细胞培养之细胞计数
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
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M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
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7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
细胞生物学细胞计数法和MTT法
实验题目：细胞增殖和活力的检测方法一、摘要：细胞增殖是生物体生长和繁殖的基础，当细胞增殖发生异常时往往会导致疾病的发生，比如肿瘤的发生就是细胞增殖失控的结果。
掌握细胞增殖和活力的检测是从事细胞生物学研究的一个重要方面。
针对细胞增殖和活力的检测方法有很多，这些方法除了能用于细胞本身增殖特性的研究、还能应用于药物毒副性检测，生长因子对细胞增殖和活力的影响等。
二、实验原理：〔1〕细胞计数法：最简单直接的方法：传统细胞计数的方法是用血球计数板，原理：将一定量的细胞悬液载入固定体积的玻片夹层中，在显微镜下数出细胞数量，然后换算出原始的细胞悬液浓度。
使用自动化细胞计数器，它通过拍下计数界面照片，利用软件程序设定去识别细胞，实现自动化计数。
好处:这种方法能兼容台盼蓝染色，染上蓝色的细胞视为死细胞，直接观察就能大致判断细胞的活力状态，计数后能定量分析细胞存活率。
缺点:①它的灵敏度低②线性范围太窄，细胞浓度低于 10 万个/ml 则计数不准确。
〔2〕 MTT 法MTT 称为噻唑蓝，是一种黄颜色染料。
定义：MTT 比色法是一种通过检测细胞代谢活性间接反映细胞增殖的方法。
原理：活细胞线粒体里的酶能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，活细胞数量越多，形成的有色沉淀越多，通过测定颜色的深浅也就是吸光值来反映细胞代谢活性的强弱，而细胞代谢活性与细胞数量呈正比，从而反映细胞数量的多少。
缺点： MTT被还原形成的有色沉淀需要溶解后才能比色，检测用时较长，检测结果会受到沉淀溶解效果的影响。
三、实验材料和用品：细胞计数法：待测细胞悬液、细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、微量移液器及枪头、酒精棉球、吸水纸、台盼蓝染液MTT法：贴壁细胞（A549 肺癌细胞株）酶标仪、酶标板振荡器、超净工作台，倒置显微镜，CO2培养箱、96 孔培养板，EP 管及管架，微量移液器及枪头、5mg/ml MTT 溶液，DMSO 溶液，1640 完全培养液四、实验操作（细胞计数法）：实验过程分为四个环节：（首先）清洁细胞计数板及盖玻片—（然后）镜检计数室—（接着）细胞加样—（最后）细胞计数具体操作细节如下：1、清洁细胞计数板及盖玻片：用 75%酒精棉球仔细擦拭细胞计数板的计数室区域，接着擦拭盖玻片，放置吸水纸上自然晾干；2、镜检计数室：1）细胞计数板和盖玻片干燥后，将盖玻片覆盖到细胞计数板的计数室部位；2）在显微镜下观察擦拭效果，确定计数室区域已擦拭干净、能清晰看到计数室的大方格及中方格3）直接平行移出计数板，平放在实验台上；3、待测细胞加样：1）将待测细胞悬液混匀后，吸取 10ul 细胞悬液加入 EP 管，然后再吸取10ul台盼蓝染液加入 EP，混匀，染色静置 2 分钟。
培养皿规格细胞计数
培养皿规格细胞计数是一项重要的实验室工作，它可以帮助研究人员评估细胞生长情况并确定最佳的细胞培养条件。
以下是关于培养皿规格细胞计数的1000字回答：一、背景知识细胞计数是生物学研究中的一项基本技术，主要通过计数细胞数量来评估细胞生长情况。
常用的细胞计数方法包括活细胞计数和死细胞计数的区分。
培养皿是一种常见的细胞培养容器，具有较大的容积，可以容纳大量的培养液和细胞。
在计数细胞时，我们需要考虑培养皿的规格对计数结果的影响。
二、培养皿规格对细胞计数的影响培养皿的规格对细胞计数的影响主要体现在两个方面：一是计数难度，二是计数结果的准确性。
1. 计数难度培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，这会增加计数难度。
在计数大量细胞时，容易出现漏计或重复计数的现象。
因此，我们需要采用适当的计数策略，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察。
2. 计数结果的准确性培养皿的规格越大，其中的细胞数量越多，但计数结果的准确性不一定越高。
这主要受到以下因素的影响：（1）死细胞的比例：在细胞培养过程中，一些细胞可能会死亡，这些死亡的细胞在计数时不会被计入，因此会使计数结果偏小。
相反，一些活细胞可能会在生长过程中死亡，这些死亡的细胞在计数时会被计入，因此会使计数结果偏大。
因此，我们需要对死细胞进行准确的区分和计数，以获得更准确的细胞数量。
