[整理]Agilent1200 高效液相色谱仪工作站学习总结

Agilent1200 高效液相色谱仪工作站学习总结开首语本人在2008年本人在2008年1月8日至1月11日参加广州日至1 11日参加广州安捷伦科技有限公司的1200高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司的1200高效液相色谱仪化学工作站的学习培训，几天学习培训，使我对1200液相色谱仪的硬件及软件有了更全

我对1200液相色谱仪的硬件及软件有了更全面的了解和更多的认识，现在做个总结向大家介绍如下。

硬件篇安捷伦高效液相色谱仪1200由几部分组成，脱气机，泵、进样器、柱温箱和检测器。安捷伦1200HPLC系统采用积木式堆积结构，方便用户按照自己的需要配置不同的的系统，整个系统的流路自上而下设计、连接，减小了系统的死体积和延迟体积。

Agilent 1200HPLC系统堆叠方式

脱气机安捷伦1200系列在线脱气机有，微量真空脱气机G1379B、标准真空脱气机G1322A。原理基本相同，就是使用半透膜管路，允许气体分子通过，液体分子无法通过。A型用的是微渗管，B型用的是滤膜。流路A型是左进右出，而 B型为下进上出，本科室使用的为A

型G1322A。使用真空脱气机可以降低噪声，保证保留时间的重现性，与He脱气相比，更方便，更节省费用。

真空脱气机脱气原理

泵安捷伦1200系列泵有：单元泵：G1310A、四元泵：G1311A、二元泵：G1312A、二元泵SL型：G1212B。单独一个泵腔泵腔无法满足溶剂传输系统的要泵腔求：连续性、稳定性都不符合标准，现在新购仪器中已很少考虑。

单元泵，按溶剂的传输系统有两种，一种是并联柱塞泵，另一种是串连柱塞泵。并联柱塞泵由于两个泵的相位不同，可以补偿流量脉冲，但由于单向阀的数量增多，所以容易造成泄漏，增加了维护使用的难度。串连柱塞泵左泵腔的活塞运动速度为右泵腔活塞的2倍，因此，相同时间内，左泵提供的流量为右泵的两倍，左泵提供的溶剂一半直接供给系统，另一半被右泵吸入，稍后供给液相系统，减少了单向阀的用量，可以使用压缩因子补偿。

四元泵，其实就是比单元泵多了四元比例阀。由单元泵可以升级到四元泵，除了要加上四元比例阀外，还要更换主板。需要注意的是，当使用盐溶液和有机溶剂时，建议将盐溶液接到四元比例阀下面的通道上，有机溶剂接到上面的通道上。如果经常使用盐溶液，建议定期用水冲洗所有的通道以去除阀口上可能出现的盐沉淀。

四元泵的工作原理

二元泵，有两个泵头，特点是高压混合，无需脱气；对于有强紫外吸收的流动相，使用静态混合器可以降低基线噪声；可以选择溶剂切换阀自动进行溶剂切换；对于高盐流动相，可选择泵头密封垫清洗

装置。所以脱气机不是标准配置，但增加真空脱气机，流量范围可以从 0.5～5ml/min扩展至0.05～5ml/min；加入静态混合器，使流动相混合更加均匀；如果配置

溶剂切换阀，则两个泵头可分别控制两种溶剂，类似四元比例阀，但并不完全一样，只能同时混合两种溶剂，不可实现四种溶剂的同时使用。二元泵为高压泵，为后混合式，精度更高，而且由于为高压混合，产生的气泡也更少，所以价格也比四元泵贵得多。四元泵为低压泵，流速稳定性相对较差，低压混合容易产生气泡，在实验中常会遇到这样的问题，多元

