结核与耐药结核快速诊断技术
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核菌及利福平耐药基因的快速分孒
结核菌及利福平耐药基因的快速分孒说到结核菌，这小家伙可真是个顽固的“家伙”。
它就像一个不速之客，悄悄潜入我们的身体，搞得我们不得安宁。
大家都知道，结核病可不是个好东西，它传染性强，根本就不想跟我们打个招呼就来了。
这就好比你在家里开派对，突然一个陌生人闯进来，弄得你尴尬不已。
结核菌这家伙，专门寻找机会趁虚而入。
听说它喜欢在拥挤的地方转悠，像个小骗子，悄悄溜进我们的肺部，真是个“见缝插针”的能手。
再说说利福平，这个药物在对付结核菌时可是“猛将”。
它就像武侠电影里的侠客，身怀绝技，专门来对付这些“恶徒”。
利福平的威力可不是盖的，杀菌效果相当不错。
但事情并不是那么简单，有些结核菌居然还会变得耐药，仿佛学会了“隐身术”。
这时候，利福平就有点无能为力了，搞得医生也束手无策，真让人心急如焚。
你想想，结核菌耐药的事儿就好比你拼命减肥，却总有些“顽固脂肪”不肯离去。
让人痛心不已，真是有苦说不出。
每当发现有耐药菌株的时候，医生们的心里那是七上八下，感觉自己仿佛在打仗一样。
为了能更快找到这些耐药菌，科学家们也是绞尽脑汁，寻找各种办法，想让这场战斗尽早见分晓。
这时候，快速分离技术就派上用场了。
想想吧，快速分离就像是在快节奏的生活中找到一条捷径，省时省力，真是个好帮手。
通过这项技术，医生们可以在短时间内获取结核菌的样本，然后快速进行基因检测。
这就好比用个特效显微镜，把那小家伙的“底细”一览无遗。
这样，医生们就能迅速判断出病菌是否耐药，采取相应的治疗方案，真是一举两得。
不过，要实现快速分离可不是随便说说的事儿。
得有专业的设备和技术，犹如一个武林高手需要掌握各种武功才能打败敌人。
实验室的研究人员日夜忙碌，进行无数次实验，最终才得以找到最佳的方法。
这过程就像炒菜，火候掌握得好，才能做出美味佳肴。
科学家们的努力，换来的是无数患者的希望，真是功德无量。
在这个过程中，我们还得提提实验室里的小伙伴们。
那些顽强的细菌们就像顽皮的小孩子，不断变换花样，搞得研究人员哭笑不得。
世界卫生组织《应用新一代靶向测序技术检测耐药结核病：快速通告，2023》解读
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风险$在EF!推荐的快速检测诊断技术中!有的 方案的制定!将会对提高结核病治愈率有立竿见影
技术能迅速检测出利福平耐药!但由于缺乏对应的 的效果!并由此缩短患者排菌时间!减少疾病传播$
技术快速检测细菌是否对异烟肼耐药!因此无法快 "二#?V5"技术检测SCR耐药性具有良好的
速判断患者是否患有耐多药结核病!由此诞生了,利 可靠性
目前主流的分子诊断技术产品主要针对特定药物的 鉴于?V5"技术在靶基因数量和突变类型检测
靶基因进行检测!虽然技术的可靠性已被广泛认可! 方面强大的优势!且用时较短!因此!该技术具有良
但对于尚没有建立相应检测方法的抗结核药物!在 好的应用前景$目前关于?V5"技术临床应用的数
化疗方案中选用这些药物仍具有盲目性&4'$考虑到 据还比较少!但已展现出符合预期的表现!结果可
中图分类号
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结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核分支杆菌耐药性快速检测的研究进展
近 年来从 分 子生 物学 水 平研 究 发现 ，结 核 分支
杆 菌 耐异 烟 肼 （Ｎ 氢 酶一过 氧 化物 酶 的编 码基 因 Ｉ Ｈ）
（ａ ） 或 ） ｋｔ 和（ 参与分支菌酸生物合成 的烯酞基还原 Ｇ 酶 编码 基 因 （ ｈ ｉ Ａ）改变 及 烷基 过 氧化 氢酶 的 编码 ｍ
基 因（ｈＣ） 关 ４结 核分 支杆 菌耐利 福平 （ Ｆ ） ａｐ 有 】 。 Ｒ Ｐ 是 由于其 作 用 于靶 分 子 Ｒ Ａ 多 聚酶 的 Ｂ亚 单位 编 Ｎ 码 基 因 （ｐＢ 突 变所 致 ６ ｒｏ ） ］ 。耐药 结 核 菌 ｒｏ ｐＢ基 因
９． ％和 ９％圊 ５１ ７ ０ 。有 人构建了另一类 噬菌体 ， 并建立 了 噬 菌 体 生 物 扩 增 试 验 （ｈｇａ ｉｅ ｉｏｉａｙ ｐ ａｅｍｐｌ ｄｂｏ ｇ ｌ ｔ ｆ ｌ ｃｌ
的治疗方案 ， 判断治疗是否失败并产生耐药性 ， 也便
于进 行 较大 规模 的结 核 分支 杆菌 耐 药性 调查 。近 几 年耐 药性 快速 检测取 得 了很 大进展 ， 现综 述 如下 。
核 分支杆 菌对 Ｒ Ｐ耐 药性 。Ｐ Ｒ— Ｓ Ｐ技 术是快 速 Ｆ Ｃ ＳＣ 检 测基 因突 变的重要 方法 之一 ，已成 功 地应用 于结 核 分支杆 菌 ｒｏ 、ａＧ及 ａ ｐ ｐ Ｂ ｋｔ ｈ Ｃ基 因突变 的检测 。利
３ 聚合酶链反应一 单链构 象多态性分析 （ ｉｇｅｓｒ ｎ ｏ ｐ ｓ ａ ｌ ｓｓ ｏ ｌ ｏ ｏｒ ｔｏ ｏｌ ｍ ｒ ｈｉｍ ｎａ ｙ ｉ ｆｐｏｙｍｅ ａ ｅ ｒ ｓ
将重组结核分支杆菌噬菌体和发光 自显影联合使 用， 可用于结核分支杆菌的快速药 敏试验。其检验基础
杆菌的数量进行定量 。由于噬菌体仅在 活菌 中方可增
耐多药结核病的标准
耐多药结核病的标准
耐多药结核病（MDR-TB）是一种对常规抗结核药物耐药的结核病，其治疗难度和费用都较高。
耐多药结核病的标准主要包括病原学、诊断、治疗和预防等方面的内容。
首先，从病原学角度来看，耐多药结核病的标准是指对常规抗结核药物（如异烟肼和利福平等）产生耐药性的结核分枝杆菌。
这些耐药菌株对治疗常规结核病的一线药物失效，需要采用更昂贵、更有毒副作用的二线药物进行治疗。
其次，诊断耐多药结核病的标准主要包括临床诊断和实验室检测两个方面。
临床诊断主要依据患者的症状、体征和影像学检查结果，但这种诊断方法并不十分可靠。
实验室检测则是通过培养和药敏试验来确定结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性，这是诊断耐多药结核病的金标准。
治疗耐多药结核病的标准是指采用联合用药，选择对耐药菌株敏感的二线抗结核药物进行治疗。
治疗方案的选择应充分考虑患者的耐药情况、病情严重程度和药物的毒副作用，以及患者的耐受性和依从性等因素。
治疗过程中需密切监测患者的疗效和药物不良反应，及时调整治疗方案。
