薄层色谱法
色谱学 第三章 薄层色谱
在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三 者是相互联系而又相互竞争的，如此构成了 整个层析分离过程 。 在薄层吸附色谱过程中，主要为物理吸附， 无选择性。因之吸附剂与多元组分溶液接触 时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位 重量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量” 会因物质种类而异），另一方面，吸附剂也 可吸附流动相分子。由于物理吸附是可逆的， 故被吸附的分子同时也可被解吸出来。
偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 对羟基偶氮苯
Ⅱ 0.61 0.28 0.18 0.11 0.04 0.01
表3-2 硅胶活度分级法 Rf Ⅲ Ⅳ 0.70 0.83 0.43 0.67 0.30 0.53 0.13 0.40 0.07 0.20 0.01 0.07
除上二种外，还有其他一些吸附剂。吸附剂品种如下： （1）硅胶：薄层色谱用为200~250目粒度，规格很多，一般如有石膏作粘 结剂，称硅胶G；石膏含量为5~20%，一般为10~13%，亦有用淀粉作粘 结剂的，称硅胶S，不加粘结剂者称硅胶H或硅胶N，为了便于观察组分的 斑点，也可在硅胶中加入荧光指示剂。如果又加有粘结剂时，则称为硅胶 GF或硅胶GF254，即吸收254nm紫外光。 （2）氧化铝：根据加有粘结剂情况不同，有H、G、HF、GF等品种。 （3）硅镁吸附剂：即费罗里硅土，使用前要在130℃下活化二小时。 （4）纤维素：长度仅为2~20微米的短纤维，分天然纤维和微晶纤维两种 形式，也可加粘合剂、一般用于亲水性物质的分离，如羟基化物等，但缺 点为不能用浓硫酸等腐蚀性溶剂进行显色。 （5）聚酰胺：这是一种使用广泛的有机吸附剂，多用于分离酚类化合物， 样品容量大，但粘结能力差，可加入纤维素或淀粉作粘结剂。 （6）烧结薄层板：这是一种多次使用的薄层板，是由200~300目石英或玻 璃粉，与200~300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂 在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高温下烧结，即成烧结板。 烧结板用一次后可用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水洗干净后烘干再 继续使用。
薄层色谱法
薄层色谱法薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
1.仪器与材料（1）薄层板市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。
自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。
最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%~0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。
使用涂布器涂布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。
玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
（2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
（3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或有双槽展开缸，展开时须能密闭，水平展开用专用的水平展开缸。
（4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出，浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
（5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。
（6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。
2.操作方法(1) 薄层板制备市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。
聚酰胺薄膜不需活化。
铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。
如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。
经典色谱法分析技术—薄层色谱法(分析化学课件)
小
极性
大
薄层色谱固定相和流动相选择
2. 流动相展开剂的选择要求
薄层色谱分离中一般要求各斑点的Rf值在0.2～0.8之间，Rf值之 间应相差0.05以上.
3. 流动相展开剂的选择方法
如果单一展开剂分离效果不好，可用两种或两种以上的单一溶剂按 照一定比例混合而成的溶剂展开,可以达到较好的分离效果.