混合中出现流动相不稳定的现象，特别是流动相配比较低的如小于1%，其多元混合效果难以达到我们的要求，造成保留时间漂移，甚至得不到我们预期的色谱峰。明白四元泵的低压混合的道理，实际操作中我们发现问题时，有助于我们对原因的分析。必要时泵可以拆御，更换密封垫及滤芯。对容易出故障部位及处理方法，比如宝石活塞杆是不能超声的部件，泵头密封垫要成对更换，实验室中至少应备有一付号泵头密封室中至少应备有一付4号泵头密封室中至少应备有一付垫，部件号为：5663-6589（用于反相色谱）；部件号为：（用于反相色谱）； 0905-1420（用于正相色谱）。同时实验室应备（用于正相色谱）。同时实验室应备）。过滤芯，有5-10个P TFE过滤芯，以备日常所需。判断方个过滤芯以备日常所需。法为，打开冲洗阀，以水为溶剂，法为，打开冲洗阀，以水为溶剂，流速 5m

l/min，系统压力大于10bar就应更换过滤白，系统压力大于就应更换过滤白头了。头了。

二元泵的工作原理

进样器，安捷伦1200系列进样器有：标准自动进样器G1329A、高性能进样器G1367A、高性能进样器SL型G1367B、手动进样器G13 28B。自动进样器的特殊功能，洗针功能可以把样品残留降低到最小限度；多次吸液用于进样量大于100μl的情况；程序进样可以非常灵活

地执行用户的进样程序要求，如多种样品自动混合，自动进样等高级功能的自由设置，但是，由于进样针的扩散，所以进样量越小，受到扩散的影响也越大，所以自动混合的准确度还是难以达到容量瓶的混合方式。这在做标准由线时得注意的问题，如为定量则不推荐小样量的混合方式。程序进样方式设置如下图：

第一步：设置进样第一步：器

第二步：第二步：使用进样器程序（U）

第三步：更多信息（功能项）第三步：更多信息（功能项）

对于手动进样器，必须了解六通阀的工作原理，应特别注意的是进样量少于定量环的50%或大于定量环的3-5倍量是比较准确的，不过，大家用自动进样器已经习惯了，如果再用回手动进样器会不会有

些郁闷？会不会有一种坐惯了宝马又要回到踩单车的感觉？柱温箱，使用安捷伦柱温箱可以保证柱的稳定性，从而保证了保留时间的重现性。恒定的柱温特别是日温差大的时候更为必要。

检测器，安捷伦1200系列检测器有，可变波长检测器G1314B、二极管阵列检测器 G1315B、二极管阵列检测器SL型G1315C、示差折光检测器G1362A、荧光检测器G1321A。本所用的是VWD的G1314B型，D AD型及FLD的就不多说了。对VWD型检测器应了解它的工作原理，氘灯的使用维护及更换。需要注意的是，使用中不要频繁的开关氘灯，否则影响氘灯的寿命。

可以利用诊断方式来检测氘灯的能量，当然，发现氘灯能量降低时不要马上得出氘灯应该更换的结论，这也许是流通池脏或有气泡造成的能量降低，所以必须用诊断方式检测流通池。诊断结果大于0.6说明流通池很干净，小于0.2则说明流通池该清洗了。更换氘灯后要在诊断日志中填写更换氘灯，这样氘灯的使用时数便从零开始。

这里还有一点得注意的是流通池的后压力非常重要，一定要使用适当出口连接管，出口管线要使用专用废液管为系统提供适当的后压，不得私自将废液管截短，以防气泡进入流通池。但如果压力过高，流通池的石英窗片可能破裂。在这里我要说的是，对安捷伦1200高效液相色谱仪正确的操作方法和定期的维护保养的是很重要的。

软件篇软件部分，这就是1200液相色谱仪的化学工作站。本所安捷伦1200高效液相色谱仪工作站软件版本为B.02.01，现在新的版本为B.03-01 的了，但这没有太多的差别，新版本增加的只是一部分我们很少用到的高级功能。

在这里我就和大家一起讨论一些日常使用中遇到的细节问题，也许是我们使用过程中所容易忽略也容易造成操作问题的。软件方面从数据采集，数据分析至报告格式及打印。首先我们应该了解，脱机区别于联机是不能对仪器进行控制，不能运行诊断。