预防耐多药结核病的标准主要包括加强结核病的监测和管理，规范使用抗结核药物，提高患者的依从性和治疗完成率，加强结核病的传染控制，及时发现和治疗耐多药结核病患者，防止疾病的传播和扩散。
总的来说，耐多药结核病的标准涉及病原学、诊断、治疗和预防等多个方面，对于医务人员和患者来说都具有重要的指导意义。
只有全面了解和严格执行这些标准，才能更好地预防和控制耐多药结核病的发生和传播，保障公众的健康和安全。
肺结核的结核病菌耐药与耐药性监测
肺结核的结核病菌耐药与耐药性监测肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，其特点是呼吸系统的病变。
近年来，随着抗生素的广泛应用，结核分枝杆菌的耐药性问题日益突出，给结核病的治疗带来了挑战。
因此，耐药性监测成为了预防和控制结核病的重要措施之一。
一、耐药性的定义与分类耐药性是指病原微生物对抗生素的抗性能力，即在抗生素的作用下仍然能够生存和繁殖。
根据结核病菌对抗生素的敏感性情况，可将耐药性分为多药耐药性（MDR）、广谱耐药性（XDR）和极耐药性（XXDR）。
1. 多药耐药性（MDR）：多药耐药性是指结核分枝杆菌对两种最常用的一线抗结核药物——异烟肼和利福平耐药。
这意味着治疗者在使用这两种药物时，无法有效地抑制结核菌的生长和复制。
2. 广谱耐药性（XDR）：广谱耐药性是指结核分枝杆菌除对异烟肼和利福平耐药外，还对氟喹诺酮类和吡嗪酰胺等次一线抗结核药物耐药。
广谱耐药性的出现限制了结核病的治疗选择，增加了患者的痛苦和疾病传播的风险。
3. 极耐药性（XXDR）：极耐药性是指结核分枝杆菌对目前所有已知抗结核药物耐药，除了抗结核药物，还对其他许多抗生素和化学药物也表现出耐药性。
这种情况下，治疗极耐药结核病的难度非常大，甚至几乎没有有效的治疗方案。
二、耐药性的产生原因结核分枝杆菌的耐药性主要是由以下两个方面的因素引起的。
1. 不规范的抗结核药物应用：抗生素的滥用和不恰当使用是导致结核分枝杆菌耐药性产生的主要原因之一。
例如，患者自行购买和使用药物、药物不规范的配方和使用方式等都可能导致耐药菌株的出现。
2. 抗菌药物的不合理配伍：在治疗结核病时，合理配伍和使用抗结核药物是至关重要的。
然而，由于抗菌药物的复杂性和副作用，不同抗结核药物的合理搭配并非易事，而错误的配伍可能会加速结核菌的耐药产生。
三、耐药性监测的意义与方法耐药性监测是指对结核分枝杆菌的耐药性进行系统的监测和评估。
其主要意义在于：1. 指导临床用药：耐药性监测可以为临床用药提供参考，帮助医生选择有效的抗结核药物。
结核病3种实验诊断方法比较与分枝杆菌耐药情况分析
结核病 3种实验诊断方法比较与分枝杆菌耐药情况分析摘要：目的比较结核病3种实验诊断方法，分析目前分枝杆菌耐药情况。
方法统计2018年11月到2019年11月我中心临床确诊结核病例患者痰标本涂片镜检、培养和LAMP法检测结果，并对分枝杆菌菌种及对治疗药物耐药情况进行统计分析。
结果共有76例资料齐全的结核病确诊病例入选，其中肺结核48例、结核性胸膜炎20例、结核性脑膜炎8例，分枝杆菌涂片镜检阳性率分别为39.58%（19/48）、5%（1/20）、12.5%（1/8），分枝杆菌培养法阳性率分别为45.83%（22/48）、10%（2/20）、25%（2/8），PCR检测阳性率分别为43.75%（21/48）、15%（3/30）、25%（2/8）。
经分枝杆菌菌种鉴定，人型结核分枝杆菌占66.0%（33/50）、牛型结核分枝杆菌占18%（9/50）、非结核分枝杆菌占16%（8/50）。
结论目前结核病实验诊断方法主要有涂片镜检、培养和环介导等温扩增LAMP法检测，病原菌以人型结核分枝杆菌为主，对3种主要抗结核药物的耐药率较高。
关键词：结核病；分枝杆菌；耐药性Comparison of three experimental diagnostic methods for tuberculosis and analysis of drug resistance of MycobacteriumAbstract: Objective To compare three experimental diagnostic methods of tuberculosis and analyze the current drug resistance of Mycobacterium.Methods The results of microscopy, culture and LAMP detection of sputum specimens from clinically confirmed tuberculosis patients in our center from November 2018 to November 2019 were statistically analyzed, and mycobacterium strains and drug resistance to treatment were statistically analyzed.Results a total of 76 cases with complete data of tuberculosis confirmed cases selected, 48 casesof tuberculosis, 20 cases of tuberculous pleurisy, 8 cases of tuberculous meningitis, mycobacteria smear microscopy positive rate was 39.58% (19/48), 5% (1/20), 12.5% (1/8), mycobacterium culture method positive rate was 45.83% (22/48), 10% (2/20), 25% (2/8), PCR detection positive rate was 43.75% (21/48), 15% (3/30), 25% (2/8).By mycobacterium identification, mycobacterium tuberculosis of human type accounted for 66.0% (33/50), Mycobacterium tuberculosis of bovine type accounted for 18% (9/50), and Mycobacterium