利用PCRDGGE技术分析桑天牛成虫肠道细菌菌群
PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响
PCR-DGGE技术分析蛋鸡MHC基因对肠道细菌种群结构的影响倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2009(042)007【摘要】[目的]研究蛋鸡MHC(Ma jor Histocompatibility CompIex,主要组织相容性复合物)基因对不同周龄和不同部位肠道细菌种群结构的影响.[方法]使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合特异性和共性条带割胶回收DNA进行克隆和测序,对2,4,6和8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内含物细菌群落的结构和多样性进行比较,鉴定8周龄蛋鸡部分特异性和共性群落成员.[结果]商品蛋鸡和15I5系蛋鸡盲肠细菌的多样性最高,其次是回肠和空肠,嗉囊和十二指肠的细菌多样性比较低,且随着蛋鸡周龄增加,各肠段细菌多样性呈上升趋势,MHC基因对细菌多样性无显著影响.DGGE图谱聚类分析表明,蛋鸡MHC基因对4,6周龄肠道细菌的影响最大,对2周龄影响最小;而且MHC基因对消化道前段细菌的影响小于对后段影响.序列分析发现,8周龄商品蛋鸡和15I5系蛋鸡均有大量的三得利乳杆菌(Lactobacillus suntoryeus),是蛋鸡消化道前段的优势细菌;商品蛋鸡空肠、回肠和盲肠中的特异性条带主要是Ochrobactrum spp,索氏梭菌(Clostridium sordellii),超巨巨单胞菌(Megamonas hypermegale)和大量不可培养的细菌;15I5系蛋鸡的特异性条带主要是不可培养的细菌.[结论]蛋鸡MHC基因可影响不同周龄、不同肠段细菌群落的结构.【总页数】8页(P2564-2571)【作者】倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;Shayan Sharif;曾东【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Food Research Program,Agriculture and Agri-Food Canada,Guelph,Ontario,加拿大rn;Department of Animal and Poultry Science,University ofGuelph,Guelph,Ontario,加拿大;四川农业大学动物医学院,四川雅安,625014,中国【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.方斑东风螺地膜覆沙池和潮线下养殖系统细菌种群结构的PCR-DGGE分析 [J], 李淑芳;邱德全;张继东;杨世平;邱明生2.海绵共附生细菌种群组成的PCR-DGGE基因指纹分析 [J], 李志勇;何丽明;蒋群3.16S rRNA基因的PCR-DGGE技术分析茶尺蠖幼虫肠道细菌种群结构及多样性[J], 靳亮;王金昌;王洪秀;张贱根;杨罡;靳海燕4.采用 PCR-DGGE 技术分析白蚁肠道内细菌种类 [J], 江涛;葛明伟;李周勉;易锦辉;俞辉;和小明5.采用PCR-DGGE技术分析蛋鸡肠道细菌种群结构及多样性 [J], 倪学勤;Joshua Gong;Hai Yu;曾东;Shayan Sharif;周小秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用ERIC_PCR和PCR_DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样
动物营养学报2010,22(4):9852991Chinese J ournal of Animal Nutritiondoi :10.3969/j.issn.10062267x.2010.04.026利用ERIC 2PCR 和PCR 2D GGE 技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性潘康成 陈正礼 崔恒敏3 冯 兴 盛 琴 赵 爽(四川农业大学动物医学院,动物疫病与人类健康四川省重点实验室,雅安625014)摘 要:本文旨在采用ERIC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。
选用15羽28日龄肉鸡,按2mL /kg B W 喂服枯草芽孢杆菌悬液(109C FU/mL ),每天2次,连续3d ,34日龄时,利用ER IC 2PC R 和PC R 2D G G E 方法分析肠道菌群的多样性,并对D G G E 条带进行回收、测序。
结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P <0105或P <0101),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为5312%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PC R 2D G G E 明显优于ERIC 2PC R ;回收条带以乳杆菌属细菌为主。
结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PC R 2D G G E 检测方法明显优于ERIC 2PC R 。
关键词:枯草芽孢杆菌;肉鸡;肠道菌群;多样性;ERIC 2PC R ;PC R 2D G G E中图分类号:S831 文献标识码:A 文章编号:10062267X (2010)0420985207收稿日期:2010-01-14基金项目:“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(I R T0848)作者简介:潘康成(1971-),男,苗族,贵州榕江人,副教授,博士,主要从事动物微生态学和发酵工程研究。
应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析
。应用 “ G1 夹板” 技术可使检出率
应用 !""# 研究微生物群落时的常见问题分析
邢德峰， 任南琪"
（哈尔滨工业大学市政环境工程学院 哈尔滨 &($$.$）
摘
要： 变性梯度凝胶电泳 （G008） 是通过核酸片段对微生物群落进行研究， 可以监测未培养细菌及其功能基因，
被广泛地应用于微生物群落多样性和动态分析， 并成为微生物分子生态学研究中的重要手段之一。文中论述了 并提出了相应的解决方法。全面分析了样品预处理过程和 HIJ 扩增效果对 G008 操作过程中遇到的常见问题， 探讨了 G008 图谱的优化过程和图谱分析方法， 并对 G008 的应用前景进行了综述。 G008 分析的影响， 关键词：G008；微生物群落；微生物分子生态学；图谱分析；排序 中图分类号：K.%1L& 文献标识码： ) 文章编号： $$$&4"#$.（#$$"）$#4$%%&4$( 的操作过程， 对一些常见问题进行了整理和分析， 并提出了 相关的解决办法。
" 通讯作者。 23-： 1"4!(&41"#1#&&$； 567： 1"4!(&41"#1#$$1； 8496,-：+:;< =,> ? 3@A ? B:，,7@C< D6=EE? BE9? B:
作者简介： 邢德峰 （&.// F ） ， 男， 黑龙江人， 博士研究生， 研究方向为环境生物技术。 8496,-：,7@C< D6=EE? BE9? B: 收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$(4&$4#(； #$$(4$(； #$$(4&%
应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究的开题报告
应用PCR-DGGE技术对不同日龄仔猪肠道菌群分布规律的研究的开题报告一、研究背景和意义肠道是动物体内最重要的微生态环境之一，肠道菌群对于宿主的生长发育、消化吸收、免疫调节等方面都有着重要的影响。
仔猪的肠道菌群在出生后的短时间内会有显著的变化，在不同的生理阶段，肠道菌群的种类和总量也会发生变化。
因此，研究不同日龄仔猪肠道菌群分布规律，对于优化饲养管理、提高养殖效益具有重要的参考价值。
传统的细菌培养方法由于只能培养一小部分细菌，无法全面反映肠道微生态状态。
PCR-DGGE（聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）技术能够通过PCR扩增16S rRNA基因的特异序列，并利用变性梯度凝胶电泳将PCR产物分离和检测，从而全面分析肠道微生态菌群的组成和分布规律。
二、研究内容和方法（1）研究内容本研究将应用PCR-DGGE技术研究不同日龄仔猪肠道菌群分布规律，具体内容如下：1. 收集不同日龄仔猪的肠道样品，包括出生后第1日、第7日、第14日、第28日、第42日等不同日龄段的仔猪。
2. 提取肠道样品中的总DNA，利用PCR扩增16S rRNA基因的特异序列。
3. 将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，对电泳图谱进行分析和比较。
4. 根据DGGE图谱中的带谱，结合16S rRNA序列信息，分析不同日龄仔猪肠道菌群的组成和分布规律。
（2）研究方法1. 采集样品：收集不同日龄仔猪约50只，体重相近，选取肠道内容物样品。
2. 提取DNA：使用DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取肠道样品中的总DNA。