薄层色谱固定相和流动相选择 被测组分、吸附剂和展开剂的选择原则
常用溶剂的极性顺序为：
常用吸附剂的极性顺序为：
增
增
大
大
薄层色谱固定相和流动相选择
多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐
极 性
苷类（皂苷、黄酮苷、蒽醌苷）
渐 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸
小
香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分
烷烃＜烯烃
＜二甲胺＜酯类＜酮
＜醚＜硝基化合物
类＜醛类＜硫醇＜胺 类
＜酰胺类＜醇 类＜酚类＜羧 酸类
分离原理
吸附薄层色谱分离原理
展开（分离）
分离过程：
制板→点样→展开→显色→定性定量分析
固定相--吸附剂
薄层色谱的固定相所用的吸附剂
流动相---展开剂
薄板的底端浸入到适当的流动相溶剂
吸附薄层色谱分离原理
薄 层 色 谱
点样
展开剂
吸附薄层色谱分离原理
分离原理：
展开剂在毛细管的 浸润作用下，带着 各组分沿着薄板向
薄层色谱固定相和流动相的选择
薄层色谱固定相和流动相选择
一、固定相（吸附剂）的选择
1. 选择原则 根据被分离组分的极性选择吸附剂：
被分离组分的极性强——弱极性吸附剂； 被分离组分的极性弱——强极性吸附剂；
薄层色谱固定相和流动相选择
薄层色谱法
课程：分析制样技术
薄层色谱法
一、薄层色谱法概念及原理
• 薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固－
液吸附色谱。 • 样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同， 使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显 然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而 试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。
四、注意事项
1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。
2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互 作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离 ，但不适用于酸性组分的分离。
3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开 剂的极性，从而达到分离效果的目的。
二、吸附剂与展开剂的选择
（2）展开剂：
选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比 。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小 或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。 单一溶剂极性大小顺序如下： 酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯 仿>二氯甲烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石 油醚
① 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用
而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板 放入则显色。
② 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组
分显色。
③ 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发
色谱法薄层色谱和纸色谱
将固定相涂布在玻璃板或塑料 板上形成薄层，然后用合适的 溶剂展开，实现组分的分离和
分析。
纸色谱法
将固定相吸附在滤纸上，然后 用合适的溶剂展开，实现组分 的分离和分析。
气相色谱法
适用于气体和挥发性液体的分 析，通过气体流动相将样品带 入色谱柱进行分离。
高效液相色谱法
一种高效、高分辨率的色谱方 法，广泛应用于化学、生物和
相之间的分配系数不同，因此会以不同
的速度在薄层板上移动，从而实现分离。
薄层色谱法的操作步骤
点样
将待分离的样品溶液点在薄层 板的起点处。
显色
在紫外灯下观察各组分的斑点， 或者用显色剂进行染色。
制备薄层板
将固定相涂布在玻璃板、塑料 板或铝箔上，形成一层均匀的 薄层。
展开
将薄层板放入展开槽中，用适 当的流动相展开。
色谱法薄层色谱和纸色谱
目 录
• 色谱法简介 • 薄层色谱法 • 纸色谱法 • 色谱法薄层色谱和纸色谱的比较 • 色谱法薄层色谱和纸色谱的发展趋势
01 色谱法简介
定义与原理
定义
色谱法是一种分离和分析复杂混 合物中各组分的方法，通过不同 物质在固定相和流动相之间的分 配平衡实现分离。
原理
利用不同物质在两相之间的吸附 、溶解等分配平衡的差异，使不 同物质在色谱柱上移动速度不同 ，从而实现各组分的分离。
薄层色谱法的分离效率高于纸色谱法。薄层色谱法使用涂布在玻璃板或塑料板 上的固定相，能够快速、有效地分离复杂的混合物，而纸色谱法则需要较长的 时间进行分离。
分辨率
薄层色谱法的分辨率也更高，能够更好地分离出组分相近的物质，而纸色谱法 的分辨率相对较低。
操作难度的比较
操作简便性
薄层色谱法
l点样器:
一般采用微升毛细管（定量点样毛细管： 0.5ul、1.0ul、2.0ul、5.0ul、10ul等）、微升注射
器或半自动、全自动点样器材，手动点样时建议
采用微量毛细管。
l展开缸
应用适合薄层板大 小的薄层色谱专用展开 缸（箱），展开缸有水 平式和直立式两种类型。 日常用的最多的是直立 式展开缸。它又分平底 展开缸或双槽展开缸。 双槽展开缸具有节省溶 剂、便于预平衡、可控 制展开缸内相对湿度等 有点，故此常推荐使用。 水平展开用专用的水平 展开缸。
Ø 限度检查 采用定量配制的对照品对照或对照品稀释 对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的 对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜 色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作， 峰面积不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定 检查的斑点数和限量值。
Ø含量测定 照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分 的含量。
高效薄层板（HPTCL）所使用的固定相较普通薄层 板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的 展开距离中可以达到更好的分离效果。
传统薄层板与高效薄层板的比较
平均粒度（um） 颗粒分布（um） 点样量（ul） 展距(cm) 分离时间(min) 检测限：可见光（ng）
荧光（ng） 薄层厚度（mm）
TCL 10-40 宽 大 10-15 30-200 100-1000 1-ห้องสมุดไป่ตู้00 0.2-0.3
l 定义：薄层色谱法，或称薄层层析(thin—layer chromatography），系将适宜的固定相涂布于玻 璃板、塑料或铝基片上，成一均匀的薄层；将供 试品与相应的对照物点于薄层板的一端，在展开 容器内用适宜的溶剂（展开剂）展开，使供试品 中所含成分分离，采用适合的显色剂或显色方法 显色，将供试品色谱与对照物色谱比较，或采用 薄层扫描仪扫描，以进行鉴别、检查，或含量测 定的方法。
薄层色谱法概述
展开方式
多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。
多次展开——一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。
分步展开——混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。
02
01
薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例： 硅胶板（粒度10 ～40um） 硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制0.2% ～ 0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。
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点样
01
添加标题
要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。
添加标题
手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul），微量注射器。