non-tuberculosis accounted for 16% (8/50).Conclusion The current diagnostic methods for tuberculosis mainly include smear microscopy, culture and loop-mediated isothermal amplification LAMP detection. The pathogenic bacteria are mainly Mycobacterium tuberculosis, and the drug resistance rate of the three main anti-tuberculosis drugs is relatively high.Key words: tuberculosis;Mycobacterium;Drug resistance引言结核病是目前严重威胁人类健康的重大传染性疾病之一，近年发病率有上升的趋势，我国是世界上22个结核病高负担国家之一，发病率居世界第二位。
耐药结核病诊断和治疗
敏感性 特异性
氧氟沙星
90.7%（95% CI,， 80.1~96%）
98.1%（ 95% CI, 96.3~99%）
阿米卡星
100%（95% CI,91.8~100%）
99.4%（ 95% CI, 98.2~99.8%）
XDR-TB
92.3%（95% CI,75.9~97.9%）
99.6%（ 95% CI, 98.5~99.9%）
LPA (line-probe assay)
• LPAs 应用多重PCR扩增和反向杂交技 术，检测鉴定结核分枝杆菌复合群，并 奠定利福平、异烟肼耐药相关基因突变。
• 方便：降低了对生物安全的要求，样本 可来自痰涂片阳性的痰样本，亦可来自 临床分离株。
• 快速：1-2天即可提供结果。 • 具有高通量潜能。
初治结核中的MDR-TB比例
Figures are based on the most recent year for which data have been reported,
which varies among countries
WHO. Global tuberculosis report 2012
复治结核中的MDR-TB比例
WHO. Global tuberculosis report 2012
全球结核病疫情报告（2012-WHO）
• 发病率下降，但在2011年仍有870万新发病例； • 估计有140万人死于结核病，包括50万名妇女，
全世界妇女的主要杀手之一； • 非洲和欧洲区不能按计划实现到2015年将1990年
Am J Respir Crit Care Med. 2012, 186(12):1298-305.
结核病的诊断与抗结核治疗新进展
结核病的诊断与抗结核治疗新进展随着医学科技的不断进步和研究的不断深入，结核病的诊断与抗结核治疗也在不断取得新的进展。
在本文中，我们将探讨结核病的诊断方法和新的抗结核治疗方案。
一、结核病的诊断方法1. 临床症状与体征结核病的典型症状包括慢性咳嗽、咳痰、咯血、低热、乏力等。
体征方面，患者可能出现体重下降、纳差、肺部啰音等。
临床医生可以通过详细询问患者病史和进行体格检查来了解病情，但这些症状和体征并非特异性，因此需要结合其他方法进行诊断。
2. 结核菌素试验结核菌素试验是一种常用的结核病辅助诊断方法。
该试验通过皮内注射结核菌素（PPD），根据注射部位出现的硬结或红斑的大小和硬度来判断患者是否感染结核分枝杆菌。
然而，结核菌素试验的结果可能受到多种因素的影响，例如BCG疫苗接种、非结核分枝杆菌感染等，因此需要结合其他检测方法进行综合判断。
3. 结核病病原学检测近年来，分子生物学的进展使得结核病的病原学检测更加准确和迅速。
PCR（聚合酶链反应）技术可以检测结核分枝杆菌的核酸，其灵敏度和特异性高于传统的培养方法。
此外，还可通过基因测序等方法进行鉴定和鉴别。
4. 影像学检查胸部X线和CT扫描是常用的结核病影像学检查方法。
通过检查肺部的阴影、空洞、结节等变化，可以辅助诊断结核病。
此外，还可以利用PET-CT技术评估病变活动性，判断治疗效果。
二、抗结核治疗的新进展1. 药物疗法目前，抗结核治疗的首选药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等。
然而，由于结核分枝杆菌的耐药性问题日益严重，传统的治疗方案逐渐无法满足临床需求。
因此，近年来针对耐药结核病的新一代抗结核药物不断涌现。
例如利福昔明、贝达替尼等药物，对多药耐药结核病和极耐药结核病显示出良好的疗效。
2. 联合治疗方案联合抗结核治疗是目前常用的治疗策略之一。
根据药物敏感性测试结果，将多种抗结核药物联合应用，以降低治疗失败和耐药的风险。
此外，联合抗病毒治疗也被用于治疗HIV与结核病共感染的患者，以防止疾病的恶化和复发。
结核病治疗进展
结核病治疗进展结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，它主要影响肺部，但也可以侵犯其他部位。
多年以来，结核病一直是全球范围内的公共卫生问题，然而，随着医学研究的不断进步，结核病的治疗也取得了长足的进展。
1. 快速诊断技术的发展结核病的快速准确诊断对患者的治疗和传播的控制至关重要。
近年来，各种快速诊断技术得到广泛应用，例如PCR（聚合酶链反应）和基因Xpert测定。
这些技术可以快速检测结核菌的存在并确定其对抗药物的抗性情况，从而有助于选择合适的治疗方案。
2. 新型抗结核药物的出现传统的结核病治疗主要依赖于四种药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇），而这些药物对耐药菌的治疗效果有限。
然而，在过去几年里，新型抗结核药物如康玛平（bedaquiline）和利福平（linezolid）的问世，为多药耐药结核病的治疗提供了新的希望。
这些药物具有更强的抗菌活性，能够有效地控制药物耐药菌株的增长。
3. 结核菌疫苗研究的突破BCG疫苗是目前用于结核病预防的主要疫苗，然而其效果有限，对于成人的保护率较低。
因此，研究人员一直致力于开发更有效的结核病疫苗。
目前，一些新型结核菌疫苗已经进入临床试验阶段，包括MTBVAC和VPM1002等。
这些疫苗可以激活免疫系统产生更强的免疫反应，提高对结核病的保护效果。