（2）污染细胞的比例：在细胞培养过程中，一些杂质可能会进入培养皿中，这些杂质在显微镜下看起来像细胞，但实际上不是真正的细胞。
这些污染细胞的加入也会使计数结果偏大。
为了减少污染细胞的干扰，我们需要选择高质量的培养基和过滤器，并在显微镜下仔细观察每一个视野中的细胞。
三、结论和建议综上所述，培养皿规格对细胞计数的影响是显著的。
为了获得准确的细胞数量，我们需要采用适当的计数策略和技巧，如先对整个培养皿进行粗略的估计，然后对需要精确计数的区域进行细致的观察；同时，我们还需要注意死细胞和污染细胞的区分和计数。
小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。
2、学习细胞计数的方法。
3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。
细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。
2．细胞死活鉴定。
常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
本次实验即采用此方法。
伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。
3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。
细胞计数原理
细胞计数原理
细胞计数是生物学和医学领域中常用的实验技术之一，用于确定给定样本中细胞的数量。
细胞计数原理基于显微镜下观察细胞形态、结构和数量的方法。
以下是细胞计数的原理及其步骤。
1. 样本制备：首先，从待测样本中取得一定数量的细胞。
样本可以是细胞培养物、血液样本、组织样本等。
确保样本取得的方式不会破坏细胞的完整性。
2. 稀释样本：根据细胞的浓度，将样本适当稀释。
这样有助于将细胞分散开来，使其更容易被计数和观察。
3. 准备计数室：可以使用计数室或者用带有方格的显微镜载片。
计数室有预定的区域，用来放置需要计数的细胞。
4. 抹片制作：在计数室或者显微镜载片上制作细胞抹片。
将少量稀释的细胞放在载玻片上，然后用另一块载玻片将其涂抹开来，形成一个薄层的细胞悬液。
5. 显微镜观察：在显微镜下使用适当的放大倍率观察制作好的细胞抹片。
细胞通常可见为圆形或不规则形状。
6. 细胞计数：通过目视细胞数量和位置进行计数。
通常是在计数室或方格中选择一个特定的区域计数，然后根据所选择的区域的大小和形状进行计算。
7. 计算细胞浓度：使用计数的结果可以计算出细胞的浓度。
假
设样本已经稀释了，可以将计数的细胞数乘以稀释倍数来计算初始样本中的细胞数量。
细胞计数是许多实验和研究中必不可少的步骤。
通过了解细胞计数的原理和步骤，可以对细胞样本的数量和浓度进行准确的评估。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
细胞的培养-传代-计数-冻存-复苏
一、细胞复苏（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000r/min 离心5分钟。
（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。
（4）加入足量的培养液，放在CO培养箱中细胞培养，第二天换液。
2二、细胞冻存（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。
生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80%时，换液后 12～24h 换液培养。
吸去培养液，D-Hanks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
（2）加入 5ml 含血清的培养液中止消化。
反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。
进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500r/min 离心 5 min。
（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73% DMEM 培养液，20％FBS，最后添加 7％DMSO 二甲基亚砜），细胞计数达到2×106/ml 以上。
细胞混匀后加入冻存管中，每管 1ml。
注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。
降温程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→-80℃ 16～18 小时（或隔夜）→液氮槽（-196℃）长期储存。