04
添加标题
采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。
02
03
添加标题
点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。
薄层色谱参数
原点
Lr
L。
W
参比
样品
前沿
保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。， S R 原点
同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。 在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n 。
注意：
Rf测量中一个重要的误差来源是难以确定溶剂前沿的位置，因此，引入相对比移值（Rx）。
薄层色谱法
选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅 胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺 分离亲水性化合物，选择纤维素和离 子交换纤维素及硅藻土。 一般，被分离组的极性强，选择吸附 能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强 者。
种类： • 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 • 氧化铝—有碱性、中性、酸性 • 硅藻土—为化学中性吸附剂 • 纤维素—天然多糖类 • 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形 成氢键的物质有特别的选择性
什么是TLC？
薄层色谱法（thin layer chromatography,TLC） 是将适宜的固定相喷涂（或喷雾）于玻璃板， 塑料或铝基片上，成一均匀薄层。干燥后 进行点样，展开，斑点定位；或与适宜的 对照物随行对照比较，或用薄层扫描仪扫 描，用于药物或其他化合物的分离，鉴别， 检查或含量测定等。
– 通过板上光谱图定性
• 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光 谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。 • 可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用 计算机检索定性。
– 与其他技术连用
• TLC-付里叶变换IR联用 • TLC-MS联用
• 定量方法
– 间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗 脱下来，再对洗脱液定量。 • 分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法
• TLC是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特 别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变 化的物质的分离。 • 薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样 和展开剂用量少，展开速度快。 • TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测 柱色谱过程 。 • 在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原 料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
• 选择：“相似相溶”原则 同吸附柱色谱 极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇 ＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲 烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>环己 烷>石油醚。
薄层色谱法
3
薄层色谱法
（thin layer chromatography; TLC) （一）概述 1.背景
1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一 种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色 谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高， 结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后 发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪 器化，并实现了计算机化。
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展开时的注意事项
产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是 使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶 剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展 开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 值比边缘的Rf值小，即边缘效应。
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展开时的注意事项
消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层
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六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱
1.丹皮酚； 2～5.六味地黄丸
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薄层色谱法（TLC)应用实例
二、醋酸可的松中其他甾体的检查
取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶 液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿甲醇(9︰1) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅴ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl， 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 (385︰60︰15︰2) 为展开剂，展开后，晾干，在105 ℃干燥 10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品 溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主 斑点比较，不得更深。
⑵点样
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细 管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样 点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细 线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量 过多。
薄层色谱法
4.点样过程 确定点样位置
吸取点样溶液
点样。
a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作 好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm； b.用点样设备吸取一定量的溶液； c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被 其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完 成一次点样。 注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干 后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时， 点样设备不能混用。
薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进 行定性鉴别、杂质检查和含量测定。
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第三节 在药物分析中的应用
