细胞培养基本方法从体内到体外优秀课件
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细胞培养的基本方法 PPT课件
吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打 重悬 分装 放入温箱
细胞的换液
悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。 或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。
贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。
细胞的冻存
原代消化培养法
（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 （2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 （4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。
（1）细胞复苏原则：快速融化（快融）。
（2）尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。 ① 预先准备好离心管并加入新鲜培养液；② 在1分钟之内将细胞融化；③ 立 刻将融化后的细胞倒入离心管中。 （3）复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤， 降低细胞存活率。 （4）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。
传代方法：
悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。
细胞的传代
悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液； （2）离心（1000转/分，2分钟）； （3）弃上清； （4）加入新鲜培养基重悬细胞； （5）按照适当比例接种到新的培养皿； （6）补足培养基； （7）放于温箱培养。
重悬 分装 放入温箱
细胞的传代
贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面； （2） 加入胰酶消化细胞； （3）加入新鲜培养基终止胰酶消化； （4）将细胞吹打下来，收集，离心； （5）弃上清； （6）加入新鲜培养基重悬细胞； （7）按照适当比例接种到新的培养皿； （8）补足培养基； （9）放于温箱培养。
细胞的换液
悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。 或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培养基即可。
贴壁细胞换液：弃去陈旧培养基、PBS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。
细胞的冻存
原代消化培养法
（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 （2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 （4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。
（1）细胞复苏原则：快速融化（快融）。
（2）尽量减少室温下DMSO和细胞接触的时间。 ① 预先准备好离心管并加入新鲜培养液；② 在1分钟之内将细胞融化；③ 立 刻将融化后的细胞倒入离心管中。 （3）复苏时，离心时间不宜过长，1分钟即可，长时间离心会对细胞造成损伤， 降低细胞存活率。 （4）死亡的细胞应尽快清除掉，否则会影响存活细胞的状态。
传代方法：
悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。
细胞的传代
悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液； （2）离心（1000转/分，2分钟）； （3）弃上清； （4）加入新鲜培养基重悬细胞； （5）按照适当比例接种到新的培养皿； （6）补足培养基； （7）放于温箱培养。
重悬 分装 放入温箱
细胞的传代
贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面； （2） 加入胰酶消化细胞； （3）加入新鲜培养基终止胰酶消化； （4）将细胞吹打下来，收集，离心； （5）弃上清； （6）加入新鲜培养基重悬细胞； （7）按照适当比例接种到新的培养皿； （8）补足培养基； （9）放于温箱培养。
第一章细胞培养技术的基本理论知识优秀课件
注意：体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体，体 外实验结果不能与体内实验结果完全等同！！
第二节 培养细胞生物学
一、体内外细胞分化的差异
1.细胞增殖和分化：增殖使细胞数量增多；分化使机体结 构和功能多样化，最后演变成完整的有机体. 接触抑制和密度抑制
2.体内外细胞的差异：细胞在体外培养后，一旦失去神经 体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环 境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖 （Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态； 分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。
三、体外培养细胞的形态
1.贴壁型
上皮型细胞 成纤维细胞型 游走细胞型 多形型。
1
4
2
3
(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞
贴壁型细胞：必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴壁型细胞
贴壁是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方 式，细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面 才能生存和生长，因而属于贴壁型细胞。
目前已有很多种细胞能在体外培养生长，包括正常细胞和肿瘤细胞。例如： 成纤维细胞、骨骼组织(骨及软骨)、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺、皮
胺、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。
上皮样细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上 不完全等于
来源：来源于外胚层，内胚层细 胞（个别例外）如：皮肤及 其衍生物，消化道，乳腺， 肺泡，上皮性肿瘤
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞 质 向 外 伸 出 2—3 个 长 短 不 等 的 突起，中有卵圆形核
生长特点
排列成放射状，漩涡状并不紧靠 连成片，
第二节 培养细胞生物学
一、体内外细胞分化的差异
1.细胞增殖和分化：增殖使细胞数量增多；分化使机体结 构和功能多样化，最后演变成完整的有机体. 接触抑制和密度抑制
2.体内外细胞的差异：细胞在体外培养后，一旦失去神经 体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环 境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖 （Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态； 分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。
三、体外培养细胞的形态
1.贴壁型
上皮型细胞 成纤维细胞型 游走细胞型 多形型。
1
4
2
3