4. 结核病治疗方案的优化除了新型药物的研发，结核病治疗方案的优化也是取得进展的重要一环。
对于传统的结核病治疗方案，如DOTS（直接观察治疗短程化学疗法），通过提高医疗机构和医务人员对患者治疗依从性的重视，已经取得了显著的效果。
此外，通过将耐药结核病治疗纳入国家卫生政策，并加强药物供应链的管理，也有助于提高治疗成功率。
总结起来，结核病治疗领域取得了显著的进展，包括快速诊断技术的发展，新型抗结核药物的出现，结核菌疫苗研究的突破以及结核病治疗方案的优化。
这些进展为结核病的控制和防治提供了更多选择和有效手段，并为实现全球结核病消除目标迈出了坚实的一步。
肺结核的诊断
肺结核的诊断（一）诊断方法1．病史和症状体征（1）症状体征情况：肺结核患者的症状一般没有特异性，但明确症状的发展过程对结核病诊断有重要参考意义。
体征对肺结核的诊断意义有限。
（2）诊断治疗过程：确定患者是新发现还是己发现病例。
不少肺结核患者首次就诊多在综合医院，且接受治疗，应记录首次诊断情况特别是痰排菌情况、用药品种、用药量和时间、坚持规律用药情况等，这对将来确定治疗方案有重要价值。
如果是复发患者，治疗史对判断耐药情况有参考意义。
（3）肺结核接触史：主要是家庭内接触史，对邻居、同事、宿舍等有无肺结核患者也应了解。
记录接触患者的病情、排菌情况、治疗方案和用药规律情况、接触时间、接触密切程度等。
2．影像学诊断胸部X线检查是诊断肺结核的重要方法，可以发现早期轻微的结核病变，确定病变范围、部位、形态、密度、与周围组织的关系、病变阴影的伴随影像；判断病变性质、有无活动性、有无空洞、空洞大小和洞壁特点等。
肺结核病影像特点是病变多发生在上叶的尖后段和下叶的背段，密度不均匀、边缘较清楚和变化较慢，易形成空洞和播散病灶。
诊断最常用的摄影方法是正、侧位胸片，常能将心影、肺门、血管、纵隔等遮掩的病变以及中叶和舌叶的病变显示清晰。
CT能提供横断面的图像，减少重叠影像，易发现隐蔽的病变而减少微小病变的漏诊；比普通胸片更早期显示微小的粟粒结节；能清晰显示各型肺结核病变特点和性质，与支气管关系，有无空洞，以及进展恶化和吸收好转的变化；能准确显示纵隔淋巴结有无肿大。
常用于对肺结核的诊断以及与其他胸部疾病的鉴别诊断，也可用于引导穿刺、引流和介入性治疗等。
3．痰结核分枝杆菌检查是确诊肺结核病的主要方法，也是制订化疗方案和考核治疗效果的主要依据。
每一个有肺结核可疑症状或肺部有异常阴影的患者都必须查痰。
（1）痰标本的收集：肺结核患者的排菌具有间断性和不均匀性的特点，传染性患者查一次痰也许查不出，所以要多次查痰。
菌阳患者1个痰标本涂片检查约80％阳性，2个痰标本涂片检查约90％阳性，3个痰标本涂片检查约95％阳性。
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测
结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药(MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。
作为一线抗结核药物，INH和RFP 结核病的预防、治疗方面起着重要作用。
但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。
有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。
我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG 和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。
因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。
再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。
我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下。
1 资料与方法1.1 标本来源107株临床分离株和39例肺结核病患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所。
107株临床分离株按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐SM。
65例肺结核病患者涂阳痰标本根据临床症状、涂片结果、胸部X线和培养结果确诊，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。
1.2 引物序列为1.3 方法1.3.1 dNA的提取用传统酚／氯仿抽提法提取标本中DNA。
1.3.2 PCR扩增采用25 μl反应体系，4xdNTPs终浓度为0.2 mmol／L，引物终浓度为0.2 μmol／L，扩增程序为94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。
扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳。
紫外检测rPOB出现258bp条带、KatG出现282bp条带即为扩增阳性。
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。
然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。
本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。
一、耐药性机制1.多重耐药（MDR）多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。
这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。
2.延迟耐药（XDR）延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。
这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。
3.全耐药（TDR）全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。
然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。