主要用于中药、化学药物、生物制品等的定 性鉴别、杂质检查、含量测定。
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一、在鉴别方面的应用
通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证 各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的 Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照 物为同一物质。 为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开 系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一 致，则可认定两者是同一物质。
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锯齿扫描
(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄 层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光 束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两 波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的 干扰。
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化合物斑点的吸收光谱
单波长与双波长扫描曲线的比较
6.定量方法
2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站 3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种
透射法：测量反射光的强度 反射法：测量透射光的强度
L 光源；MC 单色 器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电 检测器
薄层色谱法
第二部分色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。
与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。
被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。
被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。
可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。
此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。
（1）载体对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。
硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。
常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。
加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。
TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
薄层色谱法
检验基本技能培训之薄层色谱法1简述薄层色谱法，系用栽板，如玻璃，金属或塑料薄片，上涂布或烧结以薄层物质作为固定相的液相色谱法。
采用不同的固定相，可以进行吸附、分配、离子交换和分子排阻色谱分离。
薄层色谱较纸色谱分析时间短、灵敏度高、分离能力强。
2分离原理由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着薄层渐渐上升、试样中的各组分沿着薄层在固定相和流动相（展开剂）之间不断发生溶解、吸附、在溶解、再吸附过程。
由于分配系数不同各组分在薄层上移动的距离不同，从而达到分离。
2.1比移值：Rf=ds/dmds：原点至溶质斑点中心之间的距离dm：原点至展开剂前沿的距离比移值与分配系数有关，所以利用Rf的特征值可以对组分进行定性鉴别。
影响Rf的因素主要有：溶质和展开剂的性质、固定相的性质、温度，展开方式和展开距离等。
只有在完全相同的条件下，Rf对于某一组分才是常数。
2.2相对比移值：Ris=Rf（i）/Rf（s）Rf（i）是试样至原点的距离Rf（s）是标样至原点的距离3仪器与材料3.1薄层板3.1.1自制：玻璃板要求为光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。
常用固定相有硅胶G、硅胶GF254和硅胶HF254等等。
一般要求颗粒直径5~40μm（200目以上）。
薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者是将固定相直接涂布于玻璃板上，后者是在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10%-15%煅石膏（CaSO4.2H2O在140℃加入4小时）,混匀后加水适量使用，或用适量，调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。
除另有规定外，1份固定相和3份水在研钵中向同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，在玻璃板上平稳涂110℃活化30分钟，干燥器中保存备用。
铺好的薄层板使用前应检查其均匀度，表面应均匀、平整、光滑，无麻点，无气泡，无破损及污染3.1.2市售3.2点样器有手动、半自动或自动点样器，一般采用微量注射器或定量毛细管。
3.3展开容器带盖子合适大小的展缸3.4显色剂按标准规定配置4操作方法4.1点样应在洁净干燥的环境下进行，一般应为圆点，应尽量使点样位置集中。
薄层色谱法
6、注意事项
6.5点样环境 实验环境的相对湿度和温 度对薄层分离效果有着较大的影响 （实验室一般要求相对湿度在65%以 下为宜），因此应保持试验环境的相 对恒定。对温、湿度敏感的品种必须 按品种项下的规定，严格控制实验环 境的温、湿度。
连翘薄层色谱湿度比较 （* ：连翘苷）
苍术薄层色谱图 (RH 比较)
1
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3
4
5
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7
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2、仪器与材料
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 薄层板 点样器 展开容器 展开剂 显色装置 检视装置 薄层色谱扫描仪
2.1 薄层板
2.1.1市售薄层板 2.1.2自制薄层板
2.1 薄层板
2.1.1市售薄层板 分普通薄层板和高效薄层板:如硅胶薄 层板、硅胶GF254 薄层板、聚酰胺薄 膜和铝基片薄层板等。
薄层色谱法
薄层色谱法
1、简述 简述 2、仪器与材料 仪器与材料 3、操作方法 操作方法 4、系统适用性 系统适用性 5、测定法 测定法 6、注意事项 注意事项
1、简述
概念 薄层色谱法 系将供试品溶液点样于薄 层板上，经展开、检视所得的色谱图， 与适宜的对照物按同法所得的色谱图 作对比，用于药品的鉴别、检查或测 量测定的方法。
2.1 薄层板
2.1.2自制薄层板 固定相：硅胶G、H、GF254、HF254、 硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、 微晶纤维素、微晶纤维素F254等；粒 径大小5～40µm 。
2.1 薄层板
2.1.2自制薄层板 玻板：光滑、平整，洗净后不附水珠， 晾干。
2.1 薄层板
2.1.2自制薄层板 固定相加适量的水或相应的水溶液调 成糊状，均匀涂布于玻板上。 使用涂布器应能使固定相在玻板上涂 成一层符合厚度要求的均匀薄层。
薄层色谱法
第四节 应用实例
一、六味地黄丸中丹皮酚的薄层鉴别
取本品水蜜丸6g,研碎,或取小蜜丸或大蜜丸9g,切碎,加硅 藻土4g,研匀.加乙醚40ml,低温回流1小时,滤过,滤液挥去乙 醚,残渣加丙酮1ml使溶解,作为供试品溶液.另取丹皮酚对照 品,加丙酮制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液.照薄 层色谱法附录Ⅵ B试验,吸取上述两种溶液各10μl,分别点于 同一硅胶Ｇ薄层板上,以环己烷－醋酸乙酯3:1 为展开剂,展 开,取出,晾干,喷以盐酸酸性 5％三氯化铁乙醇溶液,加热至 斑点显色清晰.供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上, 显相同的蓝褐色斑点.