三、细胞传代（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10%的FBS-高糖DMEM，青/链霉素,D-Hanks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。
当细胞长满培养瓶底的约80%时，吸弃原先的培养液。
（2）加D-Hanks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。
加入 0.25％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。
培育技术中细胞存活率的评估方法
培育技术中细胞存活率的评估方法在细胞培育的过程中，细胞存活率是一个非常重要的指标，它可以反映细胞培养的成功与否，以及细胞在特定条件下的适应能力。
因此，评估细胞存活率的方法对于细胞培养的研究具有重要意义。
一、显微观察法显微观察法是最常见的评估细胞存活率的方法之一。
通过在显微镜下观察细胞的形态和染色情况，可以初步判断细胞的存活与否。
存活的细胞通常具有完整的形态，胞质透明，核染色体鲜艳。
而死亡细胞则可能出现胞浆膨胀、核固缩等现象。
二、染色评估法染色评估法是一种常用的细胞存活率评估方法。
通过染色剂染色细胞，然后观察染色细胞的数量和形态，来评估细胞的存活率。
一种常用的染色剂是胞浆内的乙酰化酯酶，乙酰化酯酶是活细胞中的一种酶，死细胞则失去乙酰化酯酶的活性。
因此，通过染色乙酰化酯酶，可以将活细胞和死细胞区分开来，从而评估细胞存活率。
三、流式细胞术流式细胞术是一种高分辨率的细胞存活率评估方法。
通过流式细胞仪测量细胞的荧光强度或其他物理性质，可以精确计算出细胞的存活率。
流式细胞术可以同时检测多个指标，例如DNA含量、膜完整性等，从而更准确地评估细胞的存活率。
四、细胞计数法细胞计数法是一种简单直接的评估细胞存活率的方法。
通过显微镜观察，使用计数板或血细胞计数实验仪来计算特定区域内的细胞数量，然后与总细胞数进行比较，即可得到细胞存活率。
这种方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，但对于大规模的细胞培养可能不太适用。
综合上述方法，我们可以选择合适的方法来评估细胞存活率。
当然，每种方法都有其优缺点，需要根据具体研究目的和条件来选择。
同时，为了准确评估细胞存活率，我们还需要注意一些实验中可能的干扰因素，例如培养基成分、温度、PH 值等。
总结起来，选择合适的评估方法对于培育技术中细胞存活率的研究非常重要。
显微观察法、染色评估法、流式细胞术和细胞计数法都是常用的方法，根据实际情况选择最适合的方法，可以更准确地评估细胞的存活率。
同时，还需要注意实验中的干扰因素，以保证评估结果的准确性。
细胞培养之细胞计数
细胞培养之细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.二.细胞悬液制备：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。
活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3四.细胞计数要点：1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
高中生物教案分享：动物细胞培养实验中的细胞数量计数方法
高中生物教案分享：动物细胞培养实验中的细胞数量计数方法为了深入理解动物细胞的结构和功能，许多生物学教师会在其课程中让学生参与动物细胞培养实验。
在此过程中，培养物中的细胞通常是需要计数的一个重要参数，以便进行后续的研究。
本文旨在分享在动物细胞培养实验中计数细胞数量的几种方法，并讨论这些方法的优缺点以及适用范围。
一、视觉计数法视觉计数法是最基础的细胞计数方法之一，它通过显微镜直接数出视野中的细胞数量。
这个方法简单易懂，不需要任何特殊设备，对于初学者来说是非常有吸引力的。
但是，这种方法的缺点也是显而易见的：视觉计数法的准确性非常依赖于实验者的经验和技术水平。
因为在视觉计数法中，实验者不仅需要能辨认出真正的细胞，还要能够判断细胞是否已经被计算过，以及必须像数色块一样覆盖所有的视野，这在实践中是非常困难的。
视觉计数法适合于初学者或对于数量要求不高的实验。
二、伽玛计数法伽玛计数器是一种流量细胞计数器，是一种通过流体力学原理统计流体中粒子数量的仪器。
在这个方法中，培养物通过一个流通的计数器，在计数器中加入一个丙酮和伽玛线的混合剂，伽玛线能够捕获到细胞中的核物质，通过对不同颗粒刺激伽玛线发射的特殊方式计数细胞。
伽玛计数器的优点是速度非常快，准确度非常高，适合于需要准确计数的实验。
然而，伽玛计数器也有其缺点：首先是需要耗费较高的成本；对设备的严格要求会对实验产生一定的限制。
三、明胶滤膜计数法明胶滤膜计数法是一种将培养物滤过一种特殊的纱布或滤膜，将滤膜放在载玻片上，通过染色或直接计数的方法计算细胞数量的方法。
这种方法的优点是比视觉计数法更加准确，也比伽玛计数法便宜，因此，很多实验室通常都会采用这种方法。
