肠道病毒71型分子生物学研究

合集下载

新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究

新型肠道病毒71型灭活疫苗免疫策略关键技术研究大量研究已表明手足口病(HFMD)患者中的重症及死亡病例主要是由EV71所致。

自1969年美国首次从患儿的粪便中分离出肠道病毒71型(EV71)以来,世界多个国家和地区均有EV71暴发和流行的报道。

近年来,HFMD的流行成为我国大陆、台湾地区以及东南亚国家的重大公共卫生问题之一,造成巨大的经济和社会负担。

目前,临床上尚无治疗HFMD的特效药物。

疫苗成为预防和控制该病的传播与流行的最有效的手段。

研发有效的疫苗,探索科学合理的免疫策略,具有重大的社会意义。

本课题针对北京微谷生物制药有限公司研发的新型EV71灭活疫苗(本文简称EV71疫苗)开展免疫策略关键技术的研究。

【研究目的】1.确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型和免疫程序。

2.评价E V 7 1疫苗诱导的免疫反应的持久性,探讨加强免疫的必要性。

3.确定EV71疫苗针对EV71所致HFMD/疾病的保护效力。

4.研究EV71疫苗保护效力的免疫学替代终点。

5.探索EV71疫苗与其他肠道病毒之间可能存在的交叉免疫/保护作用。

6.研究不同批次E V71疫苗的批间一致性。

【研究方法】1.EV71疫苗的最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究采用随机双盲、安慰剂对照的研究设计,选择幼儿组(12~60月龄)600人、婴儿组(6~11月龄)600人,研究不同剂型不同剂量的EV71灭活疫苗(含佐剂160U、含佐剂320U、含佐剂640U疫苗以及无佐剂640U疫苗)的免疫原性和安全性。

比较受试者接种一针次和两针次疫苗后血清抗体水平的差异及不良反应发生率,确定EV71疫苗的最佳免疫剂量、剂型及免疫程序。

2.EV71疫苗免疫持久性和加强免疫研究基于最佳免疫剂量剂型及免疫程序研究的队列,随访至第1针免疫后第8月和第14月进行血清检测,观察EV71疫苗诱导的抗EV71中和抗体的持久性。

采用巢式随机双盲对照研究设计,在14个月时对已经完成两针次基础免疫的受试者进行再次招募入组,按2:1随机分配给予相同剂量剂型的ev71疫苗或安慰剂进行1针次加强免疫研究,比较各组受试者加强或不加强后的血清抗体反应水平差异,评价加强免疫的效果。

肠道病毒71型分子生物学研究进展

关键词：肠道病毒７型；ｌ毒力；流行病学；疫苗
Ｐｏｒｓｆｒｓａｃｎｔｅｍｏｅｕａｉｌｇｆｅｔｒｖｒｓ７ｒｇｅｓｏｅｅｒｈｏｈｌｃｌｒｂｏｏｙｏｎｅｏｉｕ１
ＬＩＬｉｎ，ＺＨＵ — ｎＵ — ＹａＱｉＲｏｇ
（ａｄｆｏｎｕｈｄｓａｅＨＦｈｎ，ｏｔａｄｍｏｔｉｓ，ＭＤ）在临上ｅ，
１Ｅ７Ｖ１的结构特征
Ｅ１是小ＲＮＡ病毒科（ｉｒａｉｉｅ肠道Ｖ７ｐｃｎｖｒａ）ｏｄ
病毒属成员。病毒颗粒为二十面体立体对称的球形
结构，包膜和突起，无直径２～３ｍ，酸为单股４０ｎ核
与柯萨奇病毒Ａ１致的ＨＦ６所ＭＤ难以区分，能也＿引起无菌眭脑膜炎、干脑炎和脊髓灰质炎等种脑
与神经系统相关的严重疾病。近年来，Ｖ７Ｅ１的流行在亚太地区呈上升趋势，中最令人关注的是该其地区的Ｅ１染出现越来越严重的中枢神经系｝Ｖ７感统
正链ＲＡ。病毒颗粒的衣壳由６个亚单位构成，Ｎ０
后者由４衣壳蛋白（１种ＶＰ￣ＶＰ）４拼装成五聚体样
结构。４种结构蛋白中，ＶＰ除４包埋在病毒颗粒外
壳的内侧并与病毒核心紧密连接外，他３种均暴其露在病毒颗粒表面，而抗原决定簇基本上位于因ＶＰ￣ＶＰＥ］Ｉ３ｌ。病毒颗粒没有类脂性的包膜，去ｏ对