3. PCR扩增：采用通用引物对16S rRNA基因的V1-V3区域进行PCR扩增，PCR 反应体系约50ul，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，共30个循环，最终72℃延伸10min。
4. DGGE分析：DGGE电泳采用DCode系统，在8%聚丙烯酰胺凝胶上进行，电泳条件为60℃，电压200V，电泳时间8h，Gelred染色。
PCR_DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用
PCR-DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用吴高锋1,李文刚2,高卫科1,魏娟1,杨慧敏1,王鑫1(1.河南农业大学,郑州450002; 2.郑州牧专,郑州450011)摘要:肠道菌群是机体常在菌群的重要组成部分,机体的健康和疾病的发生和发展与其多样性及种群的变化有着密切关系。
因此,对肠道菌群进行研究具有重要意义。
变性梯度凝胶电泳(DG GE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异,利用变性梯度胶进行分离。
它是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究肠道菌群结构多样性和种群结构的变化。
作者对PCR-D GGE的原理、优缺点及在动物肠道菌群分析中的应用和前景作一简要综述。
关键词:P CR-DGG E;肠道菌群;原理;应用中图分类号:Q503文献标识码:A文章编号:1671-7236(2008)06-0037-03动物肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物,它可以促进营养的消化吸收,诱导黏膜免疫保护,甚至调节宿主脂肪的储存等功能,要了解这些过程均需要解析相关的微生物学信息,并且这些微生物主要是由大量细菌组成的。
因此,对肠道菌群结构多样性及种群动态变化进行研究具有至关重要的意义。
在DNA分子技术出现之前,人们对肠道微生物的认识大多数是靠纯培养或靠直接形态观察来获得部分信息。
但是由于微生物形态过于简单,并不能提供太多的信息,而且肠道内微生物很多都是厌氧菌,目前只有少部分微生物能够被分离培养,若以这部分的微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群将导致极大的偏差。
Pace等(1986)首先用核酸测序技术研究微生物生态和进化,将分子生物学技术应用于微生态学的研究,开辟了认识微生物的新途径。
分子生物学技术的应用克服了传统方法的限制,使得微生物学者可以从基因水平上估计种的丰度、均度,查明种的变异情况等,从而可以客观上认识微生物的天然的生态状况。
目前用于肠道菌群研究的分子技术有rRNA/rDNA序列分析、RAPD(随机扩增多态性分析)、ERIC-PCR、TGGE(温度梯度凝胶电泳)、PCR-DGGE(denaturing gradient g el e-lectr ophoresis,变性梯度凝胶电泳)等。
PCR-DGGE法分析中华按蚊肠道菌群种类
PCR-DGGE法分析中华按蚊肠道菌群种类摘要：采用PCR-DGGE技术对中华按蚊成虫肠道细菌多样性进行研究，共检测到12条16S rRNA基因序列。
在系统发育地位上主要归入3个细菌纲：丙型变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌纲，其中有59.8%的细菌属于丙型变形菌纲，占绝对优势，成为中肠主要细菌群落。
从而显示出中华按蚊成虫肠道细菌的复杂性和多样性关键词：中华按蚊，PCR-DGGE，肠道菌群，多样性中华按蚊是我国传播疟疾的主要媒介，是重要的医学昆虫之一。
长期大量使用化学杀虫剂，导致蚊虫抗药性的出现和扩散、并严重污染环境[1]。
因此，采用生物防制方法灭蚊引起了医学昆虫界及世界卫生组织专家的广泛关注。
Micks 等(1961)曾报道按蚊肠道细菌密度减少与疟原虫密度增加的关系；抗生素试验也表明减少按蚊中肠细菌将增加按蚊感染疟原虫的几率，按蚊肠道细菌群落结构变异影响疟原虫在按蚊肠道中的发育(Beier et al.，1994)。
传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微生物[2]。
目前肠道中能培养的细菌仅占肠道内总细菌数的10%-50%，随着分子生物学技术的发展和相关研究的累计，逐步建立起来以微生物基因组DNA序列信息为依据，通过分析样品中DNA分子的种类和数量来反映微生物之间、区系组成、群落结构以及微生物与其周围环境条件相互作用关系的体系[4]。
本文通过将PCR-DGGE法用于中华按蚊肠道细菌多样性的分析，鉴定其共生细菌种类，分析其分子多态性。
1、主要材料与仪器QI Aamp DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen公司）；细菌通用引物（Zhang & Jackson，2004）（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR扩增试剂（北京鼎国生物技术公司）；40%丙烯酰胺；10%过硫酸铵（APS）；0％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml，50×TAE 缓冲液 2ml，ddH2O 83ml；100％变性储备液（总体积100 ml）：40％丙烯酰胺 15ml， 50×TAE 缓冲液 2ml，去离子甲酰胺40ml，尿素 42g，ddH2O加到100ml。
PCR-DGGE分子技术及其在畜牧业中的应用
PCR-DGGE分子技术及其在畜牧业中的应用
何涛;张海军;武书庚;齐广海
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2008(035)007
【摘要】传统的以微生物培养为手段的研究方法极大地限制了对微生物的研究.作者综述了以16S rRNA为主要研究对象的DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术的原理及优缺点,以DGGE为主要手段结合PCR扩增分析对微生物的群落结构和多样性研究的最新动态.
【总页数】4页(P36-39)
【作者】何涛;张海军;武书庚;齐广海
【作者单位】中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081;中国农业科学院饲料研究所,北京,100081
【正文语种】中文
【中图分类】S818.9
【相关文献】
1.分子技术在微生物修复中的应用 [J], 欧阳紫邦
2.分子技术在临床微生物检验中的应用 [J], 李美丽
3.单分子技术在G蛋白偶联受体二聚体中的应用 [J], 蔡欣; 王春勇; 王德秀; 苏文霞; 鲁洪; 王凤斌
4.分子技术在食源性致病微生物检测中的应用 [J], 邵炳[1]
5.分子技术在食品微生物检测中的应用 [J], 郑波
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人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告
人肠道菌群PCR-DGGE方法的建立及脾虚患者的研究的开题报告一、研究背景人肠道菌群是指在人体肠道中生长的各种微生物群落，包括细菌、真菌和病毒等。
肠道菌群在人体消化、吸收和免疫等多个方面起着至关重要的作用。
目前，越来越多的研究表明肠道菌群与人体健康密切相关，它们的改变与多种疾病的发生、发展和治疗效果密切相关。
因此，研究肠道菌群的结构、功能及其对人体健康的影响，对于促进人类健康具有重要的意义。
PCR-DGGE是一种常用的肠道菌群研究方法，通过PCR扩增目标基因序列，将不同样品的PCR产物经过DGGE（变性梯度凝胶电泳）检测出差异，从而确定菌群的组成结构和多样性。
然而，PCR-DGGE方法在样品处理和操作环节中容易出现一系列问题，如样品预处理不当、恒温原则和DGGE带解析等，这些问题影响了PCR-DGGE法的特异性、重复性和准确性。
因此，建立PCR-DGGE方法并进行优化是非常必要的。
脾虚是中医学上的一种证候，表现为肌肉松软无力、易疲乏乏力、面色黯淡、食欲不振等症状。
脾主土，主管运化水谷，为人体生命活动所必需。
由于现代饮食结构的改变和生活方式的差异，脾虚已成为常见的调节性疾病。
然而，脾虚的病因及其与肠道菌群的关系尚不明确。
因此，研究脾虚患者的肠道菌群结构与多样性，评估肠道菌群与脾虚间的关系，对于揭示脾虚的病因及推进相关疾病的预防与治疗具有重要的意义。
二、研究目的与内容1. 建立PCR-DGGE方法进行肠道菌群的研究，并对该方法进行优化。
2. 收集脾虚患者的粪便样本进行肠道菌群研究，探讨脾虚患者肠道菌群结构与多样性的变化规律。
3. 利用多元统计学方法对肠道菌群与脾虚间的关系进行分析，评估脾虚患者的肠道菌群与健康人群的差异。
三、研究方法与技术路线1. 采集脾虚患者的粪便样本，提取微生物DNA并进行PCR扩增。
选择16S DNA V3区作为基因靶标，用DGGE进行DNA基因图谱分析，统计并分析不同样品之间菌群结构的相似性与差异性。
PCR-DGGE法分析细菌群落结构及多样性
