抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程

抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程

概述：

抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。

本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。

本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。

研究目的：

建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。

①有效性研究

抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。

②安全性评价

安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。

研究计划：

(a)小鼠急性毒性测试

按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合

物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。

(b)小鼠体内抗肿瘤活性测试

根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。

(c)专利保护范围内的化合物的继续合成

申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。

（d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选

采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。

（e）抗肿瘤作用机理的深入研究

根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。

根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。

（g）动物体内药物代谢动力学实验

选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。

（h）动物亚急性，长毒实验

根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。

基本方法：

①小白鼠的灌胃法

以左手捉持小白鼠，使腹部朝上，右手持灌胃器。灌胃器先从小白鼠口角插入口腔内，然后沿着上颚壁轻轻插入食管，稍感有阻力时（大约灌胃管插入1/2，相当于食管过膈肌的部位），即可推进注射器，进行灌胃（图1）。若注射器推进困难，应重插。若灌胃器误插入气管给药，可致小白鼠死亡。注药后轻轻抽出灌胃管。此法1次给药量为0.01-0.03ml/g。

图1.小白鼠的捉持及其灌胃法

②小白鼠皮下注射法

通常在其背部皮下注射。将其皮肤拉起，注射针刺入皮下，把针尖轻轻左右摆动，易摆动表示已刺入皮下，然后注射药液。拔针时，以手指捏住针刺部位，以防止药液外漏（图2）。该法对小白鼠的1次注射药量为0.01-0.03ml/g。

图2.小白鼠的皮下注射法

③小白鼠静脉注射法

一般采用尾静脉注射法。事先将小白鼠或大白鼠置于固定的筒内或铁丝罩内，或扣于烧杯内，使其尾巴露出（图3）。将尾置于45-50℃的温水中浸泡或用75%的酒精棉球擦之，以使血管扩张。然后，选择尾巴左、右两侧静脉进行注射。注射时若出现隆起的白色皮丘，

说明药物未注入血管。这时，注射器应向尾根部位移动，重新注射。该法对小白鼠的1次注射量为0.005-0.01ml/g。

图3小白鼠尾静脉注射法

④小白鼠腹腔注射法

以左手捉持小白鼠，让其腹部向上，右手将注射器针头刺入皮肤，刺入部位距离下腹部腹白线稍向左或右的位置（图4）。向前推进注射器3-5mm,，接着使注射针与腹部皮肤面呈45°刺入小白鼠的腹肌，继续向前刺入，针头通过腹肌进入腹腔后阻力消失，这时即可慢慢注入药液。对小白鼠的1次注射量为0.01-0.02ml/g。

图4.小鼠腹腔注射法

⑤实验动物的标记

实验用较大动物如兔、猫、犬等可用特制的号码牌固定于耳上。白色家兔和小鼠、大鼠,可用黄色苦味酸（3%-5%）涂于毛上标号。其编号方法无统一规定，以下方法可供参考。

如给小鼠标记1-10号，可将小鼠背部分前肢、腰部、后肢，按左、中、右分为九个区,从右到左标记1-9号，第10号不标记（图5a）。如给小鼠标记1-20号，则（图b）。

1号———右前肢11号———腰部及右前肢

2号———左前肢12号———腰部及左前肢

3号———左后肢13号———腰部及左后肢

4号———右后肢14号———腰部及右后肢

5号———头部15号———腰部及头部

6号———头部及右前肢16号———腰、头部及右前肢

7号———头部及左前肢17号———腰、头部及左前肢

8号———头部及左后肢18号———腰、头部及左后肢

9号———头部及右后肢19号———腰、头部及右后肢

10号———腰部（背中间20号———尾根部

图5.小鼠、大鼠皮毛标记编号法

(a)小鼠急性毒性测试