵出(MS) 核糖体基因诱导变异（ermC为主）核糖体基因结构变异（ermA为主） R (iMls) (cMLS) S R R MSRA D-Test(+) R
―――――――――――――――――――――－－
七、其它耐药表型检测 1.MRSA，MRCNS 2.VRE 3.PRP 4.泵出机制：美平/泰能（MIC）≥1

细菌药敏试验及其耐药表型检测

检测方法有微生物培养法、碘－淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。
葡萄球菌属 – 青霉素
方法 MIC
纸片扩散法
敏感 0.12 mg/ml
29 mm
中介 -
-
耐药 0.25 mg/ml
28 mm
CLSI M100-S20. Table 2C.
诱导β-内酰胺酶的检测
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时
缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，
分枝杆菌
评价药物体外抗菌活性的指标
MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，S MIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误
药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。
E test 法
细菌生长区
E test 塑料条
256
128
椭圆形
细菌生长
抑制区
8
判读抑菌浓度