细菌药敏试验及其耐药表型检测

抗菌药物敏感性试验解释分类(CLSI的定义)
• 敏感（Susceptible）
• 用常规用量治疗有效 • 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。
• 耐药（Resistance）
• 用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 • MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
•中介 (Intermediate)
• 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与 该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。 即抑菌圈愈大，MIC愈小。
纸片扩散法
试验方法 1 于纯培养平板上，挑取相同的菌落4~5个 2 用无菌生理盐水制成0.5麦氏单位（真菌为2.0麦氏单位）的
细菌悬液
纸片扩散法
3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；
肺炎链球菌
青霉素，红霉
复方磺胺 氧氟沙星，四
万古霉素 氯霉素，利福
利福平，四环
全国耐药监测网要求网点医院上报的 药物
细菌
抗菌药物
肠杆菌科
葡萄球菌属 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 洋葱伯克霍尔德 菌
氨苄西林、哌拉西林、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/ 舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦a、头孢他啶、头孢唑啉、头孢呋辛、头 孢吡肟、头孢西丁、头孢噻肟、环丙沙星或左氧氟沙星、美罗培南或亚胺培南、甲氧苄 啶/磺胺甲恶唑、氨曲南、呋喃妥因（尿标本）
法，所有其他方法均需与其比较） ISO 20776-2（强调如何正确地将其他方法与
ISO 20776-1 方法相比较的国际标准）
不同国家的判定折点 －可能不同
• 原因：
• 用药剂量不同，服药的间隔不同 • 评价敏感时较保守 • 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） • 技术因素：接种、培养基
在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（CLSI）制定 的抗菌药物选择原则。
• MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反 应率低于敏感株
• 药物生理浓集部位有效 • 加大用药剂量可能有效
• 缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结
果的判定错误
•非敏感：用在仅有敏感解释，无中介或耐 药解释的细菌。受试菌MIC值高于或抑菌 圈直径低于敏感解释折点时称为不敏感。
不敏感并不意味着分离菌存在耐药机制，也可能是在 以前公认的野生型敏感结果分布范围内； 对于结果为“非敏感”的菌株，应确认证实细菌鉴定 是否正确和抗菌药物敏感性的试验结果。
非苛养菌药物分组
肠杆菌科
A
氨苄西林
头孢唑林，庆大霉素
B
阿米卡星 阿米卡星
氨苄西林/舒巴坦
阿莫西林/克拉维酸
头孢呋肟，头霉素
头孢噻肟，头孢曲松
环丙沙星，亚胺培南
替卡西林，哌拉西林
C
氨曲南，头孢他啶
卡那霉素，奈替米星
妥布霉素
四环素，氯霉素
绿脓和非肠杆菌科 头孢他啶，庆大霉素
替卡西林，哌拉西林
头孢吡肟，头孢哌酮 氨曲南 环丙沙星，亚胺培南 替卡西林/克拉维酸 妥布霉素，复方磺胺
头孢曲松 氯霉素，奈替米星
非苛养菌药物分组
葡萄球菌
肠球菌
A 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林
B 红霉素类
万古霉素
克林霉素，万古霉素
C 氯霉素
庆大霉素
苛养菌药物分组
流感嗜血杆菌
A 氨苄西林，青霉素 素
复方磺胺
B 头孢呋肟，头孢噻肟 环素
头孢他啶，氯霉素
C 阿奇霉素，头孢克罗 平
环丙沙星，亚胺培南 素
定性测定：纸片琼脂扩散法（disk agar Bauer test）
定量测定：
• 稀释法(肉汤、琼脂)（dilution test）手工、仪器 • 抗生素连续梯度法 (E-test )
diffusion test，Kirby-
纸片扩散法（Kirby-Bauer法）
•将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平 板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后会不 断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片 周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明的抑菌圈。
药物分组说明
• A组 首选试验、常规报告的药物 • B组 首选试验、选择性报告的药物 • C组 补充试验、选择性报告的药物 • U组 仅用于泌尿道感染的补充试验的药物 • O 组（其它）对该组细菌有临床适应症但一般不允许常规试验与报告的药