肠道病毒71型分子生物学研究

（１０３）３０５
Ａｂｓｒｃｔａｔ：ＩａｓｒｖｅｏｔｍｋｅｅｉｗｎＥＶ１ｉｔｓｉｌｖｒｂ７ｎｅｔｎａｉｕｓａｏｕｔｉｓｂｏｏｇｃｌｃｒｃｅｉｔｃ，ｒｐｉａｉｔｉｌｉａｈａａｔｒｓｉｅｌｃｔｏｎ，ｄｉｇｓｓｔｃｎｏｏｙ，ＥＶｙ — ａｎｏｉｅｈｌｇｔｐｅｉｄｎｔｆｃｔｏｎａｏｌｃａｐｉｍｉｃｅｅ．ｅｉｉａｉｎｄｍｅｕｌｒｅｄｅｃｓｉｎｃＫｅｙｗｏｒｓ：ｉｅｔｎａｒｄｎｔｓｉｌｖｉｕｓ；ＥＶ１；ｇｎｅｔｐｅ；ｍｏｌｃｌｒｅｄｍｉｃｅｅ７ｅｙｅｕａｐｉｅｃｓｉｎｃ
维普资讯
浙江中医药大学学报２００８年５月第３卷第３期２
Ｅ］顾植山．手足Ｅ病谈中医药应对突发公共卫生事件的１从ｌ意义Ｅ］浙江中医药大学学报，０８３（）１２Ｊ．２０，２３：－．［］方焕生．州地区肠道病毒７２广１型感染的研究［］第一Ｄ．
医科大学学报，０８２（）２４２０，９２：８．
［］郭卫平．７中西医结合治疗４Ｊ手足口病１６例［］河北，Ｌ１Ｊ．
中医，０６，８７５８２０２（）：４．
Ｅ］任国珍．药外洗配合食疗治疗手足Ｅ病Ｅ］医学导８中ｌＪ．
军医大学，０５２０．
［Ｏ陈永宏．射用双黄连治疗４Ｊ手足口病临床观察［］１］注，ＬＪ．

新肠道病毒71型致手足口病研究进展

毒之一。近年来Ｅ１引起的ＨＦＶ７ＭＤ发病率明显上升，呈现季节流行和全年散发趋势，致死率逐其年上升。对Ｅ１型ＨＦＶ７ＭＤ的发病机制目前尚不
鼻分泌物也会带有高浓度的病毒，Ｅ１也可经故Ｖ７
由飞沫或密切接触等途径传播＿。５］
和ＶＰ１序列中可能存在神经毒力决定簇。因此，
Ｅ１的毒力可能是由多个病毒基因共同决定。Ｖ７
近来研究表明，Ｖ７Ｅ１可能诱导中枢神经系统Ｉ一Ｌ
１、Ｌ６和ＩＮ７等炎症介质释放［，管平滑肌０Ｉ一Ｆ一８血］
综述・
新肠道病毒７１型致手足Ｉ研究进展Ｊ病
刘增甲王旭综述崔文审校
（宁医学院基础医学与法医学院，东臼照２６２）济山７８６
关键词新肠道病毒７；足口病；１手中枢神经系统病变
定作用。
随着分子生物学技术的发展，现脊髓灰质炎发病毒的５ＮＣ和ＶＰ＂Ｒ－１与其神经毒性有关。对来
细胞血管细胞黏附分子ＶＣＡＭ一１表达上调［，９提］示Ｅ１染所致的炎症反应可能是引发中枢神Ｖ７感
经系统疾病的原因之一。体外研究显示，Ｖ７Ｅ１可
通过活化蛋白激酶Ｃｋ诱导神经细胞凋亡，种ｄ５这

2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究

关键词：ＥＶ７；因型；子流行病学１基分中图分类号：３３２文献标识码：Ｒ７．Ｂ
ＭｏｅｕａｐｄｍｉｌｇｆｅｅｏｉｕｎＪａｇｕＰｒｖｎｃｒｍ０８ｔ０９ｌｃｌｒｅｉｅｏｏｙｏｎｔｒｖｒｓ７１ｉｉｎｓｏｉｅｆｏ２０ｏ２０
基因型。结论２０－２００８－０９年江苏省分离的ｌ８株ＥＶ７１可能与安徽省和山东省分离的ＥＶ７１有相同的起源，属于Ｃ４均ａ亚
型；目前Ｃａ亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。４
相近，苷酸同源性在９．～９．之间，核６３９６氨基酸同源性在９．～９．之间；与Ａ、基因型参考株比较差异较大，９０９７而Ｂ核苷酸同源性只在８．￣～８．之间，基酸同源性在９．～９．之间；明本文的１１８Ａ４４氨４３７ｏ说８株病毒均属于Ｅ１型ＣａＶ７４
单军，李显，唐震，郭喜玲，康辰，仑标，以跃，赵崔葛史智扬
摘要：目的探讨２０－２００８０９年江苏省肠道病毒７１型（Ｖ１分离株的病毒基因特征。方法选取ｌＥＴ）８份Ｅ１分离ＶＴ
２１００，２（０６）
ＣｈｉｅｅＪｕｒａｆＺｏｎｓｏｎｌｏｏｎｏｅｓｓ