明胶滤膜计数法的缺点也是显而易见的：它需要大量时间和劳动力，而且不适用于所有类型的细胞。
由于某些不适合培养的细胞无法在滤膜上形成群集，就无法计算细胞的数量。
四、显微图像分析法显微图像分析法是最新的一种计数细胞数量的技术。
传代培养和细胞计数
传代培养和细胞计数在细胞生物学、生物医学、药物 研发等领域具有广泛的应用价值，对于推动生命科学
研究和医学应用的发展具有重要意义。
对未来研究的建议和展望
进一步探索传代培养和细胞计 数的机制和原理，深入了解细 胞生长和增殖的调控机制，为 细胞生物学和医学研究提供更
深入的理论支持。
开发更加高效、准确的细胞计 数方法和技术，提高细胞计数 的准确性和可靠性，为细胞生 物学和医学研究提供更可靠的
细胞计数的常用方法
血球计数板法
利用血球计数板进行计数，通过 观察计数板上的细胞数量来推算
整个培养液中的细胞数量。
流式细胞术
利用流式细胞仪进行计数，通过将 细胞悬浮在液流中，经过激光束照 射后，根据散射光强度和荧光信号 强度来识别和计数细胞。
自动细胞计数仪法
利用自动细胞计数仪进行计数，通 过将培养液中的细胞样本放入仪器 中，仪器自动识别和计数细胞。
细胞计数的影响因素
01
02
03
细胞形态
不同形态的细胞在计数时 可能被忽略或误判，影响 计数的准确性。
细胞密度
细胞密度过高或过低都会 影响计数的准确性，需要 选择适宜的稀释比例。
操作技巧
操作技巧的熟练程度和经 验也会影响计数的准确性， 需要经过培训和实践积累 经验。
04 传代培养和细胞计数的相 关性 Nhomakorabea传代培养对细胞计数的影响
细胞生长
01
传代培养过程中，细胞会经历生长、分裂和扩增的过程，这会
影响细胞计数结果。
细胞死亡
02
传代培养过程中，细胞可能会经历死亡或凋亡，导致细胞计数
结果偏低。
细胞形态变化
03
传代培养过程中，细胞形态可能会发生变化，影响细胞计数的
细胞培养操作及其注意事项
六、操作完处理
• 1.试剂瓶瓶口喷酒精，用封口膜封住后，拿回冰箱应该放置的位置。 • 2. 清理工作台面，并用酒精消毒。下拉门，开紫外照射一般30分钟。 • 3. 垃圾袋封口，拿出高压蒸气灭菌（如果有感染试剂）。 • 4. 关掉37℃水浴箱的电源，细胞培养箱CO2浓度恢复至5%后，关掉
次解冻。10%浓度配制冻存液。 • 3. 由于DMSO稀释时会放出大量热量，故不可将DMSO直接加入细胞液中，
必须使用前先行配制完成。 • 4. adherent tumor lines: 5-7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解
冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。other suspensions: 510 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。 • 5. 回收动物细胞，其离心速率一般为300×g(约1,000rpm），过高的转速， 将照成细胞死亡。
• 3. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器和枪头盒等可以暂时 放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带 入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
• 4. 操作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套Байду номын сангаас才进行实验。用酒精擦拭手套 后才可进行操作。
• 5. 实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时，不要同时打开相邻两个房间的门。
二、贴壁细胞的换液及传代
• 1. 换液 • 当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄，而细胞密度未
克隆形成实验
克隆形成实验克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
细胞计数实验报告
细胞计数实验报告细胞计数实验报告细胞计数是生物学和医学研究中常用的实验方法之一，通过对细胞数量进行定量测量，可以了解细胞生长、分裂以及细胞死亡等重要生物学过程。
本实验旨在通过显微镜观察和显微图像处理技术，对细胞进行计数，并分析不同条件下细胞数量的变化。
实验材料和方法：1. 细胞培养物：选取细胞系A和B作为实验样本，分别在含有适宜培养基的培养皿中培养。
2. 显微镜和显微图像处理软件：使用高倍显微镜观察细胞，将显微图像导入计算机，并使用图像处理软件进行细胞计数。
3. 细胞计数盒：使用带有标定刻度的细胞计数盒，以便准确计数细胞数量。
4. 细胞染色剂：为了提高细胞的可视性，使用荧光染色剂对细胞进行染色。
实验步骤：1. 准备细胞培养物：将细胞系A和B分别接种到含有培养基的培养皿中，放置在恒温恒湿的培养箱中，维持适宜的生长条件。
