薄层层析
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氨基酸的薄层层析
(Thin layer chromatography of amino acids)
实验目的
• 掌握薄层层析法的一般原理。 • 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 • 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定
被分离的物质（即氨基酸混合液）。
层析基本概念
• 层析技术是利用化合物中各组分的物理性质 （如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分 子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同， 使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动 相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最 终被分离。
实验材料
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
展开剂-显色剂
• 展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正 丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。
• 0.1%茚三酮溶液：取茚三酮0.1g溶于无水 丙酮至100ml。
操作步骤—点样
1、位置：用铅笔距底边
2cm水平线上均匀确定4个
点。每个样品间相距约1cm。
2、取样：用毛细管分别吸
取氨基酸溶液，取样量为
毛细管柱高5cm。
3、点样：点样毛细管轻轻
接触薄层表面点样。加样
后原点扩散直径不超过
2mm。
轻触疾起
Ala Lys Gly Mix
点间距1cm
距底边 2cm
操作步骤— 展层、显色
今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄 层层析，合到一起叫：吸附薄层层析。
硅胶薄层层析
实验原理
1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为
固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时， 由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨 基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的 混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因 而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解 吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
小心量出斑点中心至原点中心距 离，再量出原点中心至溶剂前沿的距 离，计算出它们的 Ｒｆ值。
根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中 氨基酸的种类，并绘出层析图谱。
数据处理
样品
斑点-原点
溶剂前缘-原点
Rf值
Lys
Gly
Ala 混合液
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，
• 流动相：在层析过程中，推动固定相上待 分离的物质移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层 层析时称为展开剂。
层析技术的分类
（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析， 前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。
（2）按操作形式不同，可分为柱层析、ห้องสมุดไป่ตู้层层析和 纸层析。
（3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层 析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。
将薄层板点样端浸入展开 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展开剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在90℃下烘干30min，即 可显出各层斑点。
Ala Lys Gly Mix
结果计算
斑点至原点距离
• Rf = 溶剂前缘至原点距离
易造成 斑点过大，互相交叉或拖尾。 4.样品点不能浸入展开剂中。 5.若多次点样，用冷风吹干，避免破坏氨基酸，且最好从
玻板背面吹。
复习思考题
• 硅胶的吸附力与含水量的关系是怎样的？ • 为何尽量避免手与薄层层析板面的接触？ • 为何有时样品斑点不显色？
• 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的 物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可 用于大量物质的分离纯化和制备。
层析基本概念
• 固定相：固定相是层析的一个基质。包括 固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂 等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素 上的溶液），这些物质能与相关的化合物 进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。
• 展开-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀 展开剂和0.1%茚三酮溶液。
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然晾 干。 4、活化 70℃烘干60分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
茚三酮
还原型茚三酮
实验原理
3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置 用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离 与溶液前沿的距离之比为Rf值。(即原点到斑点 中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。) 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定 的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可 以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
(Thin layer chromatography of amino acids)
实验目的
• 掌握薄层层析法的一般原理。 • 掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 • 掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定
被分离的物质（即氨基酸混合液）。
层析基本概念
• 层析技术是利用化合物中各组分的物理性质 （如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分 子极性、分子亲和力、分配系数等）的不同， 使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动 相从固定相上流过，不同组分以不同速度而最 终被分离。
实验材料
• 吸附剂：硅胶 • 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠 • 氨基酸的异丙醇溶液
丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸 • 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） • 分析样品：氨基酸混合液
展开剂-显色剂
• 展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正 丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。
• 0.1%茚三酮溶液：取茚三酮0.1g溶于无水 丙酮至100ml。
操作步骤—点样
1、位置：用铅笔距底边
2cm水平线上均匀确定4个
点。每个样品间相距约1cm。
2、取样：用毛细管分别吸
取氨基酸溶液，取样量为
毛细管柱高5cm。
3、点样：点样毛细管轻轻
接触薄层表面点样。加样
后原点扩散直径不超过
2mm。
轻触疾起
Ala Lys Gly Mix
点间距1cm
距底边 2cm
操作步骤— 展层、显色
今天要做的试验，根据原理属于吸附层析，根据操作形式又属于薄 层层析，合到一起叫：吸附薄层层析。
硅胶薄层层析
实验原理
1.薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为
固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时， 由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨 基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的 混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因 而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解 吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）
实验原理
硅胶吸附薄层层析
• 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 • 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种
多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性 硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许 多化合物形成氢键而产生吸附.
实验原理
硅胶吸附薄层层析的特点：
① 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活 性也与含水量呈负性相关。
小心量出斑点中心至原点中心距 离，再量出原点中心至溶剂前沿的距 离，计算出它们的 Ｒｆ值。
根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中 氨基酸的种类，并绘出层析图谱。
数据处理
样品
斑点-原点
溶剂前缘-原点
Rf值
Lys
Gly
Ala 混合液
注意事项
1.切勿用手直接接触薄层板面。 2.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴。 3.样品量太少，有的成分不易显示；样品量太多，
• 流动相：在层析过程中，推动固定相上待 分离的物质移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层 层析时称为展开剂。
层析技术的分类
（1）按两相所处状态，可分为液相层析和气相层析， 前者以液体为流动相，后者以气体为流动相。
（2）按操作形式不同，可分为柱层析、ห้องสมุดไป่ตู้层层析和 纸层析。
（3）按层析的原理不同，可分为吸附层析、分配层 析、凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。
将薄层板点样端浸入展开 -显色剂，展层-显色剂液面 应低于点样线。盖好层析缸 盖，上行展层。当展开剂前 沿离薄板顶端2cm时，停止 展层，取出薄板，用铅笔描 出溶剂前沿界线，用热风吹 干或在90℃下烘干30min，即 可显出各层斑点。
Ala Lys Gly Mix
结果计算
斑点至原点距离
• Rf = 溶剂前缘至原点距离
易造成 斑点过大，互相交叉或拖尾。 4.样品点不能浸入展开剂中。 5.若多次点样，用冷风吹干，避免破坏氨基酸，且最好从
玻板背面吹。
复习思考题
• 硅胶的吸附力与含水量的关系是怎样的？ • 为何尽量避免手与薄层层析板面的接触？ • 为何有时样品斑点不显色？
• 特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的 物质。不仅可用于少量物质的分离纯化，也可 用于大量物质的分离纯化和制备。
层析基本概念
• 固定相：固定相是层析的一个基质。包括 固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂 等）和液体物质（如固定在硅胶或纤维素 上的溶液），这些物质能与相关的化合物 进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。
② 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用 于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它 分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不 能过高。
实验原理
2. 氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基
酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与 此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生 成蓝紫色化合物而使氨基酸斑点显色。
• 展开-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀 展开剂和0.1%茚三酮溶液。
器材
• 层析板、尺子、铅笔 • 烧杯、玻棒、量筒 • 吹风机 • 毛细管、层析缸 • 药匙 • 烘箱
操作步骤—薄层板的制备
1、调浆 称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤 维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2、涂布 取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥 将玻璃板水平放置，室温下自然晾 干。 4、活化 70℃烘干60分钟。切断电源，待玻 璃板面温度下降至不烫手时取出。
茚三酮
还原型茚三酮
实验原理
3.混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置 用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离 与溶液前沿的距离之比为Rf值。(即原点到斑点 中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。) 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定 的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可 以根据Rf值来鉴定被分离的物质。