STAT3在新型肠道病毒71型(EV71)感染和复制中的作用初步研究

新鲜培养基覆盖并孵育７２ｈ。用０．１的中性红染色４～６ｈ后观察蚀斑形成情况。为确定ＳＴＡＴ３对ＥＶ７１形成蚀斑能力的影响，将整合不同慢病毒的ＲＤ细胞分别接种于６孔板，然后用相同病毒储存液（经正常ＲＤ细胞测定后病毒滴度为４．８×１０ＰＦＵ／ｍＬ）经指定倍数稀释，分别用０．５ｍＬ病毒稀
病毒的细胞株ＲＤ－ｐＬＫ０．１－ｓｈＳＴＡＴ３。提取细胞
同细胞上形成蚀斑的数量和大小。数据统计分析不同组间的数据使用ＳｔｕｄｅｎｔＳｔ检验进行数据分析，所有数据均使用ＳＰＳＳ１１．０软
件进行处理。Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。
基因组ＤＮＡ经ＰＣＲ进一步确认病毒整合情况。为构建过表达ＳＴＡＴ３细胞，将ＳＴＡＴ３ｃＤＮＡ（位
于１３３～２３９６，ＮＭ
一
后３０和４５ａｉｒｎ，ＳＴＡＴ３磷酸化（ｐ－ＳＴＡＴ３）水平分
别下调１．８６和３．１４倍，并长时间持续下降（图１Ａ）。而总ＳＴＡＴ３的表达在ＥＶ７１感染后无显著变化（图１Ｂ）。结果表明ＥＶ７１感染可迅速下调ｐ — ＳＴＡＴ３的水平，而对总ＳＴＡＴ３的表达无显著

肠道病毒71型感染人Jurkat细胞诱导细胞因子表达研究

国际病毒学杂志 2020 年12 月第27 卷第6 期International Journal of Virology, December 2020, Vol. 27, No. 6• 469 ••基础研究•肠道病毒71型感染人J u rk a t细胞诱导细胞因子表达研究吕秋月韩焱刘丹红薄志坚大连市疾病预防控制中心微生物检验所116021通信作者：薄志坚，Em ail:155****0762@,【摘要】目的研究手足口病发病与细胞因子水平异常变化的关系，研究E V71病毒诱导细胞天然免疫的发生机制。

方法将J u r k a t细胞接种到24孔板中，设E V71病毒感染组和对照组，并用R e a l t i m e-P C R法检测感染不同时间段的细胞上清液中丨1,1-p、1L6、T N F-c x、I F N-1的m R N A表达含量。

用乙醜肉S•蔑佛波酯（p h o r h o l-12-m y r i s t a t e-13-a c r t a t e，P M A)预作用J u r k a t细胞不同时间后，接种E V71病毒，检测细胞上清液中病毒载量变化。

结果E V7丨病毒感染J u r k a t细胞后，I L l-p的m R N A在6h后达峰，I L-6的n i R N A在24h后达峰，T N F- a和I F N- 7的m R N A分别在48h和72h达峰；P M A预作用J u r k a t细胞后，I L1-P、I L6、T N F-a、丨F N-7的m R N A表达均上调，病毒载量下降。

结论随着E V71病毒作用时间的延长，I U- p、I L6、T N F-a、I F N- 7的m R N A表达均达峰值，J u r k a t细胞内E V71病毒载量呈递减趋势。

E V71可引起I L l-p、I L6、T N F-a、I F N-7细胞因子反应。

【关键词】肠道病毒71型；细胞因子；乙酰肉豆蔻佛波酯基金项目：大连市科技计划项目（2015E12S F133)DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2020.06.007Expression of cytokines induced by enterovirus 71 infecting human Jurkat cellsLyu Qiuyue, Han Yan, Liu Danhong, Bo ZhijianInstitute of Microbiological Detection, Dalian Municipal Center for Disease Prevention and Control,Dalian 116021, ChinaCorresponding author: Bo Zhijian, Email: 155****************,Tel: 0086-411-84335939【Abstract 】Objective To find relationship between the onset of hand, foot, and mouth diseaseand abnormal changes of cytokine levels, so as to clarify the mechanism of enterovirus 71 (EV71)-induced natural cellular immunity. Methods Jurkat cells were cultured in 24-well plates and the EV71infection group and control group were set up. The mRNA expression levels of ILl-p, IL6, TNF-a andIFN-y in supernatants collected at different time after infection were detected by realtime-PCR. EV71 wasinoculated into Jurkat cells pre-treated with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) for different time toanalyze the changes of viral loads in supernatant of cell culture. Results After Jurkat cells infected byEV71, the mRNA of IL1-P reached peak level at 6h, the mRNA of IL-6 reached peak level after 24h whilethe mRNAs of TNF-a and IFN-y reached peak levels after 48h and 72h, respectively. For PMA-pre-treatedJurkat cells, the mRNA expressions of ILl-p, IL6, TNF-a and IFN-y were all up-regulated with decreasedviral loads. Conclusions With the prolongation of infection by EV71, all mRNA expressions of IL1-P，IL6, TNF-a and IFN-y reached peak levels while the viral loads in Jurkat cells decreased. EV71 can inducecytokine reactions, including ILl-(3, IL6, TNF-a and IFN-y.【K eyw ords】Enterovirus 71; Cytokine; Phorbol-12-myristate-13-acetateFund Program: Dalian Municial Science Planning Project (2015E12SF133)DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2020.06.007EV71病毒属肠道病毒，可引起以儿童为主要感染对象的手、足、口部的疱疹，少数病例可引起心肌炎、脑炎、呼吸道感染等严重并发症m，甚至死亡。