(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞
贴壁型细胞：必须贴附于底物才能生长的细胞称为贴壁型细胞
贴壁是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方 式，细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面 才能生存和生长，因而属于贴壁型细胞。
目前已有很多种细胞能在体外培养生长，包括正常细胞和肿瘤细胞。例如： 成纤维细胞、骨骼组织(骨及软骨)、心肌与平滑肌、肝、肺、肾、乳腺、皮
胺、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞及各种肿瘤细胞等。
上皮样细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上 不完全等于
来源：来源于外胚层，内胚层细 胞（个别例外）如：皮肤及 其衍生物，消化道，乳腺， 肺泡，上皮性肿瘤
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞 质 向 外 伸 出 2—3 个 长 短 不 等 的 突起，中有卵圆形核
生长特点
排列成放射状，漩涡状并不紧靠 连成片，
《细胞培养基础》PPT课件
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、 温度等影响。
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
细胞培养基本技术PPT课件
细胞培养基本技术ppt课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
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（osmotic pressure of humor） ４、细(hyperthermy)对细胞生存的影响：
导致酶的变性而失活
破坏细胞膜的类脂质
高热
细胞核分裂异常
破坏纺锤体
细胞浆外层的钙释放
代谢停止 细胞膜渗透性变化 多极分裂出现 停止在中期 凝固酶使细胞凝固
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
２、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）
氧 是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨
（一）体内细胞生存的营养条件
１、水（water） ２、无机盐（inorganic salt） ３、葡萄糖（glucose） ４、维生素（vitamin） ５、氨基酸（amino acid）
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细 胞缺氧不能生存。
酸碱度 酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度
的负对数值。 各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适
当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐 受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。
这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。
（三）体外生长大环境
１、体外培养实验室 ２、体外培养实验室的设备和器具
１、体外培养实验室
由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须 保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。
组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因 素的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发 生烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清 新区。
低温(hypothermy)
大多数细胞在接近冰点的温度下仍能存活，当温 度达到冰点时细胞活动就要相对停止。
温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生 结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分 从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓 度升高。
细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。
低温(hypothermy)
实验室设计应根据研究任务、目的和规模（小组、研 究室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空 间要求，最小不应小于50m2。如接近50m2上下，以一大一小 为好。
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
４、细胞之间的相互联系
细胞间相互联系的基础是胞间通讯。 胞间通讯有三种类型：
直接接触型：特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系； 直接联系型：通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；
间接联系型：是细胞间通讯的最主要的途径。通过激素、
神经递质、局部化学介导因子等化学信号 的传播。
细胞增生的接触性抑制
细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时， 细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖 到一定密度后，细胞增殖停止。
细胞培养基本方法 从体内到体外
体外培养（in vitro culture）的概念
将活体结构成分取出，放在类似于体内 生存环境的体外环境中，让其生长和发育的 方法。
细胞培养（cell culture）
组织培养（tissue culture）
器官培养（organ culture）
体外培养技术的应用
• 在组织学与胚胎学领域的应用 • 在细胞生物学领域的应用 • 在肿瘤学方面的应用 • 在微生物学领域的应用 • 在免疫学方面的应用 • 在药理学领域的应用
体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。
血浆晶体渗透压： 由Na+、K+、 Cl－、 HCO 3 － 等构成； 血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；
正常血浆渗透压范围为：280~310 mOsm/kg 主要由晶体渗透压组成。
等渗溶液(isosmotic solution)：在正常血浆渗透压范围内的溶液； 高渗溶液(hyperosmotic solution)：高于310 mOsm/kg的溶液； 低渗溶液(hyposmotic solution;)：低于280 mOsm/kg的溶液。
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
３、体液渗透压（osmotic pressure of humor）
体外培养的优点
• 简化细胞的生长环境 • 方便施加实验因素 • 容易观测实验结果 • 便于获得均一细胞群 • 能够进行大规模生物制品的生产
体外培养的基本原理与技术
一、从体内生存环境到体外生长条件 二、体外培养的基本方法和过程 三、体外培养物的生长生物学 四、细胞分离与纯化 五、细胞系（株）、细胞克隆 六、培养物的观察检测方法
慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至-40℃时，细胞外 的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内 引起冰晶。
