血清γ-球蛋白的盐析分离

实验名称：血清γ-球蛋白的盐析分离

实验目的

（1）了解蛋白质分离纯化的一般方法。

（2）掌握硫酸铵盐析法从动物血清中分离γ-球蛋白。

原理

中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。

操作方法

1．取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液(0.01mol／L pH7.0)5ml，混匀，滴加(边加边搅拌)饱和硫酸铵4ml(此时溶液硫酸铵饱和度约为20％)。静置20min以3 000r／min离心15min，沉淀为纤维蛋白(弃去)；上清液中含清蛋白、球蛋白。

2．取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml(方法同前)，此时溶液硫酸饱和度为50％，静置20min，以3 000r ／min离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。

3．倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液(0．01mol/L，pH7．0)，再加饱和硫酸铵3．2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33％，静置20min，以3 000r／min离心15rain除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。

4．将所得γ-球蛋白沉淀溶解于1ml磷酸盐缓冲液（0.0175mol/l，pH6.7）中备用。

试剂和器材

一、试剂

(1)饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取(NH4)2SO4 760g，加蒸馏水至1000ml，加热至50℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。

(2)磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L pH7.0，内含0.15mol／L NaCl，简称PBS)：取 0.2mol／L Na2HP04溶液30.5ml，0.2mol／L NaH2P04溶液19.4ml，加NaCl 8.58，加蒸馏水至1000ml。

(3)磷酸盐缓冲液(0.0175mol／L，pH6.7，不含NaCl，简称PB)：取0.2mol／L Na2HP04溶液43.5ml，取0，2mol/L NaH2P04溶液56.6ml混合。用蒸馏水稀释至1000ml。

二、器材

离心机、离心管、玻棒、吸管等。

注意事项

（1）在进行盐析时，为了防止硫酸铵一次性加入或搅拌不均匀造成的局部过饱和影响盐析的效果，一定要边滴加边搅拌。也不能过于剧烈，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。

（2）所添加的硫酸铵应为化学纯或更高纯度，否则夹带的杂质会使硫酸铵的浓度不准确，甚至引起蛋白质和酶的变性。添加硫酸铵后，要使其充分溶解，至少放置30min以上，待蛋白质沉淀完全，然后将沉淀分离。

(3)由于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，所以盐析操作一般可在室温下进行。而某些对热特别敏感的酶，则应在低温条件下进行。

(4)在盐析条件相同的情况下，蛋白质浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引起其他杂蛋白的共沉作用。因此必须选择适当的蛋白质浓度。

思考题

（1）什么叫做分级盐析？

（2）本实验中是如何采用分级盐析获得粗品γ-球蛋白。