PCR-DGGE法分析细菌群落结构及多样性汤玲娟;石健;范素素【摘要】采用PCR-DGGE方法研究活性污泥和土壤中微生物种群结构的变化.提取样品总DNA作为模板,采用细菌通用引物GC-338F和518R进行PCR扩增.最后对DGGE图谱中优势条带进行回收、测序.结果显示,变形菌门和拟杆菌门是构成土壤和污泥微生物群落的主要种群,且变形菌门所占比例最大,在各样品中均占40％以上,是该研究样品中的优势细菌类群;土壤的细菌群落中检测到放线菌门,而活性污泥中未检出.【期刊名称】《南通大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(016)001【总页数】4页(P35-38)【关键词】PCR-DGGE技术;16S rDNA;微生物群落;土壤;污泥【作者】汤玲娟;石健;范素素【作者单位】南通大学分析测试中心,江苏南通226019;南通大学分析测试中心,江苏南通226019;南通大学分析测试中心,江苏南通226019【正文语种】中文【中图分类】X172近年来，越来越多的学者对土壤微生物的多样性及其作用进行了研究，特别是在生态学和环境科学领域[1]，另外污泥里的微生物种群结构可以影响到污泥某些特定的处理性能[2]，因此研究污泥微生物群落结构对改进生物处理工艺及提高废水处理效率具有重要意义.变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel elec-trophoresis，DGGE）技术[3]是目前研究微生物群落结构的分子生物学主要方法之一[4-5].1993年，Muyzer团队[6]运用DGGE电泳检测技术对微生物群落结构进行了研究，发现在自然界中微生物群落无论是在多样性还是群落差异性方面都具有明显的优势.本实验中运用的PCR-DGGE技术[7]可以同时分析多份样品并对微生物的动态变化进行监测、研究.1.1 样品土壤的培养：取2份质量相同的土壤，其中一份灭菌处理.取一定量的联苯菊酯溶液分别对2份土壤进行喷洒作业，并在第1天、第7天、第20天和第44天进行取样.污泥的培养：污泥样品取自南通市第二污水处理厂，用桶装回后放在常温下静置一段时间，使得养分耗尽.以质量比为100∶5∶1的比例配置尿素、淀粉、磷酸二氢钾的混合物作为养分加入污泥里.然后加入联苯菊酯溶液并慢慢增加用药量，最终使得污泥里的微生物适应联苯菊酯溶液且以其为养料.分别在第4，8，12，16，20，24，28天进行采样.1.2 DNA提取用提取试剂盒（Mobil DNA Isolation Kit）对样品总DNA进行提取.1.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增样品的菌群分析以基因组DNA作为模板[4]，将样品16S rDNA高变区序列作为靶标，采用细菌通用引物GC-338F和518R进行PCR扩增.16S rDNA高变区引物序列为：518R（ATTACCGCGGCTG CTGG），GC-338F （CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGG CGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCTACGGGAGGCA GCAG）.PCR扩增体系（50μL）：50 ng DNA模板，10× PCR buffer（5μL），2.5mmol/L的高纯dNTP（3.2μL），5 U/μL的 rTaq酶（0.4μL），20μmol/L的 GC-338F和518R引物（各1μL），加入去水离子至总体积为50μL.PCR扩增反应步骤：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃维持10min.1.4 DGGE电泳及染色分析PCR产物的变性梯度凝胶电泳分析条件为：采用变形梯度为35%～55%、质量分数为8%的聚丙烯酰胺凝胶（7mol/L纯度为100%的尿素、体积分数为40%的丙烯酰胺）作为变性剂，电泳缓冲液为1× TAE，150 V电泳5 h（60℃）.电泳结束后采用银染法染色[8-9].1.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序将DGGE条带用灭菌手术刀切割下来并回收目的条带.将切割下来的胶放入盛有缓冲液的离心管中4℃过夜.然后，以2μL回收产物为模板，采用引物338F （CCTACGGGAGGCAGCAG）和518R（ATTACCGCG GCTGCTGG）进行PCR 扩增.将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，与Pmd18-T载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，克隆培养.最后筛选阳性克隆，进行序列测定.2.1 DNA提取结果将从下列几份样品中提取的DNA片段通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检验，结果如图1、图2所示.由于环境样品组成复杂，因此，目标DNA片段能否顺利提取成为是否能采用PCRDGGE技术进行分析的重要前提[10].电泳结果显示，本实验可以顺利提取出样品中的DNA片段.2.2 PCR反复循环扩增后的DGGE分析图3泳道中的亮杆表示为条带，一般情况下，每一条条带代表了一种微生物[11].条带的粗细代表不同大小的密度，条带越粗表示密度越大，说明其代表的种群生物量越大，这种条带代表的微生物一般多数属于优势菌群.污泥中一共有45条条带，土壤中一共有40条条带，说明活性污泥和土壤中微生物种群丰富.2.3 菌种数的分析图4中从左到右分别为喷有联苯菊酯的土壤中微生物的种群数目、空白土壤中微生物的种群数目、经联苯菊酯驯化过的活性污泥中微生物的种群数目和未经驯化的原始污泥中微生物的种群数目.由图4可以看出，活性污泥中微生物的种群数目比土壤中微生物种群数目多，但是活性污泥中菌群类型少于土壤中菌种类型.因为污泥本身就是一个复杂的微生物生态系统，通过不断的驯化，使得污泥里的微生物不断进行调整，不断提升对环境的适应能力，提高了微生物种群的稳定性.处理土壤中变形菌门占总种群数目的50%，放线菌门占25%，拟杆菌门占 13%，厚壁菌门占12%；原始土壤中变形菌门占44%，放线菌门占11%，拟杆菌门占28%，酸杆菌门占17%；处理污泥中变形菌门占50%，拟杆菌门占42%，酸杆菌门占8%；原始污泥中变形菌门占48%，拟杆菌门占42%，酸杆菌门占10%.以上数据表明:土壤中变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是微生物群落的主要种群；活性污泥中变形菌门和拟杆菌门是构成微生物群落的主要种群.但是无论是在土壤还是污泥中，变形菌门所占比例最大，是该研究样品中的优势细菌类群.变形菌门在生态系统中分布广泛，Wagner等[12]人研究发现活性污泥中的细菌有60%属于变形菌门，其中α亚类数量非常庞大，对污染物的降解起着重要的作用.陈香碧等[13]人对喀斯特原生林土壤细菌的群落结构进行研究，发现变形菌门是该研究区土壤中的优势细菌类群.本实验的研究结果与上述文献一致.放线菌是原核生物的一个类群，最喜欢生活在有机质丰富的微碱性土壤中.图4显示土壤中有放线菌门，活性污泥里没有.造成这种情况的原因可能与活性污泥在实验前经过数日静置所引起的营养物质比例失调、pH值、溶氧量等因素发生变化有关，还需要进一步深入探索.1）通过质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳可成功提取样品中的DNA.2）通过DGGE分析发现，污泥和土壤中微生物种类丰富.污泥里的菌群类型要少于土壤里的菌群类型，但是在群落的种群数量上面，污泥要大于土壤.3）变形菌门和拟杆菌门是构成土壤和污泥微生物群落的主要种群，而变形菌门所占比例最大，是该研究样品中的优势细菌类群.4）受试土壤中的细菌种群比驯化后活性污泥中的细菌种群多了放线菌门.【相关文献】[1]葛斌，刘丽丽，李俊峰.土壤中农药的生物降解和生物修复综述［J］.环境保护与循环经济，2009，29（9）：71-73.[2]王峰，徐灿华，刘易，等.启动条件对活性污泥变形菌群落的影响［J］.同济大学学报（自然科学版），2007，35（7）：949-953.[3]FISCHER SG，LERMAN L S.Length-independent separa-tion of DNA restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis［J］.Cell，1979，16（1）：191-200. [4]GONGM L，REN N Q，XING D F.Application of denatur-ing gradient gel electrophoresis and temperature gradient gel electrophoresis in microbialmolecular ecology［J］.Acta Mi-crobiologica Sinica，2004，44（6）：845-848.[5]MUYZER G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems ［J］.Current Opinion in Microbiol-ogy，1999，2（3）：317-322.[6]MUYZERG，deWAAL EC，UITTERLINDEN A G.Profil-ing of complexmicrobial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA［J］.Applied and En-vironmentalMicrobiology，1993，59（3）：695-700.[7]刘飞.PCR-DGGE技术分析多菌态混合样品中微生物群落结构［D］.广州：华南理工大学，2012.[8]向少能，陈琳，何晓丽，等.水体微生物多样性PCRDGGE分析方法的比较研究［J］.重庆工学院学报（自然科学版），2007，21（7）：74-78.[9]陈章宝，向少能，江震献，等.PCR-DGGE研究微生物种群中多条带产生原因分析［J］.微生物学通报，2010，37（1）：147-154.[10]王峰，傅以钢，夏四清，等.PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点［J］.环境科学，2004，25（6）：74-79.[11]路莹.浅层地下水系统石油类污染物的生物降解机制研究［D］.长春：吉林大学，2013.[12]WAGNER M，AMANN R，LEMMER H，et al.Probing activated sludge with oligonucleotides spe cific for pro-teobacteria:inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure［J］.Applied and EnvironmentalMicrobiology，1993，59（5）：1520-1525.[13]陈香碧，苏以荣，何寻阳，等.不同干扰方式对喀斯特生态系统土壤细菌优势类群—变形菌群落的影响［J］.土壤学报，2012，49（2）：354-363.。