工作站运行界面：单针进样工作站运行界面：

工作站运行界面：工作站运行界面：多针进样

数据采集中主要是分析方法和运行控制，这是我们操作中常用的。方法的的概念，方法是一个参和集，它包括分析一个样品所需要的所有参数：数据采集参数、数据分析参数及命令或宏指令等内容。方法的组成：1、方法信息； 2、仪器/采集参数；3、数据分析参数；4、运行时选项表。

我想对方法的编辑大家应该都比较常用和熟悉的了，在这里我选一些也许大家不太注意的说一说吧。编辑方法仪器中，方法编辑选项里有四个可选项，1、方法信息（M）；2、仪器/采集（I）；3、数据

分析（D）；4、运行时选项表（R）。首先选择所要编辑方法哪一部分内容。需要注意的是，不选择某一部分内容，并不意味着方法中不含有该部分内容，而仅仅

意味着本次对该部分内容不进行编辑，使用原方法中设置的参数。还有，仪器参数设置——四元泵的参数设置。1、停止时间：是仪器停止采集数据的时间，并不是泵停止工作的时间。本例中工作站仅采集0～10分钟的色谱图，10 分钟后，不再采集数据，但泵仍然继续工作，向系统提供流动相。使用自动进样器

时一定要设置适当的停止时间，以保证连续进样的要求；2、后运行时间：是指一次运行结束后，到第二次进样前的等候时间，该时间用于系统为第二次进样做好准备。例如：将不感兴趣的杂质冲洗出色谱柱，或等待系统中的流动相真正变成下一次进样的初始比例。做梯度洗脱时，一定要设置该数值；3、压力限：

压力的上下限也要合理设置。压力上限不要高于柱子能够承受的压力最大值，一般比正常分析压力高20bar左右；而压力下限的数值一般比正常分析压力低20bar左右；4、时间表：此处可以编辑梯度洗脱程序，规定溶剂比例变化方式。要注意程序时间与停止时间和后运行时间之间的协调关系。单元泵的参数设置界面与四元泵相比少了溶剂选择项，参数设置的要求

与四元泵参数设置要求相同，只是此时只有一种溶剂可供选择，也无法进行梯度洗脱实验。二元泵的参数设置要求与四元泵参数设置要求相同，只是此时只有A、B两种溶剂可供选择。二元泵SL的参数设置可以在溶剂类型处的列表中选择本次使用的溶剂，并写入对溶剂描述。

系统将根据你所选择的溶剂自动进行溶剂压缩因子补偿，保证流量、比例更加精确。当选择“使用高级压缩因子校正”选项时，将按照各个方法中泵参数部分选择的溶剂的对应的压缩因子来控制泵，进而保证流动相的流量和比例更加精确。有一个问题，就是在数据采集完毕洗柱的时候是不用开灯的，但如果强行关灯则方法运行时

会报错，会提示仪器没有准备就绪。怎么办呢，在方法的运行时选项表中有“运行前命令/宏” 和“运行后命令/宏”，我们可不可以在“运行前命令/宏”中设置把灯关了呢？当然可以，而且这是关灯后再洗柱方法中所必须的，但我在前面说过，先关灯，仪器会报错，方法无法运行。其实很简单，这是因为我们有一个细节

设置关灯后洗柱：设置关灯后洗柱：第一步

设置关灯后洗柱：设置关灯后洗柱：第二步

设置关灯后洗柱：设置关灯后洗柱：第三步

设置关灯后洗柱：设置关灯后洗柱：第四步

没编好，在方法编辑过程中，进入仪器参数设置-检测参数VWD设置，在右下角选“更多信息”，点击进入后点选“特殊设置”，对“当灯关闭时可进行分析（E）”进行勾选，再在“运行前命令/宏”中输入LAMP OFF，这样，就可以实现先关灯后再运行洗柱的方法了。然后在“运行后命令/宏”中设置完成后关泵或关闭闭工作站，工作站，

这就是随你所欲啦。关泵为PUMP OFF，关闭整个系统为STANDBY，这里要说明的是PUMP OFF和STANDBY是有区别的，前者为泵的关闭，后者为停泵至待机状态的。如果选BACK命令，则关闭工作站。这是关机方法中的一个小技巧，这当然不可用在分析方法上，分析方法中前后宏命令最好慎用，