快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶，不仅使 细胞内的溶质浓度增高到有害的程度， 而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。
所以：
在冷冻状态下，要减少细胞的损伤， 应逐渐降温，而不宜迅速降温。
（二）体内细胞生存的其它条件
一、从体内生存环境到体外生长条件
体外（in vitro）培养技术就其实质而言， 就是模拟体内（in vivo）的生理环境，在无 菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下， 使活体的结构成分在体外环境中生存和生长， 并维持其结构和功能。
一、从体内生存环境到体外生长条件
（一）体内细胞生存的营养条件 （二）体内细胞生存的其它条件 （三）体外生长大环境 （四）培养用液 （五）细胞在体外生长的其它条件 （六）清洗和消毒
导致酶的变性而失活
破坏细胞膜的类脂质
高热
细胞核分裂异常
破坏纺锤体
细胞浆外层的钙释放
代谢停止 细胞膜渗透性变化 多极分裂出现 停止在中期 凝固酶使细胞凝固
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
２、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）
氧 是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨
（一）体内细胞生存的营养条件
１、水（water） ２、无机盐（inorganic salt） ３、葡萄糖（glucose） ４、维生素（vitamin） ５、氨基酸（amino acid）
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细 胞缺氧不能生存。
酸碱度 酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度
的负对数值。 各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适
当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐 受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。
这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。
（三）体外生长大环境
１、体外培养实验室 ２、体外培养实验室的设备和器具
１、体外培养实验室
由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须 保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。
组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因 素的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发 生烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清 新区。
低温(hypothermy)
大多数细胞在接近冰点的温度下仍能存活，当温 度达到冰点时细胞活动就要相对停止。
温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生 结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分 从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓 度升高。
细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。
低温(hypothermy)
实验室设计应根据研究任务、目的和规模（小组、研 究室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空 间要求，最小不应小于50m2。如接近50m2上下，以一大一小 为好。
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
４、细胞之间的相互联系
细胞间相互联系的基础是胞间通讯。 胞间通讯有三种类型：
直接接触型：特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系； 直接联系型：通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；
间接联系型：是细胞间通讯的最主要的途径。通过激素、
神经递质、局部化学介导因子等化学信号 的传播。
细胞增生的接触性抑制
细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时， 细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖 到一定密度后，细胞增殖停止。
细胞培养基本方法 从体内到体外
体外培养（in vitro culture）的概念
将活体结构成分取出，放在类似于体内 生存环境的体外环境中，让其生长和发育的 方法。
细胞培养（cell culture）
组织培养（tissue culture）
器官培养（organ culture）
体外培养技术的应用
• 在组织学与胚胎学领域的应用 • 在细胞生物学领域的应用 • 在肿瘤学方面的应用 • 在微生物学领域的应用 • 在免疫学方面的应用 • 在药理学领域的应用
体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。
血浆晶体渗透压： 由Na+、K+、 Cl－、 HCO 3 － 等构成； 血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；
正常血浆渗透压范围为：280~310 mOsm/kg 主要由晶体渗透压组成。
等渗溶液(isosmotic solution)：在正常血浆渗透压范围内的溶液； 高渗溶液(hyperosmotic solution)：高于310 mOsm/kg的溶液； 低渗溶液(hyposmotic solution;)：低于280 mOsm/kg的溶液。
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
３、体液渗透压（osmotic pressure of humor）
体外培养的优点
• 简化细胞的生长环境 • 方便施加实验因素 • 容易观测实验结果 • 便于获得均一细胞群 • 能够进行大规模生物制品的生产
体外培养的基本原理与技术
一、从体内生存环境到体外生长条件 二、体外培养的基本方法和过程 三、体外培养物的生长生物学 四、细胞分离与纯化 五、细胞系（株）、细胞克隆 六、培养物的观察检测方法
慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至-40℃时，细胞外 的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内 引起冰晶。
快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶，不仅使 细胞内的溶质浓度增高到有害的程度， 而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。
所以：
在冷冻状态下，要减少细胞的损伤， 应逐渐降温，而不宜迅速降温。
（二）体内细胞生存的其它条件
一、从体内生存环境到体外生长条件
体外（in vitro）培养技术就其实质而言， 就是模拟体内（in vivo）的生理环境，在无 菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下， 使活体的结构成分在体外环境中生存和生长， 并维持其结构和功能。
一、从体内生存环境到体外生长条件
（一）体内细胞生存的营养条件 （二）体内细胞生存的其它条件 （三）体外生长大环境 （四）培养用液 （五）细胞在体外生长的其它条件 （六）清洗和消毒