肠道病毒71型实验室诊断研究进展

原体，多感染婴幼儿，少数病例可以并发呼吸道感染和心肌炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹等严重疾病，
可致残、致死。因此Ｅ７实验室诊断对Ｅ７Ｖ１Ｖ１引起疾病的治疗和防控具有重要意义。本文将从核酸检测、抗体检测及其他检测等三部分对Ｅ７Ｖ１的实验室诊断方法研究进展进行了综述。
（ＦＨＭＤ）ｉＣｉａｅａｅｔｄｍｉｉｓａｄｐｔｎｉｌｌｄｔｌｅｔｒｔｉｇｃｍｌａｉｓｉｉｆｎ．Ｆｒｅｒ，ｎｈｎｈｖｆｃｌｏｎｏｔｌｅｏｉ — ｅｅｎｏｐｉｔｎｎｎａｔｕｔｒｅａｆｅｌｎｅａｙａｆｈａｎｃｏｓｈｍｏ
ｔｎｒｓａｃｂｅｔｔｔｅｄｖｌｍｎｏｍｌｃｌｉｇｏｔｃｎｑｅｆｅｄｔｔｎｏｅｅｔｒｖｕｅ．Ｔｉｒ— ａｔｅｅｒｓｊｃｓｏｈｅｅｐｅｔｆｏｅｕａｄａｎｓｃｔｈｉｓｒｈｅｃｉｆｈｎｅｏｉｓｓｈｓｅｈｕｏｒｉｅｕｔｏｅｏｔｒ
ｔｅｅｏｔｒａｓｒｐｅｅｔａｓｎｆａｔｌｂｕｌｅｌｓｕｎｔｅｗｒ．Ｔｅｅｃｍｍｏｎｅｔｎｒａｅａｓｇｉｃｎｈｓｕｂｅｋｅｒｓｎｉｉｃｎｏａｐｂｉｈａｔｉｓｅｉｈｏｄｇｉｇｌｃｈｌｈｓｏｎｉｃｉｓｃｅｔｉｎｆａｔｆｏｉｂｒｅｎｏｒｓｃｅｙａｄｈａｈａｅｓｓｍ．Ｏｒｕｄｒｔｎｉｇｏｉｉｏａｔｇｏｐｏｉｌｐｔｏｅｓｈｓｉｃｅｓｄｕｄｎｏｕｏｉｔｎｅｈｃｒｙｔｅｕｎｅｓａｄｎｆｔｓｍｐｒｎｒｕｆｖｒａｈｇｎａｎｒａｅｈｔａｄａｔａｌｈａｔｅａｅｈｕｎｉｔｅａｓｙｍｅｈｄｒｖｃｉｅａｔｅｎｅｔａｉｉｇａｔｏｙａｅｔｅｉｏ ‘ ｒｍａｉｌｉｔｅｐｓｃｄ．Ｔｅｑａｔａｉｓａｔｏｓｆａｃｎｎｉｎａｄｎｕｒｌｎｎｉｄｒｍｐｒｃｙｎｄｔｖｏｇｚｂｈ

肠道病毒71型简介简述

第二节肠道病毒71型（EV71）作者：李兰娟出版社：浙江科学技术出版社肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员，归属于人类肠道病毒A。

1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病（1969～1973年）的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区的流行情况，EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行，人们逐渐认识到EV71病毒是手足口病的主要病原。

目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎（asepic meningitis）、脑炎（encephalitis）和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病（poliomyelitis-like paralysis）等多种与神经系统相关的疾病。

EV71可导致大范围的暴发流行，可伴有严重的CNS并发症或致死性肺水肿。

近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，1975年保加利亚大流行,共有705名患儿感染，死亡44例；1997年马来西亚大流行感染2628人，死亡30多人；1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。

因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

一、病毒的一般特征（一）病毒颗粒结构该病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约24～30nm，核酸为单股正链RNA。

如同其他肠道病毒属成员一样，EV71型病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30 KD、26 KD和7KD的多肽VP1(α)、VP2（β）、VP3（γ）、VP4（δ），构成原聚体，后者再拼装成具有五聚体样结构的亚单位（pentameric unit），60个亚单位通过各自的结构域相互连接，最终形成病毒的外壳。

VP1 、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。

肠道病毒71型六安地区分离株VP1基因的生物信息学分析及B细胞表位预测

作者单位：安徽医科大学微生物学教研室，安徽省重要遗传病基因资源利用重点实验室生物工程部，合肥２０３３０２
２７０３０８１０２０３
文献标识码Ａ文章编号１０００—１９（０２００３０４２２１）３— ２３— ８
基金项目：教育部科学技术研究重点项目（编号：１５；００２）安徽省 “ 十
肠道病毒７１型；Ｐ；Ｖ１Ｂ细胞表位；级结构；级二三
五” 生物医药重大科技专项（号：１００３；编０３３０）安徽省高
校省级自然科学研究项目（编号：，０８０５ＫＪ０Ａ８）２
Ｐｒｃｓｉｇｏｈ－ｅｍｉａｎｔａｉｎｍｅｈｉｎｎｅｆｏｒｃｍｂｎｎｏｅｓｎｆｔｅＮｔｒｎｌｉｉｉｔｏｔｏｉｒｍｅｏｉａｔ
ｈｍａｎｅｆｒｎ・２ｙＥｓｈｅｉｈｉｏｉｍｅｈｏｉｅａｉｐｐｔｄｓｕｎｉｔｒｅｏａｂｃｒｃａｃｌｂｔｉｎｎｍｎｏｅｉａｅ
安徽省六安市疾病控制中心检验科，六安哥伦比亚大学病理与细胞学教研室，纽约
肠道病毒７１型（ｎｅｏｉｓ７，Ｖ１是小ｅｔｒｖｕ１Ｅ７）ｒＲＡ病毒科肠道病毒属的成员。Ｅ７ＮＶ１主要侵犯婴幼儿和儿童，临床上以发热和手、、、足臀口腔等部
ｔｉｎｎｍｉｏｅｔａｅｒＭＡＰ）ａｄｕｅｔｅｒＭＡＰｔｅｖｈｔｒｎｌｎｔｔｒｍｅｈｏｉｅｒｓｄｅｆｍｅｈｏｉｅａｎｐｐｉｓ（ｅｄｎｓｅｈｒｍｏｅｔｅＮ．ｅｍｉａｉｉａｏｔｉｎｎｅｉｕｒｒ — ｏｉｏ