3、展开
1展开方式：
c、单向二次萜展烯开类 极 d、双向二次展开 性 较 小 的 展 开 剂
含氧衍生物
萜的各类含 氧衍生物
原点：含氧衍生物
极性较大的展开剂
3、展开
2注意事项：
a、色谱槽需密闭良好 脂溶性展开剂：甘油淀粉糊 水溶性展开剂：凡士林 b、注意防止边缘效应
4、显色和定位
一般规律：日光下观察、紫外灯下观察、加显色剂
LC 薄层色谱法
平面色谱法 纸色谱
CE 毛细管电泳色谱法
吸附柱色谱 分配柱色谱 离子交换色谱 凝胶色谱
三、色谱过程
四、色谱曲线相关术语
色谱峰
W：峰宽 Wh/2：半峰宽
基线 t0：死时间 tR：保留时间 tR,：调整保留时间
第七章 薄层色谱法
薄层色谱是在平面上进行分离的一种方法,又叫平 面色谱法.通常将固定相吸附剂均匀地涂铺在表面洁 净的玻璃、塑料或金属板形成薄层,制成薄板,进行样品分离.
2、点样
3点样方法： 划线、样品记号点、点样
注：动作要轻, 毛细管或点样器不能混用, 斑点大小适当,可多次点样.
薄层色谱法
实验十七薄层色谱法一、目的要求1. 了解薄层层析分离和鉴定有机物的原理和方法；2. 掌握薄层层析分离和鉴定有机物的操作步骤。
二、基本原理薄层色谱具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点，是一种微量的分离分析方法。
它可以与光谱或质谱结合起来，是一种很有发展前途的分析技术。
薄层色谱是把吸附剂或支持物（如氧化铝、硅胶和纤维素粉等）均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，将分离样品滴加在薄层的一端，当流动相沿着含有固定相的支持物上移动时，被分离组分就在固定相与流动相之间进行分配或吸附，经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡，最后按照各个组分的差异而被分离。
三、基本操作薄层色谱中，铺薄层的板可用玻璃板，也可用塑料板。
铺在板上的吸附剂（或支持物）可分为加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板。
薄层色谱技术包括制板、点样、展开、显色等步骤。
现分述如下：1. 薄层板的制备薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果，薄层应尽量铺得均匀，厚度在0.25～0.5mm之间。
硅胶和氧化铝的粘性差，使用前必须加粘合剂。
市售的硅胶G和氧化铝G均已含有粘合剂半水石膏，可直接加入水调匀后铺层。
（a）1-玻璃板；2-厚度垫板；3-吸附剂；4-有机玻璃尺（b）1-玻璃板；2-玻璃条；3-有机玻璃尺；4-吸附剂（c）1-玻璃板；2-玻璃棒；3-控制厚度的金属丝；4-吸附剂图2.55 薄层板涂布法薄层的涂布有倾斜法和平铺法等多种方法。
倾斜法是将调匀的糊状物倒在玻璃板上，用手摇晃，使其表面均匀光滑，然后静置固化。
平铺法是将调匀的糊状物，倒在玻璃板的一端，用一根均匀的玻璃棒（直径0.6～0.8cm），两端各绕一根不锈钢细丝（0.2～0.3mm）或镍铬丝，将糊状物均匀平铺，即可涂布成均匀的一层。
涂布的时间、推移的速度力求均匀一致，最好一次推移完毕，不宜来回操作，如（图2.55c）。
按上述方法涂好板后，静置让其固化晾干。
经室温干燥的薄层还要活化，所谓“活化”就是在高温除去水分，硅胶薄层和纤维薄层要在110℃下干燥1小时，氧化铝薄层在80℃烘烤半小时，聚酰胺薄层要在110℃下干燥5min。
薄层色谱法(TLC)
254nm和256呈现荧光背景
二薄层色谱操作过程
1.薄层制备（铺板） 1份吸附剂（硅胶/氧化铝）+3份粘合剂+水→硫 钵中搅拌均匀条糊状（无气泡和板结）→均匀涂 布薄层板 硅胶G：自含粘和剂（含5%-10%的煅石膏），仅 加水 硅胶H：不含粘和剂，需另加CMC(0.4%-1%）的水 溶液，需放置沉降纤维)
3.点样——成功分离和精确定量的关键
点样要求： 点样原点应小而圆，距板边缘2cm， 需要可多次点样（每次挥干后），防止边缘效应 点样量勿超载，防止拖尾 点样勿伤及薄层表面
点样装置：容量毛细血管
自动薄层色谱点样仪