二、检测方法1.传统的抗生素敏感性测试传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。
通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。
尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。
2.分子检测方法随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。
这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。
由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。
3.流式细胞术流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。
通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。
这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。
4.质谱法质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。
结核病诊断和耐药性检测新技术
分 支 杆 菌 复 合群 和其 他 Ｎ ＴＭ 。该 方 法 只 用 于 活 的 Ｍ．ｂ的鉴 ｔ
定 。Ｃ ｐｌ Ｂ 检 测 Ｍ．ｂ的敏 感 性 与 特 异 性 分 别 为 ９ ． ％ ａ ｉａＴ ｉ ｔ ９２ 与 ９ ． ［ 。结 果 报 告 时 问 仅 需 １ ｎ ７９ ４ ３ ｍｉ。测 序 分 析 发 现 ， ５ ＭＰ ６ Ｂ ４的 突 变 率 为 ３ １ ， 致 ＭＰ ６ ． 导 Ｂ ４的 ｃ 末 端 缺 失 。所 以 ， 有 Ｍ．ｂＭＰ ６ 所 ｔ Ｂ ４突 变 流 行 的 地 区 使 用 该 方 法 前 要 进 行
ｅ 学 的有 限公 司 （ 京 、 ｎ化 东 日本 ） 发 。该 平 台 不 是 特 定 用 于 研 结 核 病 检 测 ， 已经 用 于检 测 其 他 的 微 生 物 。它 的 主要 优 点 是 现
快速 、 不需 要 热 循 环 控 制 装 置 ， 于高 流通 量 ， 便 增加 了操 作 的 可
行 性 。技 术 运 用 ４个 不 同 的 引 物 特 定 的 用 来 识 别 靶 基 因 上 ６
条 试 验 ， 利 用 Ｐ Ｒ 和反 向 杂 交 方 法 快 速 地 检 测 耐 药 性 相 关 其 Ｃ
突变 。商 品化 线 型 探 针 试 验 包 括 Ｉ ＮＮＯ ＩＰ Ｒ 来自ＴＢ试 剂 盒 － ｉＡ． ｉ ．
荧光聚合酶链反应熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌及异烟肼耐药突
·论著·荧光聚合酶链反应熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌及异烟肼耐药突变的临床应用价值阳 央1， 冯 智2， 侯 欢2， 李芳芹3摘要： 目的 探讨荧光聚合酶链反应（PCR ）熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌复合群（MTBC ）及异烟肼耐药突变的临床价值。
方法 对延安市传染病医院2018年4－12月住院的370例肺结核患者痰标本采用MGIT320进行MTBC 培养及药敏试验，同时应用荧光PCR 熔解曲线法进行MTBC 和异烟肼耐药突变检测，对检出MTBC 的差异进行分析，以培养法药敏为金标准，评估熔解曲线法耐药突变检测的灵敏度、特异度、一致性等。
结果 370例患者培养法检出MTBC 175株，阳性率47.3%，熔解曲线法检出157株，阳性率42.4%，两种方法检测的结果差异无统计学意义（P =0.073），一致性中等（Kappa =0.510）；同时与有异烟肼药敏结果的115株进行比较，熔解曲线法灵敏度95.0%，特异度93.7%，与培养法结果比较差异无统计学意义（P =0.125），具有高度一致性（Kappa =0.807）。
结论 熔解曲线法试剂盒可用于结核菌快速筛查及耐药突变检测，对异烟肼耐药突变检测具有高灵敏度和特异度，有助于缩短耐药结核病诊断时间。
关键词： 结核分枝杆菌； 熔解曲线法； 快速检测； 异烟肼耐药突变中图分类号：R378.911；R978.3 文献标识码：A 文章编号：1009-7708 ( 2019 ) 04-0405-05DOI: 10.16718/j.1009-7708.2019.04.013Clinical utility of fluorescence PCR melting curve analysis for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and isoniazid resistant gene mutationsYANG Yang, FENG Zhi, HOU Huan, LI Fangqin. （Yan'an University Medical College, Yan'an Shaanxi 716000, China ）Abstract: Objective To evaluate the clinical utility of fluorescence PCR melting curve analysis in rapid detection of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and isoniazid resistant gene mutations. Methods The 370 patients with pulmonary tuberculosis treated in Yan'an Infectious Diseases Hospital from April to December 2018 were included in this study. The sputum specimens were tested with MGIT320 to isolate MTBC and conduct antimicrobial susceptibility