人肠道病毒71型疫苗研究进展

３亚单位疫苗
近几年，伴随生物信息学和基因
灭活全病毒疫苗有效性和包含于灭活脊髓灰质炎疫
苗内的灭活ＨＶ７五价联合疫苗的兼容性，证实Ｅ１
基金项目：浙江省卫生厅医药卫生科学研究基金资助项目（０９９）２０Ａ１０；宁波市科技局资助项目（０９５０８２０Ｃ００）作者单位：１宁波大学医学院，浙江宁波．
常用来制备亚单位疫苗。ｗｕ等制备重组福尔马林灭活全病毒疫苗、重组Ｖ１白疫苗和Ｖ１Ｐ蛋Ｐ核酸
浙’ 预防医学２１年第２江０１３卷第１期１
ＺｅｉｇＰｅｅｔｅＭｅｉｎ，Ｎｖ０１ｏ２，Ｎ．１ｈｊｎｒｖｎｉｄｃｅｏ．２１，Ｖｌ３ｏ１ａｖｉ
・２５・
疫苗分别对小鼠接种免疫，均能产生一定的免疫保护效果。重组Ｖ１白疫苗免疫保护率为８％，Ｐ蛋０灭活疫苗组产生了高水平的Ｉ４（Ｌ一白细胞介素一４，Ｖ１酸疫苗组产生了高水平的干扰素一）Ｐ核（Ｆ）和Ｉ — ２ＩＮ一Ｌｌ，亚单位疫苗组则产生了高水平的ＩＮ一和Ｉ１。ｗｕ等同时用重组Ｖ１ＦＬ一０Ｐ蛋白疫苗免疫母鼠，比较新生小鼠对野生ＨＶ７病Ｅ１毒的抵抗力，攻毒实验对新生小鼠的保护率为８％，说明Ｖ１存在重要的中和抗原表位。０ＰＪＺｏ等的研究小组研制的Ｖ１ｈｕＰ亚单位疫苗，也证实Ｖ１Ｐ制备的亚单位疫苗具有可行性。Ｊ研究发现，Ｖ１白的体内保护性并不及全病Ｐ蛋毒灭活疫苗，联合亚单位疫苗则包含较多的抗原决定簇。郝翊等用Ｒ ’ Ｄ细胞分离纯化ＨＶ７，进Ｅ１行动物保护性实验ｌ。通过肽段融合的方法，在９Ｊ大肠埃希菌中融合表达ＨＶ７的亚单位肽段，得Ｅ１到５种备选疫苗，分别为ＶｃａＡ，Ｖｃ，Ｖｃ，ａＢａＣＶｃａＤ和Ｖｃ，随后将肽段免疫母鼠，对其交配后ａＥ产下的幼鼠进行病毒感染。发现ＶｃａＢ和ＶｃａＥ给予幼鼠的抗病毒感染保护效果最好，并且ＶｃａＢ和

肠道病毒71型复制周期研究进展_陈生林 (1)

由此可见，ＥＶ７１的入侵过程可由细胞受体和多种相关因子介导，尤其是ＳＣＡＲＢ２和ＰＳＧＬ－１两个目前公认的ＥＶ７１的功能性受体。膜联蛋白 Ⅱ 等另外几个入侵相关因子的缺失不能完全阻断
ＥＶ７１的感染入侵，提示这几个因子主要是参与了ＥＶ７１对宿主细胞表面的黏附过程。而是否还存在其他未知的功能性受体，以及现有的几种受体和因子在ＥＶ７１入侵时是否及如何协同配合，还有待进一步研究。
另外，ＥＶ７１的衣壳蛋白ＶＰ１可与宿主细胞表面的波形蛋白结合。Ｄｕ等预［１０］先将波形蛋白与ＥＶ７１共同孵育或用特异性单抗封闭宿主细胞表面
波形蛋白后，均可导致ＥＶ７１对宿主细胞的感染性下降；进一步定量实验结果显示，当细胞表面波形蛋白减少时，吸附在宿主细胞表面的ＥＶ７１病毒颗粒也显著减少。这些结果提示，波形蛋白极有可能也是ＥＶ７１的吸附因子。
ＣＨＥＮＳｈｅｎｇ－ｌｉｎ，ＺＨＵＹｏｎｇ－ｚｈｅ，ＱＩＺｈｏｎｇ－ｔｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＢｉｏｄｅｆｅｎｓｅ，
ＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＱＩＺｈｏｎｇ－ｔｉａｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｚｔ＠ｓｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１（ＥＶ７１）ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｇｅｎｔｓｔｈａｔｃａｕｓｅｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ（ＨＦＭＤ）ｍａｉｎｌｙａｍｏｎｇｙｏｕｎｇｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｓｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ，ｔｈｅｖｉｒｕｓｍａｙｌｅａｄｔｏｓｅｖｅｒｅｎｅｕ－ｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｓｏｒｄｅｒｓｗｉｔｈｈｉｇｈｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｄｉｓａｂｉｌｉｔｙｒａｔｅｓ．ＴｈｅｒｅａｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙｎｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｃｏｍｂａｔＥＶ７１ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＥＶ７１ｒｅｐｌｉｃａ－ｔｉｏｎｃｙｃｌｅａｎｄｃｅｌｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｏｕｌｄｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｆｏｒｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｎｅｗｄｒｕｇｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔｔｈｉｓｖｉ－ｒｕｓ．ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｙｃｌｅｏｆＥＶ７１．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１；Ｅｎｔｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ａｓｓｅｍｂｌｙ；Ｒｅｌｅａｓｅ