特别是在VWD设置中更不可选特殊设置中勾选“当关灯时可进行分析”，不然我们的实验操作就没有意义了。这是为什么，大家一想就知道啦。还有，在运行时选项表中要注意的问题是，除非有特殊

要求，一般不建议选择“保存GLP数据”、“将方法和数据保存在一起”选项， GLP

数据是最原始的数据，不允许改动。一般情况下选择这两种选项只是浪费硬盘空间而已。泵的设置方面，特别是梯度洗脱设置中建议先预览一下，看看是不是我们想要的突变或浙变效果。数据分析中重点在于图谱的处理，以及如何建立校正表。有时我们得到的色谱图并不很理想，

那如何对它进行合理积分以得到比较准确的数据这是个关键，这可以从积分事件中进行设置。斜率灵敏度和峰宽的数值改动要慎重，因为选用不同数值，将影响色谱峰起止点的识别，得到不同的峰面积，进而影响到所得定量结果的准确程度。一定要保证处理同一系列数据（各个标样数据和未知样品数据）时，

这两个参数值是一致的。最小峰面积和最小峰高的数值大小不会影响所得峰面积，仅仅做为是否对该色谱峰进行积分的标准。积分事件表中的积分参数并不是孤立于方法的参数，它们属于方法的一部分内容，所以保存积分参数时应先将积分事件保存到方法中，然后再保存方法，积分参数就会被保存下来。如果自动积分

和利用积分事件表设置积分参数都不能满足用户积分的具体要求，那么退出积分事件表，即可看到上图所示的手动积分工具栏，你

可以使用手动积分的功能进行积分条件优化，手动积分不能被直接保存到方法中，也不建议保存手动积分参数。

校正，校正即是利用某个峰的峰高或峰面积来确定其对应组分的浓度或含量，当检测器灵敏度针对不同的组分而变化时需要进行校正，检测器对同一组分不同含量响应值发生变化时需要进行校正。校正分单级校正和多级校正。一、单级校正：即单点校正，单点法。仅有一个浓度的标样，无论进样几针取平均值，

只要浓度相同，都相当于只做一次校正。单点校正的两种假设（1、响应曲线必须是直线；2、响应曲线必须通过原点。）都不尽合理，使得单级校正定量结果不准确。但其具有简单、快速的优点，常适用于以下情况：1、做简单的粗定量；2、当未知样品的浓度小于且接近于标样浓度时，变量定量结果较准确；3、主要用于检出实验，即不需要准确定量未知样品含量，

只关心未知样品是否达标。二、多级校正。1、对每一峰需做至少两次校正；2、可以补偿检测器的非线性响应；3、响应曲线可以不通过原点。多级校正纠正了单级校正的缺点，可以进行准确定量。液相色谱里面常用的多级校正为五级校正（即五点法）。

建立校正表，它的目的目的是为了得出含量结果。目的校正表建立是自动计算中必须的，标准曲线制定也必须在校正表建立上。校

正表编好后，也要作为方法的一部分存入方法。同时想用批处理来处理数据时首先建立校正表。至于批处理方面的应用，这是高级培训班中的内容，在基础培训班中只提及一下，所以我在这里也就不不多说了。在此提醒注意的是：如果使用内标法或内标百分比法定量，一定要指定内标峰，否则化学工作站会警告内标化合物丢失，无法完成定量。最后是报告处理，工作站提供了一系列的报告格式，如简单报告，性能报告，完整报告等，其中又分为内标法，外标法，百分比法等多

种报告格式。如果你对工作站上给出的格式不满意，可以自定义设置报告，不过，自定义报告的设置是一个令人头痛的问题，要想得到一个较满意的自定义报告，需要你花不少的心神。安捷伦的色谱工作站中的报告功能确实到了人人痛骂的程度。安捷伦公司难道真的这么没文化么？一点没考虑中国国情还一味在中国