testing. Meanwhile, fluorescence PCR melting curve analysis was also used to detect MTBC and isoniazid resistance mutations. The results achieved by the two methods were compared in terms of MTBC detection, as well as the sensitivity, specificity and consistency in identification of resistant gene mutations, taking culture and antimicrobial susceptibility testing as gold standard. Results Overall, 175 (47.3%) strains of MTBC were detected by culture method, and 157 (42.4%) strains were detected by melting curve method (P =0.073). The results were consistent (kappa =0.510). A total of 115 strains had isoniazid susceptibility data. The sensitivity and specificity of the melting curve method in identifying isoniazid susceptibility were 95.0% and 93.7%, respectively when compared with the results of culture method (P =0.125). Both methods showed high consistency (kappa =0.807). Conclusions The melting curve analysis kit can be used for rapid screening of tuberculosis and detection of isoniazid resistant gene mutations, showing high sensitivity andspecificity. It is helpful to reduce the time to diagnosis of drug-resistant tuberculosis.Keywords: Mycobacterium tuberculosis , melting curve analysis, rapid detection, isoniazid resistance mutation作者单位：1. 延安大学医学院研究生系，陕西延安 716000； 2. 延安市传染病医院检验科； 3. 延安大学附属医院检验科。
结核病 分子生物学检验方法
结核病分子生物学检验方法结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其传播途径主要为空气飞沫传播。
结核病在全球范围内仍然是一个严重的公共卫生问题，因此早期的诊断和治疗非常重要。
分子生物学检验方法是一种快速、准确的结核病诊断方法，本文将对其进行详细介绍。
分子生物学检验方法是通过检测结核分枝杆菌的核酸来诊断结核病。
与传统的培养分离方法相比，分子生物学检验方法具有更高的灵敏度和特异性。
目前常用的分子生物学检验方法包括聚合酶链反应（PCR）和核酸杂交技术。
PCR是一种通过体外扩增目标DNA序列的技术，它可以将微量的目标DNA扩增至足够的数量进行检测。
在结核病的分子生物学检验中，PCR可以通过扩增结核分枝杆菌的特异性基因序列来检测其存在。
常用的靶基因包括IS6110、16S rRNA和hsp65等。
IS6110是结核分枝杆菌特有的序列，在结核分枝杆菌中存在多个拷贝，因此可以提高检测的灵敏度。
16S rRNA和hsp65是结核分枝杆菌的保守基因，通过扩增这些基因可以进一步确认结核分枝杆菌的存在。
核酸杂交技术是一种通过标记的探针与目标核酸序列的互补配对来检测目标核酸的方法。
在结核病的分子生物学检验中，核酸杂交技术可以通过将结核分枝杆菌的核酸序列与标记的探针进行杂交来检测结核分枝杆菌的存在。
常用的核酸杂交技术包括荧光原位杂交（FISH）和线性探针杂交（LPA）等。
FISH是一种将荧光标记的探针与靶细胞中的核酸序列进行杂交的方法，通过观察荧光信号的强度和位置可以判断结核分枝杆菌的存在。
LPA是一种将线性标记的探针与目标核酸序列进行杂交的方法，通过检测标记的探针与目标核酸序列的杂交产物可以判断结核分枝杆菌的存在。
分子生物学检验方法在结核病的诊断中具有许多优点。
首先，分子生物学检验方法可以快速获得结果，通常在几小时内就可以完成检测。
其次，分子生物学检验方法具有高度的灵敏度和特异性，可以检测到非常低浓度的结核分枝杆菌。
肺结核耐药诊断标准
肺结核耐药诊断标准
肺结核耐药的诊断标准主要通过临床表现和特殊的检查方式来进行判断。
具体来说，如果肺结核患者在服用一段时间的抗结核药物后，其症状并未得到改善，甚至出现加重的情况，如持续的咳嗽、咳痰、痰中带血、持续的低热状态、盗汗、乏力等，这可能表明抗结核药物的疗效不佳，患者可能出现了耐药。
此外，通过对比患者治疗前后的胸片或CT，若发现病灶并未完全改变，甚至病灶加重、范围扩大，也说明抗结核药物疗效欠佳，可能出现了耐药。
在必要的情况下，可以通过取呼吸道的痰液进行细菌培养、结核杆菌的培养以及药物敏感试验，以明确是否存在结核耐药。
这些试验可以明确结核杆菌的耐药性，并指导医生调整治疗方案。
请注意，以上仅为一般的判断标准，如有相关疑虑或症状持续未改善，请及时就医，遵医嘱进行进一步的检查和治疗。
结核分支杆菌耐药性快速检测的研究进展
将重组结 核 分 支杆 菌 噬 菌体 和 发 光 自显 影 联合 使 用， 可用于结 核分支 杆 菌 的快 速 药敏 试验 。其 检验基 础 是重组的结 核 分 支杆 菌 噬 菌体 可 特异 性 地在 活 菌 中增 殖， 同时表达荧 光素 酶 。表 达 的荧光 素酶 在体 外合适 的 反应体系 中可 发光 ， 强度与 荧 光素 酶 的量成正 比。在 其
１ 改 良液体培养方法