4.展开
展开原理：差速迁移 展开方式：上行展开，75°夹角 展开过程： 展开室预先用展开剂饱和，平衡系统→点样薄板一端 浸展开剂展开（距边缘0.5~1cm）→挥尽溶剂
3.载板
具一定机械强度，化学惰性，耐一定温度，表
面平整，厚度均匀，价格便宜
玻板：5cm×10cm ,10cm×20cm ,20cm×20cm
光滑、平整、洗净后不附水珠、干燥
4.粘结剂
作用：加强固定相颗粒的附着力，增加薄层板润湿性改善 色谱分离 1）无机粘结剂：煅石膏 含粘结剂固定相：硅胶G——含13~ 15%煅石膏G——
2溶解、样品溶 液稀释和浓缩、均相溶液制备、化学衍生化。
HPLC:预处理复杂而严格
TLC:样品预处理较简单
3.进样
HPLC:对溶样溶剂和样品浓度要求严格 可自动进样，每次一个样品 TLC：溶样溶剂可以任意选择，点样体积是唯一需准 确控制的参数. 可自动进样，每次多个样品
4.色谱分离
HPLC: 每次进样一个，分析和平衡时间长 恒组分洗脱适于极性范围窄的样品 梯度洗脱适于极性范围宽的样品并需要更多的时间 若组分吸附则无法检测且污染柱子 反相色谱常用 使用相同固定相和流动相的R较高 TLC： 同时分析多样品，方便灵活 适于各类物质分离 正相色谱占主导 对复杂样品分离能力好
薄层色谱法
点样直径不超过 5mm，点样距离一般为 1~1.5cm 即可。 样品在溶剂中的溶解度很大，原点将呈空心环——环形色谱效应。因此配制样品溶液时 应选择对组分溶解度相对较小的溶剂。 点样方式有点状点样和带状点样。 展开 展开剂也称溶剂系统，流动性或洗脱剂，是在平面色谱中用作流动相的液体。展开剂的 主要任务是溶解被分离的物质，在吸附剂薄层上转移被分离物质，使个组分的 Rf 值在 0.2~0.8 之间并对被分离物质要有适当的选择性。作为展开剂的溶剂应满足以下要求：适当的纯度、 适当的稳定性、低黏度 、线性分配等温线、很低或很高的蒸气压一级尽可能低的毒性。 展开方式总的来讲平面色谱的展开有线性、环形及向心 3 种几何形式。 A 单次展开 用同一种展开剂一个方向展开一次，这种方式在平面色谱中应用最为广泛。 （垂直上行展开，垂直下行展开，一向水平展开，对向水平展开） B 多次展开 单向对此展开，用相同的展开剂沿同一方向进行相同距离的重复展开，直 至分离满意，广泛应用于薄层色谱法 C 双向展开 用于成分较多、性质比较接近的难分离组分的分离。 薄层展开展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二 条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定 操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边 0.5～ 1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，待展开至规定距离（一般为 10～15cm），取 出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。 显色 A 光学检出法 a 自然光（400~800nm） b 紫外光（254nm 或 365nm） c 荧光 一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在
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2.8分离较好的色谱图
• 总之：薄层色谱是一个分离机制 复杂，而影响因素较多的过程。 因此，我们在操作过程中要注意 影响质量的因素，出现问题查找 原因，做好系统实用性试验，以 得到满意的分离效果。
氨蒸气饱和的影响
展开剂相差极性大出现解混现象(或分层)
展开剂予平衡的影响
2.6温度的影响
• 在相对湿度恒定的条件下，一般在较高 温度时，Rf值高；反之，Rf值低（如图 ）。如:人参在低温时（10℃以下）分离 效果好，甘草在高温时（28℃以上）分 离效果好。
2.7其他因素影响
如果喷显色剂后,整板均不显 色,那么要考虑显色剂有问题. • 如果显色后斑点在原点未动, 那么要考虑溶剂有问题.