2. 细胞染色：将培养皿中的细胞用荧光染色剂进行染色，使其在显微镜下更加明显可见。
3. 观察细胞：使用高倍显微镜观察染色后的细胞，并通过调节放大倍数和焦距，使细胞清晰可见。
4. 拍摄细胞图像：使用显微图像处理软件，将显微镜观察到的细胞图像导入计算机，保存为数字图像文件。
5. 细胞计数：使用图像处理软件，对细胞图像进行分析和计数。
可以利用软件提供的自动计数功能，也可以手动计数并记录结果。
6. 统计数据：根据细胞计数结果，将不同条件下的细胞数量进行统计和比较。
实验结果和讨论：通过细胞计数实验，我们得到了细胞系A和B在不同条件下的数量数据。
根据统计结果，我们发现在培养基A中，细胞系A的数量明显高于细胞系B，而在培养基B中，细胞系B的数量明显高于细胞系A。
这表明不同培养基对不同细胞系的生长具有不同的影响。
进一步分析发现，在培养基A中，细胞系A的增殖速度明显快于细胞系B，而在培养基B中，细胞系B的增殖速度明显快于细胞系A。
这可能与培养基中的营养物质和生长因子的组成有关。
培养基A可能提供了细胞系A所需的特定营养物质，从而促进了其增殖。
细胞培养基础知识
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新的玻璃器皿的清洗灭菌
自来水刷洗，除去灰尘。 烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅
、砷等物。 刷洗、烘干：泡酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲
洗干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用酸浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次，
我们进行体外细胞培养，实际是在细胞群体和个体的情况下考查细胞行为的。大部分细胞群体都由
分裂和不分裂两部细胞混合组成。而不分裂细胞又可分为两类：即保持再进入细胞周期能力的G0期
细胞（或叫静置细胞或休止细胞）及不分裂最终注定要死亡的终止分化细胞（或称之终端分化细胞
），他们不能再进入周期。进入周期内的细胞可以分为两个期：间期（G1+S+G2），M期（有丝分裂
单抗基本知识 细胞基本知识 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 细胞培养 细胞计数 冻存、复苏
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设备与器材准备、溶液配制
一、细胞常用设备和器材
超净工作台
二氧化塔摇床
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生物细胞的计数实验报告
生物细胞的计数实验报告一、引言细胞计数是生物学实验中常用的重要手段，它可以帮助我们了解生物体内细胞的数量及相关现象的变化。
本次实验旨在通过计数细胞的数量，进一步了解细胞的特点和活性，为后续的生物学研究和医学应用提供有效数据支持。
二、实验方法1. 实验材料- 细胞培养物：本实验中选取了人体肺癌细胞株A549作为研究对象。
- 细胞培养基：选择适宜的细胞培养基，其中包含必需的营养物质和培养细胞所必需的生长因子。
- 显微镜和细胞计数板：为观察和计数细胞提供必要工具和设备。
- 0.4% 尝试啶蓝溶液：用于染色细胞，以便更加清晰地观察和计数。
2. 实验步骤- 步骤一：将细胞培养物均匀取一小部分（如100μL）放入离心管中。
- 步骤二：使用显微镜观察培养物中细胞的形态、颜色和大小。
- 步骤三：取1:1的比例混合细胞培养物和0.4% 尝试啶蓝溶液，并在计数板中排放好。
- 步骤四：在显微镜下进行细胞计数，计数每个小方格内的细胞数量，并计算平均值。
- 步骤五：根据计数板上的标尺，计算出细胞密度并求出总细胞数量。
三、实验结果经过实验观察和计算，得出以下结果：在计数板的10个小方格中，每个方格内的细胞数量分别为30、28、33、32、29、31、34、27、30、33个。
取平均值计算总细胞数量。
综合计算可得，本次实验观察到的细胞总数为301个。
四、讨论与分析通过细胞计数实验，我们成功地获取了细胞的数量，并得出细胞总数为301个。
这一数据为我们后续实验和研究提供了重要依据。
同时，我们还观察到细胞在培养物中的形态、颜色和大小等特征，这些观察结果对衡量细胞的生长状态和活性也具有重要参考价值。
然而，本次实验也存在一些不确定因素和可改进之处。
首先，由于细胞在培养物中不断生长和分裂，其数量可能会随时间的变化而有所波动。
因此，在实际应用中应多次重复实验，并取平均值以增加数据的可靠性。
其次，在实验过程中，使用0.4% 尝试啶蓝溶液染色可以使细胞更加清晰可见，但染色不当可能会对细胞自身产生影响。
细胞计数板使用方法
细胞计数板使用方法
细胞计数板是一种常用的实验室工具，用于快速而准确地计算细胞数量。