但 这个方法是使 耐药 菌被 裂解 ， 故更 加 安全 。 国 内学
者彭丽等¨ 对 Ｐ ａ 和 比例 法在结 核杆 菌药 敏检 测 中 ｈＢ法
培养方法检测 耐药 性 主要 包括 绝对 浓度法 、 抗性 比
率法和 比例 法。但 以往 使用 的方 法都 较费 时 ， 不能准 确
加入 以杀毒剂灭活 ， 大量增殖后 将 菌体 裂解 ， 释放 出的子 代噬菌体可感染 随后加 入的指 示 细胞 ， 将 其裂解 ， 并 在平 皿 中出现噬菌 斑 ， 由此可判 定 标本 中存 在 活 的结 核 分支 杆菌 ， 即为 阳性 。如待检标 本不含 结核 分支 杆菌 ， 噬菌体 随 即被 杀 病 毒 剂 清 除 ， 皿 中无 噬 菌 斑 出现 ， 为 阴 平 即 性 ［８。由于其 它检 测方法最终都 是使 耐药菌得 到增 长 ， ７】 ．
一
这些突变点主要集 中于特定 区域 内 ， 此 区域 Ｄ Ａ序列 对 Ｎ
进行分析 即可预测结核 分支杆 菌对 Ｒ Ｐ耐 药性 。Ｐ Ｒ— Ｆ Ｅ ＳＣ Ｓ Ｐ技术是快速检 测基 因突变 的重要 方 法之 一 ， 已成 功 地应用于结核分支杆菌 ｒｏ 、ａＧ及 ａｐ ｐ Ｂ ｋｔ ｈ Ｃ基 因突变 的检 测。利用 Ｐ Ｒ—Ｓ Ｃ Ｃ Ｓ Ｐ技 术检 测 结 核分 支 杆 菌 分 离株 的
结核分枝杆菌的耐药性检测方法
结核分枝杆菌的耐药性检测方法简介：结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内广泛存在。
然而，随着抗生素的滥用和不当使用，耐药性分枝杆菌株的出现成为一个严峻的问题。
因此，准确、快速地检测耐药性对于结核病防控至关重要。
本文将介绍几种常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
传统涂布法：传统涂布法是一种经典而常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法需要将分离得到的结核杆菌培养在含有不同抗生素的琼脂平板上，并进行48小时以上培养。
通过观察菌落生长情况和对比试验，可以确定其耐药类型。
然而，这种方法操作复杂、时间较长且结果受到人为判断主观因素影响，已逐渐被新型技术所取代。
PCR扩增法：聚合酶链反应（PCR）扩增法是一种高效、敏感且特异性强的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它基于DNA的扩增原理，通过引物特异性靶向结核分枝杆菌核酸片段进行扩增，并通过特定技术判断结核杆菌是否存在耐药基因。
PCR可以在短时间内得到结果，并且可以同时检测多个抗生素的耐药性。
然而，PCR方法需要专业实验室设备和一定的操作技巧，不适合于基层医疗机构。
快速涂片法：快速涂片法是一种经济简便、结果迅速的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法利用亲水性阳离子染料对细胞壁进行着色，分析红细胞上色素的扩散情况，从而确定是否存在抗药型结核分枝杆菌。
这种方法操作简单、成本低廉且结果直观可靠。
然而，在高密度培养物中检出阳性样本可能会受到其他非结核分枝杆菌污染的影响。
气质联用仪法：气质联用仪法是一种新兴的结核分枝杆菌耐药性检测技术。
该方法基于结核杆菌产生的气体代谢产物，通过检测气相色谱和质谱的联用技术来分析结核分枝杆菌对抗生素的耐药性。
这种方法具有高效、快速、无需培养的优势，并且可以同时检测多种抗生素。
然而，由于设备昂贵且操作复杂，需要专业实验室支持。
基因测序法：基因测序法是一种准确度极高的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它通过对整个细菌基因组进行全序列测定，包括靶区的引物设计、DNA提取、文库构建以及高通量测序技术等步骤，可以获得详尽的耐药性信息。
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影像学
涂片镜检
培养
皮肤菌素试验
IGRA
分子诊断
可诊断活动期结核感染 无法区分活动期结核与潜伏期结核
当前临床诊治的难点
依据抗酸染色为基础的结核初筛的不可靠性
敏感性为~50%
结核/非结核分枝杆菌不能区分（NTM可能占到40%）
以培养为基础的结核确诊和药敏对治疗的影响
2个月才获得药敏结果，导致患者脱落
是否WHO推荐
耐药结核诊断
否
否
否
否
否
结核及耐药结核 初始诊断
仪器通量 出报告时间 试剂储存条件 涂阳培阳样本 MTB灵敏度 涂阴培阳样本 MTB灵敏度 耐药灵敏度
或12（选用杂交仪 可同时做12个样品） 6小时 部分试剂需冷冻 无 无
痰标本与处 理液 1：2混合 标本自动 清洗过滤 超声裂解 DNA提纯 DNA和 PCR反应 试剂混合 半巢式实 时荧光定 量核酸扩 增检测
分子信标
吸取2ml处理 样品 到反应盒
靶序列
杂交体
打印 检测 报告
将反应盒放入检 测模块（手工操 作完成）
SPC
每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。
获得检测结果时间：1小时 45分钟
不应当替代可检测结核和利福平耐药的快速分子诊断技术，尤其是耐药结核高危人群
由于缺乏证据，TB-Lamp对于持续有肺结核症状的HIV患者的诊断价值，是否优于涂片尚不清楚 TB-Lamp 的推荐只适用于检测持续有肺结核症状的患者的痰液样本 TB-Lamp对儿童患者的检测由于缺乏数据，仅是推测
恒温扩增 — 试纸条法
操作步骤： 1. 将痰液液化、离心、灭活，制备成核酸扩增 模板液 2. 取0.4ul移入1.5ml PCR管中，放入恒温装置 中扩增 3. 使用水浴锅或金属浴；63℃扩增1小时； 4. 将完成扩增的 PCR管放入一次性防污染扩增 物试纸条检测装置中检测 , 15 分钟目测定性 结果
利福平、异烟肼
WHO未评估或推荐 鉴定与药敏需用两套试剂盒，鉴定药敏各需6小时 配套设备：需不同PCR室，需PCR仪、杂交仪、扫描仪等，需配备扫描仪及配套软件判读
熔解曲线
核酸提取 扩增 检测结果
原理：一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定，发生错配时，Tm值下降，下降幅