利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性
动 物肠道 中寄生 着种 类繁 多和数 量 巨大 的微生
鸡 饲 喂枯草 芽孢杆 菌 Ｄ１制剂 后 可显 著增 加 肠 道 中 乳 杆菌 的数 量和极 显 著 减 少 沙 门 氏菌 的数 量 ， 对 但 大肠杆 菌没 有影 响 。Ｔ ｏ等 口 ｅ 报道 肉鸡饲 喂每 ｔ 含 有 １ 。个枯草 芽 孢杆 菌 的饲 粮 ， 肠 道乳 杆 菌和 双 ０ 对 歧 杆菌 的数量 没有 影 响 ， 可 使有 害菌 如 大肠 杆 菌 但 和梭 菌 的 数 量 减 少 １～ ２ ｌ Ｃ Ｕ／ ） 但 利 用 ｇ（ Ｆ ｇ 。 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ Ｒ— ＲＩ ． Ｃ Ｃ ＤＧＧＥ分析 动物 饲喂芽 孢杆 菌 之后 肠道 菌群 结构 及 多样 性 未 见 报 道 ， 此本 试 验 因 拟通 过对 肉鸡 喂服 枯 草 芽孢 杆 菌 Ｐ ｂ ２菌 悬 液后 ， ａ０ 采用 Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ 和 Ｐ ＲＩ ． Ｃ ＣＲ． ＤＧＧＥ 方 法 研 究 肠 道 菌
微 生 物 培 养 的 分 子 生 物 技 术 为 研 究 肠 道 微 生 态 提 供
化后 ， 接种于 ２０ ０ｍＬ营养 肉汤 中，７℃、６ ／ ｎ ０ ３ １０ｒｍｉ
振 荡 培 养 １ 。５ ０ ０ｒ ｍｉ 、 离 心 ２ ｎ 收 ８ｈ ０ ／ ｎ ４ｏ Ｃ ０ｍｉ ，
了简便 而 快 捷 的 方 法 ］ 其 中变 性 梯 度 凝 胶 电泳 ， （ ＤＧＧＥ 技术 近年来 逐渐 被应 用于检 测猪 、 、 和 ） 牛 羊
PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究的开题报告
PCR-DGGE对六种淡水鱼类肠道菌群结构的比较研究的开题报告一、问题背景和研究意义淡水鱼类是我国水产养殖中的主要品种之一，其肠道菌群对鱼类的健康和生长发育起着重要作用。
鱼类在生长过程中会摄入不同类型的微生物，这些微生物在鱼类肠道中生长繁殖并对鱼类的代谢、免疫系统和生理功能发挥着关键作用。
因此，研究肠道微生物群落结构对于淡水鱼类的健康管理、营养需求和生物安全控制等方面都具有重要的意义。
传统的微生物学方法往往只能在单个约化培养基中检测少数菌株，这限制了肠道菌群复杂性的研究。
PCR-DGGE（聚合酶链式反应 - 变性梯度凝胶电泳）是一种非常常用和有效的分子生物学技术，可以快速和直接地比较不同微生物物种在肠道中的相对丰度。
因此，本研究旨在使用PCR-DGGE技术研究六种淡水鱼类的肠道微生物群落结构，分析不同鱼类的菌群多样性和群落相似性，以期为淡水鱼类的健康管理提供有价值的基础研究。
二、研究内容和方法1. 研究内容（1）采集鱼体样本本研究采集了六种淡水鱼类的肠道样本，包括草鱼、鲢鱼、鲤鱼、青鱼、黑鱼和鲶鱼等常见养殖鱼种。
（2）DNA提取采用常规的菌落PCR技术从肠道中提取总DNA。
（3）PCR-DGGE分析通过16S rRNA基因来检查鱼类肠道中的总细菌群落结构，并使用PCR-DGGE技术来比较鱼类的肠道微生物群落。
（4）数据分析通过聚类分析和多样性指数来比较不同鱼类的肠道微生物群落多样性和群落相似性。
2. 研究方法（1）样本采集收集六种淡水鱼类的肠道样本，将样本置于冰上，随后迅速用无菌手术刀割开腹腔，取出肠道内容物，将其放入1.5mL离心管中。
（2）DNA提取通过基本菌落PCR技术提取肠道样本的DNA。
（3）PCR-DGGE分析使用聚合酶链式反应研究每个样本的16S rRNA，然后通过变性梯度凝胶电泳技术分析PCR反应产物，以比较多个样本之间的菌群差异。
（4）数据分析使用聚类分析和多样性指数比较样本的差异。
PCR-DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性
PCR-DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性费鹏;白洪健;程述震;曹飞扬;郭鸰;姜亦超;苑秀娟;江岩【摘要】利用PCR-DGGE技术探究婴儿肠道菌群的多样性,为益生菌在婴儿配方乳粉中的应用提供理论依据.采用细菌的16S rDNA V3区通用引物,以15例食源性腹泻婴儿和15例健康婴儿粪便样本的总DNA为模板,PCR扩增后进行变形梯度凝胶电泳(DGGE)分析.结果表明:30份粪便样本的DGGE图谱均表现为高度多态性.食源性腹泻婴儿肠道菌群多样性与健康组婴儿肠道菌群多样性有明显差异,且食源性腹泻婴儿肠道菌群多样性较低.通过聚类分析和相似度分析,可以得出食源性腹泻婴儿的肠道菌群有高度的相似性,与健康婴儿的肠道菌群有明显的差异.PCR-DGGE技术可以初步分析婴儿肠道菌群的多样性,进而为婴儿配方乳粉的研制提供理论依据.%Purpose: The diversity of the infant intestinal microflora was analyzed by using the PCR-DGGE, providing theoretical basis for the application of probiotics in infant formula milk powder. Method: The universal primer of the bacterial 16S rDNA-V3 region was used as primer and the total DNA of food-bome diarrhea infants and health infants stool samples were used as a template. After PCR amplification, DGGE analysis was performed. Result: The DGGE profiles of the 30 stool samples were highly polymorphic. The diversity of the food-borne diarrhea infants was significantly different with healthy infants, and the Food-bome diarrhea infants had a lower intestinal diversity. By cluster analysis and similarity analysis, Can be drawn that the similarity of intestinal microflora of food-borne diarrhea infants was higher, and the intestinal microflora of food-bome diarrhea infants and healthy infants had obvious differences. Conclusion: PCR-DGGE technology canpreliminary analyze the diversity of the infant intestinal microflora, providing theoretical basis for the application of probiotics in infant formula milk powder.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2013(029)002【总页数】4页(P60-63)【关键词】婴儿配方乳粉;16S rDNA;PCR-GGE;肠道菌群多样性【作者】费鹏;白洪健;程述震;曹飞扬;郭鸰;姜亦超;苑秀娟;江岩【作者单位】东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文传统研究肠道菌群的方法存在极大的局限性，纯培养只能研究比较容易培养的微生物。
DGGE技术及其在微生物研究中的应用
变性梯度凝胶电泳--DGGE摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的有效工具被广泛的应用于现代微生物研究。
本文介绍了DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况，并讨论了其缺点及应用前景。
关键词：DGGE 分子生物学微生物群落菌群分析1 引言变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是由Fischer 和Lerman[1]于1979 年首先提出了, 并将其用于医学上基因点突变的检测。
与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比, 这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。