肠道病毒71型及其疫苗的研究进展

摘要: 肠道病毒 71 型( E
73004 6 ; 2 北京微谷生物医药有限公司，北京 1 000 2 4 )
71 ，E V 71 ) 是手足口病的主要病原体，是一种具有较强传染性和致病性的病毒，
其流行范围波及全世界，近年来在亚太地区尤其是在中国的流行日趋频繁�目前 E V 71 病原学� 流行病学以及动物模型的研究均取得了一定进展，为疫苗的研发奠定了相应的基础，中国三家公司的 E V 71 灭活疫苗现已率先获得临床批件，有望成为预防手足口病的有效手段� 关键词: 肠道病毒 71 型; 疫苗研究; 动物模型; 研究进展中图分类号: R373.2 文献标识码: A 673( 2 01 1 ) 02 -00 5 1 -0 6 文章编号: 1 0 05 -5
5 2
微生物学免疫学进展 2 01 1 年第 39 卷第 2 期
P rogi nMi crobi ol I m m u nol Ju n. 2 0 1 1 ， V ol .39 N o.2
病毒颗粒衣壳内侧与 RN A 核心紧密连接 �因而病社会的恐慌 � � 毒的抗原决定簇基本上位于 V P 1 V P 3 上 �尤其在 2 008 年中国安徽省阜阳市爆发人手足口病疫 V P 1 上含有多个中和抗原表位 � 编码 V P 1 蛋白的情，并随后扩展到全国其他地区，全年共报告发病基因在外界选择压力下易发生变异从而赋予 E V 71 4 8 8 95 5例，重症病例 1 1 6 5 例，死亡 1 2 6 例 �2 008 病毒颗粒不同的抗原特性，因此 V P 1 基因被认为是年 5月卫生部把手足口病纳入丙类法定传染病管 VP 1 能序列分析的最佳选择� E V 71 受体研究显示，理�2 009 年，全年报告发病 1 1 5 55 2 5 例，死亡 35 3 与多种人类蛋白受体结合，在病毒对细胞的吸附以［4 ］ � 例�2 01 0 年共报告病例 1 774 6 6 9 例，死亡 905 及穿入 � 脱壳过程中起着至关重要的作用［5］� HFM D 在中国大规模流行已引起人们的广泛关注 � 1 .2 E V 71 的基因分型本文对 E V 71 的病原学� 基因分型 � 流行病学 � 疫苗肠道病毒传统的中和血清分型逐渐被基因分型

利用恒河婴猴模型对肠道病毒71型传播感染特征的生物学分析

ＺＨＮＧｎＡＹｉｇ，ＬＩＡＮＧｎ，ＬＩＹａＡｏｎ，ＬＩＱｉＨａＹｕ１．ｎ
１．ＩｓｉｔｏｄｃｌｉｌｙｈｎｓａｅｆＭｅｉｎｃｅｃｎｅｉｇＵｉｎＭｅｉｌｏｌｅｎｔｕｅｆＭｅｉｏｏ，ＣｉｅｅＡｃｄｍｙｏｄｃｅＳｉｎｅａｄＰｋｎｎｏｄｃｌｇ，ｔａＢｇｉａＣｅ
ＡｂｔａｔＵｓｎａｅｔｂｉｅａｉａｍｏｅｏｎｅｏｉｕ７（ｓｒｃ：ｉｇｎｓａｌｈｄｎｍｌｓｄ１ｆｅｔｒｖｒｓ１ＥＶ７１）ｉｆｃｉｎ，ｔｅｉｏＥＶｎｅｔｏｈｒｓｋｆ７１ｔａｓｓｉｎｆｏｉｆｃｅｅｎｔｌｏｕｉｆｃｅｈｓｓｍｏｋｙｓａｓｓｅ．Ｔｗｏ１２ｍｏｔ－ｌｅｎｔｌｒｎｍｉｏｒｍｅｔｄｎｏａａｎｎｅｔｄｒｅｕｎｅｓｓｎｔｗａｓｅｓｄ－ｎｈｏｄｎｏａａ
ＷＡＮＧｉｇＪｎ一，ＬＩＷｅ，ＺＨＡｏｎ — ｎＬＩｎ — ｎＪｎ —ｉｇ ’ ｉ一ＨｏｇＬｉｇ，ＵＬｏｇＤｉｇ，ＴＡＮＧｏｇＤｎ－Ｈｏｇ，ＹＡＮＧＬｉＸｉｎ，Ｄ０ＮＧＣｈｎ．ｏｇ，ＮＡＲｕ．ｉｎ Ⅵ，ｎ．ａｅｇＨｎｉｏｇ，ＸＡＮＧＬ — ｕｉＣｈｎ，
王晶晶一，薇，红玲刘龙丁唐东红李赵，，，杨丽仙，董承红纳锐雄，，