物 • InV（研究性）：对该菌群作研究用且尚未经FDA批准的药物
细菌
抗菌药物
嗜麦芽窄食单胞 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、左氧氟沙星、米诺环素、氯霉素、头孢他啶、替卡西林/克拉维
Hale Waihona Puke Baidu
菌
酸）
肠球菌属
氨苄西林、替考拉宁、环丙沙星或左氧氟沙星、万古霉素、红霉素、高浓度庆大霉素 （CN120）或高浓度链霉素（STH300）、青霉素、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
肺炎链球菌
苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素b(MIC)、头孢噻肟或头孢曲松b (MIC)、万古霉素、美罗培南（脑脊液标本）
• 剂量依耐性敏感（SDD）：指依耐于患者所用剂量的菌株敏感性。当菌株的药敏 结果在“SDD”范围时，临床应提高给药方案(更高剂量和/或更频繁给药)
为什么新增剂量依耐性敏感折点？
• 临床医生大多将中介片面的理解为耐药； • 使药敏报告更加精确，利于临床医生更好的选择药物； • SDD提供了具体的剂量标准：MIC位于SDD范围内 时，相对高的剂量会达到治疗效果；MIC位于S范围 内时，相对低的剂量即可达到治疗效果； • SDD被公认为可用于抗真菌的治疗； • SDD与抗生素管理目标一致：在治疗时强调适当的 剂量和使用时间。
纸片扩散法－标准化
• CLSI M100 抗菌药物敏感性试验的实施标准（每年修订 更新）
M02 抗菌药物纸片法敏感性试验实施标准 M07 需氧菌抗菌药物稀释法敏感性试验实施标准 （每三年修订更新）
• 包括QC方案 • 新药的判定标准 • 特殊耐药性的检测
CLSI的法规
• 规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控； • 抗菌药物建议分组 规定常规测试报告的抗生素； • 不同的药判定标准不同； • 不同的菌判定标准也不同。
抑菌圈直径的分布
…定抑菌圈折点
统计学的线性回归
计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率)
简述
1 确定MIC分布和流行病学界值（ECV） 2 关注药效的PK/PD参数和药效相关的目标值 3 使用药代动力学的蒙特卡洛拟合分析评估达标率 4 如果可能，用临床研究中获得的预后信息来验证 5 检查临床折点是否与PK/PD折相似并且没有将野生 型MIC分布分隔开 6 一旦确定了MIC折点，则可进行其与抑菌圈直径相 关性研究
氏菌
林/舒巴坦、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、萘啶酸
预报用药(一)
测试药 菌名 • 苯唑西林 葡萄球菌 • 四环素 所有（除葡
萄球菌和不 动杆菌〕
• 红霉素 G＋球菌
• 克林霉素 所有
推测其他药物的敏感性 所有β-内酰胺类 多西环素，米诺环素
罗红霉素，克拉霉素， 阿奇霉素 林可霉素
预报用药(二)
测试药
菌名
氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢唑啉、头孢西丁、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、利 福平、磷霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、环丙沙星或左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、苯 唑西林、替考拉宁、万古霉素(MIC)、利奈唑胺、呋喃妥因（尿标本）
头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、氨曲南、替卡西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉 西林/他唑巴坦、左氧氟沙星或环丙沙星、阿米卡星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素、 庆大霉素、哌拉西林、多粘菌素
细菌的耐药； • 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，开展耐药菌感染的流行病学调查，
以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。
药敏试验折点的建立
MIC的分布 在与微生物生长速率有关的特定时间间隔
内，通常是18～24小时，能够抑制被测菌生长的最低药物 浓度。
药代动力学和药效学 … 定 MIC的折点
临床疗效和细菌清除率
肉汤稀释法
• 试验方法
取无菌试管26支，排成两排。另取三支试管，分别作为肉 汤对照管、待检菌生长对照管和质控菌生长对照管。每管加 入无菌MH肉汤2ml，在第一管加入经MH肉汤稀释的药物原液 （256mg∕L）2ml混匀，然后吸取2ml至第二管，混匀后再吸 取2ml至第三管。如此连续对倍稀释至第13管，并从第13管中 吸取2ml弃去。此时各管含药浓度依次为128、64、32、16、8、 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg∕L。第1 排试管每管加入待检菌菌液（1×107CFU∕ml）0.1ml，第2排 试管每管加入标准菌菌液（1×107CFU∕ml）0.1ml，最终接种 量约为（5×105CFU∕ml）.置35℃培养箱中孵育18～24h，观 察有无细菌生长