操作步骤： 1. 反转10次混匀 2. 37°C条件下孵育16-24小时 3. 2000-3000g离心15分钟 4. 用移液管取血浆 5. 每个孔内放50ul结合液 6. 加入50ul血浆，室温孵育120分钟 7. 洗板至少6次 8. 每个孔内加100ul底物，室温孵育 30分钟 9. 加入50ul反应终止液 10. 450nm波长下读取吸光度 11. 使用专用软件计算结果
度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关
2-3小时获得结果，目前通过CFDA的有利福平和异烟肼耐药两套试剂盒 WHO未评估或推荐 配套设备：核酸提取仪、PCR仪等
半巢式实时荧光PCR（Xpert）— WHO与FIND支持研发成果
系统内自动完成
PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域：
5个探针结合到野生型，而不是突变体目标
文献：3种分子诊断方法比对
样本：根据“结核病诊断和治疗指 南”，收集2014 年4-7月西安市结 核病胸部肿瘤医院收治的经病理确 诊或细菌性确诊的肺结核患者痰标 本共378份。
无论涂阳培阳还是涂阴培阴，Xpert的检出率均最高
利福平耐药检测对MDR-TB诊疗足够吗？
“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最 为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限
无需昂贵的仪器 无耐药检测 手工操作相对较少 WHO未评估或推荐
恒温扩增 — 试纸条法
WHO在2015工作报告新技术章节中提到该技术 但说明目前该技术没有WHO评估并进行推荐所必须的多中心评估的数据
实时荧光RNA恒温扩增检测技术
RNA检测技术，高灵敏度，可区分活菌和死菌，适用于疗
效监测
需配备超声波仪，且仍需要实时荧光PCR仪检测 无耐药检测 WHO未评估或推荐 手工操作步骤相对较少
单个 2小时 部分试剂需冷冻
通量取决于扩增仪 2小时 部分试剂需冷冻
纯手工操作 2小时 室温储存
96 2-3小时 部分试剂需冷冻
1-80 2小时 室温储存
84.1%5 59.8%5
无
84.6%6 61.9%6
无
98.2%7 55.6%7
无
80%8 81%8
98%3 68%3-88.8%2
RIF 95%3
2个月后调整治疗方案，导致耐药患者的漏诊和传播
无法更早确诊耐药结核患者
我国结核诊断现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新
9
© Cepheid
结核诊断新技术
IGRA
T-Spot QuantiFeron
NAAT技术
‒ 等温扩增检测技术 ‒ 线性探针 ‒ 基因芯片 ‒ 熔解曲线 ‒ 巢式PCR
血清学检测
IGRA
原理：机体感染过结核分枝杆菌，T-淋巴细胞会在再次接触结核分枝杆菌时，产生和分泌特异性的细胞因子IFN-γ
两者均有大量手工操作步骤，操作要求高 QuantiFERON-TB
采血量：0.8-1.2ml
QFT低采血量，更具优势
T-SPOT.TB
采血量： <2岁儿童：2-3ml 免疫力低下患者：6-8ml 其他患者：4-6ml 操作步骤： 1. 密度梯度离心分离外周血单个核 细胞（PBMCs） 2. 洗涤PBMCs 3. 将PBMCs与特异抗原一同加入到 预包被抗γ -干扰素抗体的培养孔 4. 37°C孵育16-20小时 5. 洗涤培养孔 6. 加标记二抗 7. 孵育1小时 8. 洗涤培养孔 9. 加显色液 10. 用蒸馏水终止反应 11. 用肉眼判断结果
2014年全球耐药结核发病率
WHO估算2014年中国耐药结核发病数 新发病例：43000 复发病例：8200 我国属于耐药结核 高负担国家
来源：WHO 2015年工作报告
新发结核病例中的耐药结核比例
高负担国家的耐药结核发现
我国当前耐药结核防控的问题： 不充分的耐药病人发现，不充足的耐药病人治疗
5.56% 纳入治疗
2011年WHO评估完成后正式推荐
Dr. Mario Raviglione. Director, Stop TB, WHO
WHO全力推荐Xpert
各类分子诊断技术比对
（液体培养/DST为金标准）
线性探针 基因芯片 RNA恒温扩增 恒温扩增 （试纸条法） LAMP 熔解曲线 Xpert MTB/RIF
IGRA
将IGRA写入国家诊疗指南的有： 美国、加拿大 、英国、法国、西班牙、德国、意大 利、瑞士、荷兰、丹麦、挪威、芬兰、爱尔兰、葡 萄牙、捷克共和国、斯洛伐克、波兰、保加利 亚、 克罗地亚、澳大利亚、沙特阿拉伯、韩国、日本 WHO的推荐
2011年，IGRA在中低收入国家的政策声明
欧美发达国家 或/和 结核低负担国家
线性探针
标本制备 PCR反应 杂交 结果判读
结果需要人工判读，或配备专门的设备
WHO 2008年推荐用于涂阳标本检测MDR，2013年更新
推荐检测二线药物
全程检测需6-8小时 配套设备繁多，需3个房间，需PCR仪、杂交仪等 手工操作步骤繁多，复杂的结果判读
基因芯片
基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰液样本中结核杆菌的两种一线抗结核药耐药 —
INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的患者，无 论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831. 2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.
全球结核控制不理想的问题出在哪里？
结核诊治出现偏差！
过多依赖X-光片或其他影像学检查，忽略了以痰标本为基础的微生物
诊断
过多依赖未经验证、或不能作为诊断依据的测试，比如血清学检查 只参考传统的微生物检测结果
因为这些检测的不可靠性，WHO 不得不采取非常规手段，特别提出反 对这些测试的建议
结核诊断的常见技术
IGRA适用于高收入、结核低负担国家的潜伏结核筛查 在中低收入国家，尤其是结核高负担国家，不推荐使用IGRA
环介导等温扩增
设备要求较低 操作复杂，人工判读结果
环介导等温扩增
中国CDC推荐可用于基层实验室 无耐药检测 WHO推荐
对于持续有肺结核症状的成人可替代涂片（条件性推荐） 可作为持续有肺结核症状的成人的，可作为涂片的后续检测（条件性推荐） 备注 适用于可开展传统涂片的实验室
结核及耐药结核自动化检测技术
2016年12月
我国结核现状 结核诊断新技术 2015 WHO结核诊断指南更新