1985年, Myers RM[2]等人首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术, 使该技术日臻完善。
1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。
此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具, 并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。
2 基本原理PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。
梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。
电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。
当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。
由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。
桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化
桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化袁秀洁;李会平;黄大庄;黄秋娴;苏筱雨;侯晓杰【期刊名称】《蚕业科学》【年(卷),期】2009(35)2【摘要】为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR反应体系和程序,采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA,通过L16(45)正交组合试验和单因素梯度试验对MgC l2、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。
试验结果表明,采用改良的CTAB方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA质量较高,适宜于PCR扩增分析。
25μLPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 2.5μL,MgC l22.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,随机引物0.48μmol/L,TaqDNA聚合酶0.75 U,模板DNA 75 ng;退火温度60℃,循环次数30次。
【总页数】5页(P379-383)【关键词】桑天牛;肠道细菌基因组DNA;PCR反应体系;正交组合;单因素【作者】袁秀洁;李会平;黄大庄;黄秋娴;苏筱雨;侯晓杰【作者单位】河北农业大学【正文语种】中文【中图分类】S888.729;Q939.121【相关文献】1.提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的2种方法比较 [J], 孙娜;袁秀洁;李会平2.QIAamp及Biomed粪便细菌基因组DNA提取试剂盒提取人肠道细菌基因组DNA质量的差异 [J], 宋美茹;姚萍;张跃新3.QIAamp及Biomed粪便细菌基因组DNA提取试剂盒提取人肠道细菌基因组DNA质量的差异 [J], 宋美茹;姚萍;张跃新4.油梨基因组DNA提取，SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J],5.桑天牛卵啮小蜂基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化 [J], 袁芳芳;黄大庄;王志刚;王宝辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用PCR_DGGE技术对自然堆肥微生物群落多样性的分析
收稿日期：2009-03-11 基金项目：中国科学院知识创新工程重大项目（KSCX1-YW-09-09-03）；黑龙江省博士后基金（LBH-Z07226）；哈尔滨市科技创新人才 研究专项资金项目（2008RFQXN022）；哈尔滨市科技攻关计划项目（2007AA6CN105）；东北农业大学创新团队发展计划项目（CXT003-2-1）； 东北农业大学科学研究基金 作者简介：刘佳（1983-），女，黑龙江人，硕士，研究方向为农业微生物。 * 通讯作者：许修宏，教授，博士生导师，研究方向为食用菌、微生物肥料、微生物除草剂。E-mail: howard2857@hotmail. com
堆肥时间（d） Composting time
图 1 堆肥温度的变化
Fig. 1 Change of compost temperature
有拖尾现象，说明片段中还有大量的杂质，例如 腐殖酸类物质。为了不影响后续的 PCR 反应，需 要对粗提 DNA 进行纯化。本试验采用 OMEGA 凝 胶回收试剂盒对基因组 DNA 进行纯化。纯化后的 基 因 组 DNA 杂 质 明 显 减 少 ， 可 以 用 于 后 续 的 PCR 扩增的模板。以纯化后基因组 DNA 作为模 板进行 PCR 扩增，获得长度约为 240 bp 的特异 性片段。 2.3.2 堆肥细菌基因组 DNA 16S rDNA V3 区 DGGE 分析
PCR 反 应 体 系 ： 2.5 μL 10 ×PCR buffer， 2.5 μL dNTP， 引 物 各 0.5 μL， 模 板 0.5 μL， 1 μL DNA 聚合酶，补灭菌水至 25 μL。
PCR 反应条件：94 ℃预变性 3 min，然后 94 ℃ 变性 1 min，55 ℃退火 1min，72 ℃延伸 45 s，最 后 72 ℃保温 10 min，35 个循环。
提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的2种方法比较
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关 键词 ： 桑天 牛 ； 道 微 生 物 ； 因 组 Ｄ Ａ； 取 方 法 肠 基 Ｎ 提
中图分类号 ：７ ８５ ；９ ９ １ ￥ １ ．２ Ｑ ３ ．
文献标 志码 ： Ａ
Ｃｏ ｐ ｒ ｔｖ ｔ ｄ ｆ Ｔｗｏ Ｍ ｅ ｈ ｄ ｏ ｎ ｍ ｉ ｍ ａ ａ ｉｅ Ｓ ｕ ｙ ｏ ｔ ｏ ｓ ｆ ｒ Ｇｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｔ ａ ｔｏ Ｅｘ ｒ ｃ ｉ ｎ
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PCR-DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用
PCR-DGGE的原理及在动物肠道菌群分析中的应用吴高锋;李文刚;高卫科;魏娟;杨慧敏;王鑫【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2008(35)6【摘要】肠道菌群是机体常在菌群的重要组成部分,机体的健康和疾病的发生和发展与其多样性及种群的变化有着密切关系.因此,对肠道菌群进行研究具有重要意义.变性梯度凝胶电泳(DGGE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异,利用变性梯度胶进行分离.它是一种分析微生物群落的有效工具,可以用于研究肠道菌群结构多样性和种群结构的变化.作者对PCR-DGGE的原理、优缺点及在动物肠道菌群分析中的应用和前景作一简要综述.【总页数】3页(P37-39)【作者】吴高锋;李文刚;高卫科;魏娟;杨慧敏;王鑫【作者单位】河南农业大学,郑州,450002;郑州牧专,郑州,450011;河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002;河南农业大学,郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.PCR-DGGE法分析海参花酶解物对小鼠肠道菌群的影响 [J], 白雅婷;吴国宏;许智海;石林;何传波;熊何健;马英2.PCR-DGGE技术在动物胃肠道菌群多样性研究中的应用 [J], 徐博文;张琦3.应用PCR-DGGE和Q-PCR分析不同体重斑点叉尾(鮰)皮肤、鳃和胃肠道菌群结构 [J], 孙豪;时云朵;倪学勤;刘倩;曾东4.变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术在分析动物肠道菌群多样性中的应用 [J], 李峪鹏; 许祯莹; 李娟; 苏志鹏; 刘瀚扬; 朱佳文5.应用PCR-DGGE技术分析福寿螺胃肠道菌群 [J], 程天印;曲凌玄;王晓君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用PCR-DGGE技术快速检测鉴定饲用微生物