链球菌属（除肺 青霉素、红霉素、克林霉素、万古霉素、美罗培南、头孢呋辛、头孢噻肟或头孢曲松、 炎链球菌外） 左氧氟沙星、莫西沙星
嗜血杆菌属
氨苄西林、环丙沙星或左氧氟沙星、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢噻肟或头孢曲松 或头孢他啶、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、阿奇霉素、氯霉素
沙门氏菌和志贺 氨苄西林、头孢曲松或头孢噻肟或头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、氨苄西
MIC与抑菌圈直径的线性关系
Log2. MIC
R v
I
S
耐药
中介 敏感
抑菌圈直径（mm)
现有主要标准
• 临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）
• 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会 EUCAST • 参考标准 ISO 20776-1 （国际微量肉汤稀释法的参考方
正确阅读纸片法结果
• 读取完全抑制的抑菌圈直径，包括纸片的直 径 • 抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显的 可见细菌生长区域 • 在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略
纸片扩散法－影响因素
• 接种菌量 • 细菌生长率 • 抗生素含量、扩散性 • 平皿厚度 • 温度，预孵育时间
药敏试验的方法学
• 药物敏感试验包括体外抗菌敏感试验、体内抗菌药物活性的测定和药物浓 度的测定。
• 体外抗菌敏感试验（antimicrobial susceptibility testing in vitro）包括抑菌试验、杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌所产生的
抗生素灭活酶。
药敏试验的方法学
• 抑菌试验
4.涂布整个MH平板表面,反复3次，每次旋转平板60°,最后沿平板 内缘涂抹1圈，使整个平板涂布均匀；
5.涂布菌液的平板在室温下干燥3～5min后，用无菌镊子或纸片分 配器将药敏纸片贴于琼脂表面，每张纸片间距不小于24mm， 纸片的中心距平板边缘不小于15mm。90mm直径的平板宜贴 6张药敏纸片。
细菌药物敏感试验及其 耐药表型检测
抗菌药物敏感试验
•测定抗菌药物在体外对病原微生物有 无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药 物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验 （AST）。
药敏试验的意义
• 预测抗菌治疗的效果； • 指导抗菌药物的临床应用； • 发现或提示细菌耐药机制的存在，提供选择药物的依据，避免产生或加重
氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡 肟、环丙沙星或左氧氟沙星、美罗培南或亚胺培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、 甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、米诺环素、多粘菌素
甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、头孢他啶、米诺环素、美罗培南、氯霉素、左氧氟沙星、替卡西 林/克拉维酸
全国耐药监测网要求网点医院上报的 药物
• 氨苄西林 • 青霉素G
肠球菌 葡萄球菌
• 头孢噻吩
肠杆菌科
• 奈啶酸 • 万古霉素
肠杆菌科 所有
推测其他药物的敏感性
青霉素 氨苄西林，美洛西林 替卡西林 头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗 所有氟喹诺酮类 替考拉宁
药敏试验-稀释法
• 即最低（或最小）抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测定 。 • 基本原理 在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍） 稀释后，定量接种待检菌，35℃孵育24h后观察。抑制 待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待 检菌的最低抑菌浓度。 • 稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基 者为肉汤稀释法。
纸片扩散法
6. 将贴好纸片的MH平板置35℃ 孵育18～24 小时后,用标尺量取抑菌圈直径。
结果判断 根据抑菌环的大小，按照CLSI 标准判读(不同的抗生素其抑菌圈大小 的标准不一致)，判断为敏感(S)、中介 (I)、耐药(R)。某些细菌可蔓延生长至某
种抗生素的抑菌圈内,如磺胺药抑菌圈内可 能有微量的细菌生长,可忽略不计,应以外圈 为准。