以下是详细的使用方法：
1. 准备细胞计数板及相关材料：细胞计数板、细胞悬液、显微镜、移液器、吸头、生理盐水或细胞培养基。
2. 从细胞培养物中取出适量悬浮细胞，使用移液器将细胞悬液滴在细胞计数板的数格中。
3. 注意避免气泡，确保细胞悬液充分填满数格。
可以稍微轻轻摇晃细胞计数板，使细胞均匀分布在数格内。
4. 将细胞计数板放在显微镜下，使用10倍或20倍的物镜放大倍数。
调整焦距以清晰地观察数格中的细胞。
5. 在显微镜下，以一个正方形的数格为单元，计数该数格中的细胞数量。
遵循计数板上线计数规则，即计数板的四条边（上下左右）的数格细胞只计算该边上线格的细胞，而中央任意一格线格的细胞都要计数。
6. 将所计数的细胞数除以该数格的体积（通常为0.1或0.2 mm³），得到细胞的浓度。
7. 选取不同的数格进行计数，通常建议计数至少3个数格，以提高数据的准确性。
将多个数格的计数结果求平均，得到最终的细胞浓度。
8. 根据实验需要，可以根据细胞计数得到的浓度调整细胞悬液的体积，以达到所需的细胞数目。
9. 清洗细胞计数板，用生理盐水或细胞培养基反复冲洗数格，确保细胞悬液完全清除。
细胞计数板是一种简单而实用的细胞计数方法，但需要注意的是，在操作过程中要严格遵守无菌和安全操作规范，以确保实验结果的准确性和可靠性。
检测培养液中细胞数量的方法
检测培养液中细胞数量的方法一、方法总览哎呀，要检测培养液中的细胞数量呀，这可有点像数星星呢，不过还是有不少有趣的办法的。
咱先说说血球计数板法吧。
这就像是给细胞们安排一个个小房间，然后数每个小房间里有多少个细胞，最后再汇总一下。
你得先把培养液样本准备好，取适量的培养液，不能太多也不能太少，就像做菜放盐一样，得刚刚好。
然后把这个样本小心地放到血球计数板的计数室里。
这时候就得用显微镜啦，通过显微镜去看那些小小的细胞。
不过看的时候可得仔细喽，眼睛都不敢多眨一下，生怕数错了。
而且为了数得准确，可能还得从不同的区域去数，就像在一个大花园里数不同花坛里的花一样。
还有一种方法是利用流式细胞仪。
这就比较高科技啦。
把培养液样本送进流式细胞仪里，就像把一群小动物送进一个神奇的检测通道一样。
这个仪器能一个一个地检测细胞，还能根据细胞的一些特性，比如大小啦、内部结构啦之类的，把不同类型的细胞区分开。
不过这个仪器可有点小脾气，操作起来得按照严格的步骤来，不然它就不乖乖工作啦。
另外，还有细胞计数仪这种专门的仪器呢。
它就像是细胞的专属小管家，只要把培养液样本放进去，它就能快速地给出细胞的数量。
不过在使用之前，也得先把仪器校准好，就像给秤校准一样，不然称出来的重量就不准啦。
二、不同方法的特点1. 血球计数板法优点：这个方法比较简单直接，成本也比较低。
不需要太多昂贵的设备，只要有显微镜和血球计数板就可以啦。
对于一些小型实验室或者对细胞数量检测精度要求不是特别高的情况，是个很不错的选择呢。
缺点：但是呢，它很费时间，而且很考验人的耐心和眼力。
数细胞的时候一不小心就可能数错，而且如果细胞的浓度比较高或者比较低的时候，就不太好数准确了。
2. 流式细胞仪优点：这个可就高大上多啦。
它能够快速地检测大量的细胞，而且能够同时检测细胞的多种特性，得到的数据也比较准确。
对于研究细胞的复杂特性或者对细胞进行分类计数的时候，非常有用。
缺点：缺点就是设备太贵啦，不是每个实验室都能买得起的。
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细胞培养之细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备：
用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。
活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。
如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误：
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六.本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项：
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
简便方法：
胰蛋白酶液消化>>离心>>PBS液1ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液>>取1ul悬液+9ulPBS>>细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.用10ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）的细胞数目。
4.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×106。