1 薄层色谱的规范化操作
• 1.1薄层板的制备 • 市售薄层板：临用时要活化，即110℃加热30分 钟。 • 自制薄层板：除另有规定外，取1份吸附剂和3份 水（或相应的溶剂），向一个方向研磨，研至有 些挂壁，除去表面气泡后，倒入涂布器中，移动 速度要均匀，板的厚度0.2-0.3mm,在平台上晾干 ，110℃加热30分钟进行活化。
2.4吸附剂的活性与相对湿度的影响
• 吸附剂的活性是由表面能与表面积决定的。表 面积越大，吸附力越大，活性越高。硅胶之所 以有吸附力，是由于表面有众多硅醇基，硅醇 基的活泼羟基及游离羟基与极性化合物或不饱 和化合物形成氢键所致。但硅醇基是亲水性基 团，很容易吸水形成水合硅醇基而失去活性。 因此相对湿度对其影响很大（如图）
薄层色谱法
总论：薄层色谱法是层析中应用最普遍的方 法之一.它具有分析时间短、分离能力强、灵 敏度高、显色方便、所用仪器简单、操作方 便等优点。是中药的常用鉴别方法之一，而 且在中药的鉴别中应用的越来越广乏。
• 薄层层析可分为吸附薄层层析和分配 薄层层析，我们常用的是吸附薄层层 析。吸附薄层层析的原理即不同物质 在吸附剂和溶剂之间发生连续不断的 吸附、解吸附、再吸附、再解吸附。 易被吸附的物质相对移动得慢，难被 吸附的物质相对移动的快，经过一段 时间的展开，不同物质就彼此分开， 从而形成相互分离的斑点。
1.4显色与检视
• • 喷显色剂要均匀 结果判断要准确
2 影响薄层色谱的主要因素
• 薄层色谱是一种敞开系统的色谱技术， 除材料和器材外，外界环境条件对被分 离物质的层析行为影响较大，其次由于 分析的全过程是横向的离线多步操作， 所以操作技巧也明显影响色谱质量，因 而薄层色谱是一种较难驾驭的技术。为 提高薄层色谱分离水平,需注意以下几个 影响因素.
1、2 为白芍 3、4 为赤芍 相对湿度小于30%下展开，二者不易区分， 在高湿度下80%以上展开色谱分离度提高，二者可区分开。
1-5样品 6黄连对照药材 7盐酸小糪碱，在相对 湿度低时较相对湿度较高时，分离效果好。
2.5溶剂蒸气的影响
• 薄层色谱的特点是溶剂的蒸汽在展开箱 中也参与色谱展开而形成三维的层析过 程，因此展开箱一定要饱和即预平衡。 否则影响分离效果（如图）
• 1.2点样
点样时不要刺破板面。点样后将板放入干燥器中，待溶剂完全挥干后 再进行展开。
高效板 距底边距离 8-10mm 普通板 10-15mm
圆点直径 条带宽度 点ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ距
2mm 4-8mm 5mm
3mm 5-10mm 8mm
1.3展开
• 展开剂放入展开缸后要饱和大约30分钟，展开 剂的量应以薄层板侵入5mm为宜，展距高效板 ５－８ｃｍ，普通版８－１５ｃｍ． • 注意：展开剂配制后是否分层（温度影响） • 展开剂不要重复使用 • 薄层板的放入要迅速 • 展开时不要移动展开缸
2.1供试品溶液的影响
• 供试品溶液纯度影响:如果供试品提取过 程中带来杂质太多,那么薄层色谱斑点很 难辨认（如图）。制备样品所用的溶剂 一般要求溶解度不宜太大，粘度不宜太 高，沸点适中。 • 供试品溶液浓度的影响:供试品溶液浓度 过浓,易产生拖尾或形成一条甚至展不上 去。解决办法是将供试品稀释。
供试品溶液纯度影响
供试品溶液浓度影响
2.2薄层板质量的影响
• 薄层板质量对色谱质量有很大影响，如 使用不合格的预制板或手铺不均匀的自 制板，得到的谱图很难辨认（如图）。 因此，薄层板的制备一定要均匀。
2.3上样技术的影响
• 薄层色谱的点样量无论是供试品还是对 照品均不宜过大，点样量过大斑点分离 不清（如图）。