利用PCR-DGGE技术快速检测鉴定饲用微生物孙晓棠;龙良鲲;崔汝强;姚青;朱红惠【期刊名称】《华南农业大学学报》【年(卷),期】2010(031)004【摘要】针对目前国内外对饲用微生物添加剂中多种微生物的检测缺乏简捷有效手段这一现实状况,通过PCR-DGGE方法建立了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、粪肠球菌Enterococcus faecalis、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei 4种标准菌株的分子指纹图谱,建立了一套这4种微生物的快速同步检测技术,并用该检测技术对市场上一种饲用微生物添加剂进行分析,结果判定其含有6种优势菌群,包括植物乳杆菌和干酪乳杆菌.本技术还可以推广应用到目前国家允许添加的其他16种饲用微生物的检测,为饲用微生物添加剂产品质量监控提供了技术支撑.【总页数】4页(P72-75)【作者】孙晓棠;龙良鲲;崔汝强;姚青;朱红惠【作者单位】广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东,广州,510070;广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东,广州,510070;华南农业大学,园艺学院,广东,广州,510642;华南农业大学,园艺学院,广东,广州,510642;广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东,广州,510070【正文语种】中文【中图分类】Q938【相关文献】1.利用PCR-DGGE技术对自然堆肥微生物群落多样性的分析 [J], 刘佳;许修宏;李洪涛2.利用PCR-DGGE技术筛选分离海南黄帝椒产品微生物 [J], 李汉文;诸葛斌;方慧英;孙进;龚星慧;诸葛健3.利用PCR-DGGE技术分析生物陶粒硝化反应器中微生物群落动态 [J], 苏俊峰;马放;王弘宇;侯宁;高珊珊;王强4.利用PCR-DGGE技术鉴定氯酚降解菌株 [J], 尹艳华;胡学敏;陈沙沙5.利用PCR-DGGE技术指导高温油藏中功能微生物的分离 [J], 王君;马挺;刘静;刘清坤;赵玲侠;梁凤来;刘如林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的2种方法比较
提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的2种方法比较孙娜;袁秀洁;李会平【摘要】比较了改良CTAB法和改良SDS法两种提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的方法,结果表明:改良SDS法提取的DNA杂质较多,并且有部分降解;改良CTAB法提取的DNA纯度较高,适用于后续试验研究.【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(011)004【总页数】3页(P350-352)【关键词】桑天牛;肠道微生物;基因组DNA;提取方法【作者】孙娜;袁秀洁;李会平【作者单位】河北省承德县林业局,河北,承德,067400;河北农业大学,林学院,河北,保定,071000;河北农业大学,林学院,河北,保定,071000【正文语种】中文【中图分类】S718.52;Q939.1昆虫肠道中聚集着大量各种各样的微生物，其中大部分为细菌.这些微生物在昆虫的消化系统、免疫系统等起着重要作用.研究肠道微生物的传统方法是将其纯培养，但是，受现有技术条件的限制，目前，环境中99%以上的微生物还无法获得纯培养[1]，所以，传统的研究方法不能全面地反映环境中微生物的情况.近年来，随着现代分子生物学和微生物生态学的发展，利用分子生物技术研究昆虫肠道微生物得到了广泛应用.人们期望通过深入研究这些微生物的生理特性及相互关系，打破微生态环境从而达到防治害虫的目的.桑天牛(Apriona germari)在我国大部分地区均有分布，危害20多种林木及果树、桑树[2].目前关于桑天牛发生以及防治[2-8]等方面的研究较多，但主要集中于桑天牛的发生规律、白僵菌防治其幼虫以及卵寄生蜂等方面，而从分子生物学角度对桑天牛肠道细菌进行研究的较少.本研究从微生物生态学和分子生物学角度研究桑天牛肠道细菌，探索天牛防治的新途径.基因组DNA提取是利用分子生物技术研究肠道细菌的前提，为了提高后续实验结果的可信度，必须得到纯度较高并具有代表性的DNA样品.本实验对桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取方法进行了比较.1 材料与方法1.1 材料及主要试剂1)实验材料.桑天牛成虫于2008年7～9月采自河北农业大学标本园，饥饿过夜后在无菌条件下用75%酒精溶液浸泡3 min杀死，转入0.1%升汞溶液中消毒2min后移入灭菌水中清洗3次，然后进行无菌解剖，取出肠道，-20 ℃保存备用. 2)主要试剂.细菌通用引物和dNTP购于上海生工生物工程技术服务有限公司；goldview、琼脂糖和DL2000 Ladder Marker购于北京钧尧伟业生物技术中心，Taq DNA聚合酶、SDS、CTAB购于北京夏新生物技术有限公司.1.2 实验方法1.2.1 改良CTAB法提取桑天牛肠道基因组DNA取桑天牛成虫肠道1条放入研钵中，加入少量液氮进行冷冻并充分研磨.向研磨物中加入CTAB提取缓冲液1 mL，然后装入1.5 mL无菌离心管中，剧烈震荡5 s使研磨物与提取液充分混匀.65 ℃水浴1 h，期间每隔20 min轻轻翻转摇匀.水浴后室温放置5 min，用大口径枪头平均装入2个的新离心管中.先加入等体积的Tris-平衡酚，翻转数次摇匀后，10 000 r/min离心10 min，用大口径枪头吸取上清液于另一新离心管中.按照上一步骤重复抽提2～3次，然后加入V(酚)V(氯仿)V(异戊醇)为25241溶液10 000 r/min离心10 min，用大口径枪头吸取上清液于另一新离心管中.最后再加入V(氯仿)V(异戊醇)为241，溶液，10 000 r/min离心10 min，用大口径枪头吸取上清液于另一新离心管中.在上清液中加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH=5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，轻弹或翻转混匀，置于-20 ℃冰箱中沉淀10 min.12 000 r/min离心15 min，弃上清液.沉淀中加入1 mL 70%乙醇进行清洗，轻弹并翻转数次，12 000 r/min离心3 min，弃上清液.重复清洗1次.在超净工作台中风干15 min，然后在离心管中加入5～15 μL RNase(20 mg/mL)和25 μL TE缓冲液，37 ℃水浴1 h后-20 ℃保存备用.1.2.2 改良SDS法提取桑天牛肠道基因组DNA取桑天牛肠道1条，放入研钵中，加入适量石英砂充分研磨，再加入300 μL SDS 提取缓冲液和8 μL蛋白酶K(10 mg/ mL)进行匀浆，然后装入1.5 mL无菌离心管中.56 ℃温浴3 h以上，期间每隔一段时间轻轻翻转摇匀.水浴后冷却至室温，加人等体积的3 mol/L KAc(pH=7.0)，冰上放置1 h以上.10 000 r/min离心10 min，用大口径枪头取上清液于新离心管中，然后加入V(酚)V(氯仿)V(异戊醇)为25241溶液，翻转混匀数次，10 000 r/min离心10 min，用大口径枪头吸取上清液于另一新离心管中.加入1/10体积的3 mol/L NaAc(pH=7.0)和2倍体积预冷的无水乙醇，轻弹或翻转混匀，放置于-20 ℃冰箱过夜.10 000 r/min离心15 min，弃上清液收集沉淀.沉淀中加入70%乙醇清洗1次后8 000 r/min离心2 min，置于无菌工作台上风干,然后加入20 μL TE缓冲液溶解DNA，37 ℃水浴1 h，-20 ℃保存待用.1.2.3 基因组DNA的PCR扩增上述两种方法提取的基因组DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，选取提取效果好的基因组DNA作为模板进行PCR扩增.引物选用细菌通用引物(27f：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′).在25 μL反应体系中，模板DNA 1.5 uL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl 22.0 μL，dNTP 0.5 μL，随机引物1.5 μL，Taq酶0.15 U.PCR扩增的反应程序为共30次循环.扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，相对分子质量标准采用DL2000 DNA Ladder，在紫外凝胶成像系统下观察并照相.2 结果与分析2.1 两种方法提取桑天牛肠道细菌基因组DNA的效果用上述改良CTAB法和改良SDS法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的凝胶电泳图谱见图1.A 改良CTAB法；B 改良SDS法；泳道1，2为同一种提取方法的两个重复图1桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA提取结果Fig.1 The results of genomic DNA extraction of Apriona germari intestinal bacteriaM DL2000 ladder分子量标准；泳道1，2为同一DNA样品的两个重复图2 桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA PCR扩增结果Fig.2 The results of genomic DNA PCR reaction of Apriona germari intestinal bacteria改良CTAB法提取的桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA完整性较好，条带比较明亮，无拖尾现象，说明所提取的DNA纯度较高，适用于后续PCR扩增实验；采用改良SDS法提取的桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA量较大，但完整性差，杂质很多，并且降解严重，弥散于整条跑道，不适于后续研究.2.2 基因组DNA的PCR扩增结果以模板DNA作为靶基因，其用量与纯度是PCR成败的关键因素之一.