肠道病毒EV71最新研究进展

综述肠道病毒EV71最新研究进展2007级生物技术黄琼肠道病毒71（Enterovirus 71, EV71）是1969年Schmidt等首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的[1]。

EV71感染主要引起手足口病（Hand-food-mouth disease, HFMD），在临床上与柯萨奇病毒A16（Coxsakie A16, CA16）感染所引起的手足口病难以区别。

EV71感染严重者还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病[2]。

自1974年首次报道[3]以来，EV71在世界范围内已引起十多次暴发流行，特别是近几年在亚太地区，EV71的流行呈上升趋势，已引起人们的广泛关注。

本文对EV71的结构特征、致病机制、检测技术、型别鉴定、流行病学、研究方向等作一综述。

1 EV71的结构特征肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。

EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。

病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VP1、VP2、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。

4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上[4]。

由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。

EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。

EV71基因组为7408个核苷酸组成的单股正链RNA，病毒基因组具有感染性。

肠道病毒71型疫苗研究进展

doi:10.3969/j.issn.1000-3606.2021.05.016肠道病毒71型疫苗研究进展毕方川综述许红梅审校重庆医科大学附属儿童医院感染科儿童发育疾病研究教育部重点实验室国家儿童健康与疾病临床医学研究中心儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）摘要：手足口病（HFMD）是一种婴幼儿常见的传染性疾病。

肠道病毒71型（EV-A71）是HFMD的主要病原之一，可导致严重并发症甚至造成死亡。

因此，预防EV-A71感染尤为必要。

开发EV-A71疫苗是预防、控制EV-A71感染最有效的方法。

正在研发的EV-A71疫苗主要包括：灭活全病毒疫苗、减毒活疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组VP1蛋白疫苗和合成多肽疫苗。

现就EV-A71候选疫苗的开发和进展作一综述。

关键词：手足口病；肠道病毒71型；疫苗Research progress on enterovirus 71 vaccines Reviewer: BI Fangchuan, Reviser: XU Hongmei (Department of Infectious Diseases, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, National Clinical Research Center for Child Health and Disorder, China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Chongqing 400014, China) Abstract:Hand, foot and mouth disease (HFMD) is a common infectious disease in infants and young children.Enterovirus 71 (EV-A71) is one of the main pathogens of HFMD, which could cause serious complications and even death.Therefore, it is an urgent need to protect against EV-A71 infection. Development of EV-A71 vaccine would be the most effective approach to prevent and control EV-A71 infection. The EV-A71 vaccines under development mainly include inactivated vaccines, attenuated live vaccines, virus-like particle vaccines, recombinant epitope vaccines, and synthetic peptide vaccines. This article summarizes the progress and development of the EV-A71 vaccine.Key words:hand, foot and mouth disease; enterovirus A71; vaccine手足口病（hand, foot, and mouth disease，HFMD）是一种常见的儿童传染性疾病，其特征表现为发热，口腔后部多发溃疡及手、足底、臀部丘疹或疱疹，部分危重患儿可出现无菌性脑膜炎、急性弛缓性瘫痪、脑干脑炎、肺水肿、心肺衰竭等严重并发症[1]。

肠道病毒EV71型研究概述

肠道病毒EV71型研究概述【摘要】肠道病毒71型感染典型症状为手、足、口病或疱疹性咽峡炎，少数重症病例还会引起脑炎、心肌炎、肺水肿、弛缓性麻痹等，已为社会经济发展带来一定阻碍。

本文将对近年来有关EV71有关研究内容做一综合描述。

【关键词】手足口病；肠道病毒71；流行病学；预防Overview of research on EV71. REN Qi-jing1 ,GUO Wei-dong2*,HAI Yan2 , ZhANG Jin-ming1. Inner Mongolia Universty,Hohhot,Inner Mongolia 010059;2.Inner Mongolia Center for Disease Control and Prevention,Hohhot,Inner Mongolia 010031)【Abstract】 Enterovirus 71 infection symptoms typical for hand, foot and mouth disease or herpangina, a few severe cases can also cause encephalitis, myocarditis, pulmonary edema, flaccid paralysis and other has for the social and economic development brings some obstacles. This article will make a comprehensive description about the research content of EV71 in recent years.【Key Words】 Hand foot and mouth disease(HFMD); Enterovirus 71; Epidemiolgy; Prevention肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒A组，为二十面体立体对称球形结构，无包膜和突起。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

肠道病毒71型分子生物学研究【摘要】就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。

【关键词】肠道病毒71型基因型分子流行病学Molecular Biological Research on 7I Intestinal VirusLin Xin, Han GuangenZhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053)Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic, replication, diagnosis technology, EV type identification and molecular epidemic science.Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science 近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。

EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。

本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。

1 病毒的一般特征1.1 病毒颗粒结构及理化性质肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员［1］。

EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。

病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。

四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPI.VP3上（见图1）。

EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。

图1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构（略）1.2 基因组结构［2］EV71基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，腺嗓吟核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U=52.8)，病毒的的单链具有侵染性。

基因组中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2193个氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，在其两侧分别为746个核苷酸的5’-非编码区(UTRs)和83个核苷酸的3’-非编码区。

在3’-非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(poly A)，而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。

该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白编码IA(多肽VP4)、IB(多肽VP2)、IC(多肽VP3)、ID(多肽VP4)四个病毒外壳蛋白;P2前体蛋白编码ZA(特异性蛋白酶)、2B、2C;P3前体蛋白编码3A、VPg(5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA 多聚酶组份)。

病毒的单链RNA具有感染性。

病毒RNA正链和负链的5’末端和3’末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号。

VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS’末端的pUPU形成磷酸二酷键与基因组RNA结合。

5’ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译的过程中发挥重要作用。

此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主X围和病毒的毒力等多个方面的功能。

EV71病毒基因组3‘UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚。

2 病毒的复制EV71基因组的复制类似于其它正链RNA的病毒。

当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始进行复制。

病毒基因组RNA 首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用下合成负链RNA。

后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。

体外实验证实:病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋白VPg以及一种以上的宿主细胞蛋白。

随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代毒粒的组装阶段。

由于蛋白酶3C或3CD的增多以及活性的增强，加速了Pl前体蛋白的切割。

其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg一阴A形成病毒子粒［2］。

一般情况下，肠道病毒的原病毒毒粒无感染性，经过蛋白酶的再加工(水解切割P1，产生钾1一4多肽)才产生有感染性的病毒粒子［3］。

3 EV的诊断技术3.1 核酸杂交技术由于EV各型间存在序列高度保守区,利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大X围的EV诊断［4］。

杂交技术已能成功地检测出可疑病例临床标本中的EV RNA［5］,而且原位杂交技术可以提供病毒感染的组织细胞分布及其与炎症和坏死之间的关系的信息［6］。

但是核酸杂交技术过程较复杂,且敏感性不太高,特别当用于检测脑脊液中RNA时。

3.2 逆转录(RT)PCR技术根据EV属特异性的高度保守序列设计其通用引物,为提高其检测敏感性,进行套式PCR能够检出包括无法进行细胞培养和定型的大部分EV分离物,还可直接从临床标本中检测EV核酸,整个过程一般在5h左右完成［7］。

周世力［8］利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,以Myc Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子,甲醇诱导表达。

SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30 000,与天然VP1大小一致;表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性。

4 EV型别鉴定诊断后其型别鉴定的方法主要有:将PCR结合细胞培养进行型别鉴定或者对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析或进行单链构象多态性分析(PCR SSCP)或进行基因序列测定与遗传性分析等来定型分类。

而在结构蛋白编码区,据Oberste等研究,VP1区核酸序列与决定血清型的抗原决定因子密切相关,根据VP1区序列进行分型结果与中和试验鉴定结果一致性较好,与血清型相关性较其它结构蛋白编码区高［9］。

但也有研究表明VP4的分型结果与血清也较一致,且因其核酸序列较短(VP4207nt,而VP1834～951nt),应用更为便利［10］。

Oberste等根据对EV遗传性分析的结果,提出根据VP1基因全长或部分序列同源性大小进行型别判定的标准。

将被检序列与含所有EV血清型参考株序列的数据库(如Genbank)进行比对,如果被检株序列与某一型参考株同源性最高且>75%,同时与同源性位居其次的另一型参考株同源性<70%,则可判定被检株与最高同源性参考株为同一血清型;如果最高同源性<75%或者第二同源性>70%,则型别判定有待于进一步研究确定;如果最高同源性<70%,则为一新血清型［11］。

周世力［12］将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX5x1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS PAGE分析和Western blot验证。

结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60kDa的融合蛋白。

利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。

见图2～4。

唐启慧［13］在成功克隆肠道病毒71型XX株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建了重组表达质粒pET28a(+)/(502～891)VPI,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。

结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致。

ELISA 和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。

图2 重组表达载体pGEX5x1/VP1结构（略）图3 SOS PAGE电泳分析表达（略）图4 Western Blot鉴定原核表达的EV71 VP1蛋白（略）5 分子流行病学目前EV71分子流行病学主要研究内容是VPI基因、VP4基因和5’价R区的变异。

其中，VPl基因最具研究价值，这是因为:(1)VPI蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性(Oberste等，1999);(2)VPI基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性;它不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。

周世力［14］对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(XX98年、日本99年、及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的结构蛋白基因进行遗传进化分析。

方法在对肠道病毒71型中国(XX)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA STAR软件对结构蛋白基因进行遗传进化分析。

结果SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的XX98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。

结论我国XX地区流行的肠道病毒71型有可能来源于XX1998年EV71大规模流行时的毒株。

X爱利［15］2002～2003年从XX市和XX市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒,其中XX9株,XX1株。

利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物,用RT PCR方法对病毒进行初步鉴别。

根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同,可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别。

提示,XX分离到的9株病毒中,有2株为EV71,其余7株病毒为Cox.A16;XX分离到的1株病毒为EV71。