以改良CTAB法提取的桑天牛成虫肠道基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增后的凝胶电泳图谱见图2，图中条带完整清晰，无拖尾现象，无非特异性条带，适用于后续研究.3 结论与讨论实验表明，采用改良CTAB法提取桑天牛成虫肠道微生物基因组DNA的效果较好，适用于后续实验研究.实验中DNA的提取参照袁芳芳等[2]、袁秀洁等[9]、张雪雁等[10]的方法.改良CTAB法效果好的原因主要是该方法针对桑天牛肠壁厚、组织皮层等杂质较多的特点，在研磨、纯化及杂质去除等步骤均优于改良SDS法.主要表现在以下3点：1)先采用液氮将肠道冷冻再迅速研磨，使细胞裂解更完全并降低了肠道微生物DNA在室温下降解的程度；2)反复使用Tris-平衡酚、酚/氯仿/异戊醇溶液、氯仿/异戊醇溶液对DNA样品进行抽提，有效地去除了样品中的杂质，使其具有较高的纯度；3)溶解DNA时适量加入RNase酶，确保可以有效地去除RNA.本实验利用分子生物学技术对桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取方法进行了对比，但是基因组DNA提取只是研究桑天牛肠道细菌多样性的部分前提步骤，进一步还包括PCR扩增、凝胶电泳和测序分析等的研究.【相关文献】[1] Amann R I，Ludwig W，Scheifer K H，et al.Phylogenetic Identification and in Situ Detection of Individual Microbial Cells without Cultivation[J].Microbiol Rev，1995，59(1)：143-169.[2] 袁芳芳，黄大庄，王志刚，等.桑天牛卵啮小蜂基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化[J].蚕业科学，2006，32(4)：584-587.[3] 孙孝龙，许平.桑天牛发生规律与防治对策[J].中国蚕业，2007，28(1)：24-26.[4] 王晓红，纪惠芳，黄大庄，等.桑天牛幼虫感染白僵菌后的组织病理学研究[J].蚕业科学，2008，34(1)：18-23.[5] 李会平，黄大庄，杜邵华，等.不同基质传代白僵菌对桑天牛幼虫的侵染力与寄主血淋巴酚氧化酶活性的关系[J].农药学学报，2008，10(2)：221-225.[6] 董廷富，彭炳香.桑天牛产卵规律的初步探讨与防治[J].中国蚕业，2003，24(4)：30-31.[7] 李继泉，杨元，王树香，等.桑天牛卵长尾啮小蜂的寄主选择定位行为[J].昆虫学报，2007，50(11)：1122-1128.[8] 王晓红，纪惠芳，黄大庄，等.桑天牛幼虫感染白僵菌后的组织病理学研究[J].蚕业科学，2008，34(1)：18-23.[9] 袁秀洁，李会平，黄大庄，等.桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA提取及PCR反应体系优化[J].蚕业科学，2009，35(2)：379-383.[10] 张雪雁，李琳琳.一种提取肠道细菌总基因组DNA的方法[J].新疆医科大学学报，2007，30(7)：722-724.。
基于PCR-DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立
基于PCR-DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2013(033)005【摘要】通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR-DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法.采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNA V3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析.SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌.改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR-DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障.【总页数】5页(P32-36)【作者】张素珍;李思施;韦婷婷;张凯;关家伟;吴大畅【作者单位】大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044;大连医科大学,生物技术系,辽宁大连,116044【正文语种】中文【中图分类】Q93-336【相关文献】1.基因组改组选育的益生性乳杆菌对小鼠肠道菌群的影响 [J], 赵玉娟;段翠翠;高磊;牛春华;于雪;李盛钰2.利用PCR-DGGE技术分析抗生素对小鼠肠道菌群多样性的影响 [J], 王春敏;佟丽波;韩桂华;任继秋;崔刚3.高脂饮食诱导的肥胖及肥胖抵抗小鼠肠道菌群元基因组的比较研究 [J], 王欢;李宛真;汪弋力;胡玲香;丁维俊4.PCR-DGGE法分析海参花酶解物对小鼠肠道菌群的影响 [J], 白雅婷;吴国宏;许智海;石林;何传波;熊何健;马英5.利用PCR-DGGE技术监测Lactobacillus plantarum WCFS1对小鼠肠道菌群的动态变化 [J], 吴青龙;陈廷涛;熊顺强;姜淑英;李胜杰;魏华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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０７１０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｑｕｉｒｅ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ，ＰＣＲ—ＤＧＧＥ
（由上海生Ｔ生物工程技术服务有限公司合成）用 于扩增。引物序列分别为：２７ｆ（５’一ＧＡＧＡＧＴＩＴ－
ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’），１４９５ｒ（５ ７・ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴ－
ＴＧ，１１’ＡＣＧＡ．３ ＣＡＧ－３
虫的健康状况就会受到严重的威胁。因此，对昆虫
肠道微生物多样性的研究受到关注。
７）；２７ｆ（５
４３
后将胶碾碎，加３０肛Ｌ水于沸水中煮沸１５ ｒａｉｎ，冷却 后离心，吸上清液一２０℃保存。以回收的ＤＮＡ为
模板，用不带ＧＣ环的引物２７ｆｆ５１９ｒ进行扩增。反
应体系（２５灿）：１０
ｘ
Ｂｕｆｆｅｒ ２．５斗Ｌ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｇＣｌ２ ２．０仙Ｌ，１０ ｍｍｏＬ／Ｌ ｄＮＴＰ
０．５止，８斗ｍｏＶＬ
Ｖ电泳７ ｈ，参照文献［１６］的方法用硝酸银染
色，观察并照相。 １．５优势条带的回收及克隆与测序
将ＤＧＧＥ图谱上每个样品共有的主要条带分
别割胶回收，加５０斗Ｌ灭菌双蒸水清洗２～３次，然
参照文献［１５］的方法提取肠道细菌基因组ＤＮＡ，并
万方数据
第１期
李会平等：利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术分析桑天牛成虫肠道细菌苗群
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，翮ｉｇｅｌｌａ．Ｐａｎｔｏｅａ，Ｓｅｒｒａｔｉａ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｔｒａｉｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｗａｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ．ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ
１．５ ２．５ ＩｘＬ，２５ ｍｍｏＬ／Ｌ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ）技术利用序列不同的ＤＮＡ 片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理， 通过梯度变性胶将不同细菌的ＤＮＡ分开心Ｊ，具有 直观、快速和不依赖于细菌培养的优点，已广泛应 用于微生物群落的多样性分析和种群的动态 监测‘３－１３］。
中图分类号￥８８８．７２＋９；Ｑ９３９．１２１
Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ
ｏｎ
Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ
Ａｄｕｌｔ Ｂａｓｅｄ
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＬＩ Ｈｕｉ—Ｐｉｎｇ １・孙ＹＵＡＮ Ｘｉｕ—Ｊｉｅ’ＳＵ Ｘｉａｏ—Ｙｕｌ・２ （１ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ Ｈｅｂｅｉ ０７１０００，Ｃｈｉｎａ；２ Ｔｈｅ Ｔｒｅｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｐｒｏｔｅｃ—
ｚ如酶，５０ ｎｇ／ＩｒＬ模 板ＤＮＡ ２．０ ｗＬ。反应程序：９４℃预变性５ ｍｉｎ； ９４℃变性２ ｒａｉｎ，５３ ｏＣ退火３０ ｓ，７２℃延伸ｌ ｍｉｎ，
ｂａｃｔｅｒｉａ；１６Ｓ
收稿日期：２０１１—０８—１５接受日期：２０１１一０９一１６ 资助项目：河北省教育厅科研项目（Ｎｏ．２００９１２９），河北省强势特色 学科资助项目（Ｎｏ．２００８０１３）。 第一作者信息：李会平（１９７４一）．女，博士．副教授。硕士生导师。
Ｅ・ｍａｉｌ：ｈｕｉｐｉｎｇｌｉ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ’Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａＵｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｕｉｐｉｎｇｌｉ＠ｓｏｈｕ．ｏｏｍ
度后，用水平电泳分析样品。采用１０％聚丙烯酰胺
凝胶（变性梯度为２７％一３８％），上样量７止，重复３
次点样。在６０℃、１×ＴＡＥ电泳缓冲液的条件下，
１３０
室内饲养１周后，选择生长健康的成虫饥饿过夜，待 其排空体内食物残渣后供试。
１．２桑天牛成虫肠道细菌基因组ＤＮＡ提取 取供试桑天牛成虫肠道１条，液氮充分研磨后，
ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ２７Ｆ／１ ４９５Ｒ ａｎｄ ２７Ｆ／５１ ９ｒ＋ＧＣ ｕｎ ＪｖｅｒｓａＩ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ａｒｏｕｎｄ ５００ ｂｐ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）．Ａｆｔｅｒ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｎｄ ａ— ｎａｌｙｓｉｓ，ＤＮＡ ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，８ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ
Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ．Ａｆｔｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｏｆ Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ ａｄｕｌｔ，ｗｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ １ ６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３
来达到害虫防治的目的。本课题组已采用传统方
ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５¨Ｌ，８ ｐＬ，０．１５ Ｕ
ｌ上ｍｏＬ／Ｌ上、下游引物各１．５
２．０
Ｔａｑ酶，５０ ｎｇ／斗Ｌ模板ＤＮＡ
ｗＬ。反
法对几株桑天牛成虫肠道优势细菌进行了分离与
鉴定【ｌ ４｜，为弥补传统研究方法对不可培养细菌分离 和鉴定存在的缺陷，本研究应用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术对 桑天牛成虫肠道细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ基因Ｖ３片段的
Ｍ薛１２
２．０
“Ｌ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．５¨Ｌ，８ ｖ，Ｌ，０．１５ Ｕ
ｖ，ｍｏｌ／Ｌ上、下游弓Ｉ ｏｃ变性
Ｔａｑ酶，５０ ｎｇ／ｖ，Ｌ模板ＤＮＡ
ｍｉｎ；９４
ｖ，Ｌ。反应程序：９５℃预变性２
ｍｉｎ。
３０ ｓ，６０
ｏＣ退火ｌ ｍｉｎ，７２℃延伸４ ｍｉｎ，共３０个循
桑天牛（Ａｐ而№ｇｅｒｍａｒｉ）是包括桑树在内的多 种林木、果树、花卉的主要蛀干害虫，也是近年来我
ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＰＣＲ—ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
昆虫肠道中存在大量微生物，一般认为这些微
生物是寄主昆虫正常生长发育所不可缺少的。它
们不仅在宿主体内的维生素合成、脂肪和碳水化合
万方数据
４２
蚕业科学ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２０１２；粥（１）
物的吸收与利用中起着重要作用，而且在宿主抵御 外来菌的侵入与定植，以及促进宿主免疫系统的过
摘要利用ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术分析桑天牛成虫肠道茵群结构及优势茵群，获取桑天牛肠道微生物的多样性信息。从桑天牛 成虫肠道中提取细茵基因组ＤＮＡ。以细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ基因通用引物２７Ｆ／１４９５Ｒ和２７Ｆ／５１９ｒ＋Ｇｃ进行Ｖ３可变区ＰＣＲ扩增，将
长约５００ ｂｐ的扩增产物经变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）分离后，进行优势条带分析、ＤＮＡ回收、克隆、测序等，初步得到分别属
Ｓｅｒｒａ妇．Ｂｌａｓｔ
ｓｅａｒｃｈ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａＩ １ ６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ６ ｂａｃｔｅｒｉａＩ ｓｔｒａｉｎｓ ｓｈｏｗ— ｉｎｇ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ９７％，ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ５ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ．
ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物进行ＤＧＧＥ电泳及优势条带的测序分析， 获取桑天牛成虫肠道菌群多样性及优势菌群的初
步信息，为开辟桑天牛生物防治的新途径提供基础
ｒＤＮＡ Ｖ３区
依据。
１材料与方法
１．１材料 ２００９年８月自河北农业大学西校区标本园内 采集刚羽化的桑天牛成虫，寄主植物为桑树（Ｍｏｒｕｓ Ｌ．）。野外采集的桑天牛成虫以桑树的幼嫩枝条在
Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉ－－ ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ Ａ．ｇｅｒｍａｒｉ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ａｐｒｉｏｎａ ｇｅｒｍａｒｉ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
于肠杆茵属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、不动杆茵属（Ａｃｉｎｅｗｂａｃｔｅｒ）、埃希氏茵属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、志贺茵属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、克雷伯氏茵属（Ｋｌｅｂ— ｓｉｅｌｌａ）、柠檬酸茵属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、泛茵属（Ｐａｎｔｏｅａ）和沙雷氏茵属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）的８个细菌菌株，其中优势细菌为克雷伯氏茵属的细 菌菌株，其次是沙雷氏茵属的细茵菌株。将获取的细菌１６Ｓ ｒＤＮＡ序列在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对分析，相似度在 ９７％以上的有６个菌株，其中有５个茵株与传统方法分离菌株的鉴定结果一致，表明基于１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ．ＤＧＧＥ技术可用于 桑天牛肠道茵群多样性研究。 关键词 桑天牛；肠道细菌；１６Ｓ ｒＤＮＡ序列；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术 文献标识码Ａ 文章编号０２５７—４７９９（２０１２）０１—００４１—０５
应程序：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃变性１０ Ｓ，６３℃退 火３０ ｓ，６８℃延伸３ ｍｉｎ，共１０个循环，每２次循环 退火温度下降２℃；９４℃变性２ ｍｉｎ，５３℃退火３０ Ｓ，６８℃延伸３ ｍｉｎ，共２５个循环；６８℃延伸１０ １．４桑天牛成虫肠道细菌基因组１６Ｓ 扩增片段的变性梯度凝胶电泳 １．４．１最佳变性剂浓度梯度的确定采用Ｂｉｏ．Ｒａｄ Ｄｃｏｄｅ通用突变检测系统（美国，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）进行 ＤＧＧＥ电泳。凝胶的变性梯度方向与电泳方向垂 直，以确定平行胶变性剂浓度的范围。 １．４．２样品的ＤＧＧＥ电泳在确定最佳的变性梯