第二章酶制剂发酵生产
酶工程课后题答案.doc
第一章1.简述酶与一般催化剂的共性以及作为生物催化剂的特点共同点：只能催化热力学所允许的的化学反应，缩短达到化学平衡的时间，而不改变平衡点：反应前后酶本身没有质和量的改变：很少量就能发挥较大的催化作用：其作用机理都在于降低了反应的活化能。
酶作为生物催化剂的特点：1.极高的催化率；2.高度专一性；3.酶活的可调节性；酶的不稳定性。
5.酶失活的因素和机理。
酶失活的因素主要包括物理因素，化学因素和生物因素物理因素1热失活：热失活是由于热伸展作用使酶的反应基团和疏水区域暴露，促使蛋白质聚合。
2冷冻和脱水：很多变构酶在温度降低是会产生构象变化。
在冷冻过程中，溶质（酶和盐）随着水分子的结晶而被浓缩，引起酶微环境中的pH和离子强度的剧烈改变，很容易引起蛋白质的酸变性。
3.辐射作用：电离辐射和非电离辐射都会导致多肽链的断裂和酶活性丧失。
4.机械力作用：化学因素1.极端pH：极端pH远离蛋白质的等电点，酶蛋白相同电荷间的静电斥力会导致蛋白肽链伸展，埋藏在酶蛋白内部非电离残基发生电离，启动改变。
交联或破坏氨基酸的化学反应，结果引起不可逆失活。
极端pH也容易导致蛋白质水解。
2.氧化作用：酶分子中所含的带芳香族侧链的氨基酸以及Met, Cys等，与活性氧有极高的反应性，极易受到氧化攻击。
3.聚合作用：加热或高浓度电介质课破坏蛋白质胶体溶液的稳定性，促使蛋白质结构发生改变，分子间聚合并沉淀。
4.表面活性剂和变性剂：表面活性剂主要改变酶分子正常的折叠，暴露酶分子疏水内核的疏水基团，使之变性；变性剂与酶分子结合，改变其稳定性，使之发生变性。
生物因素微生物或蛋白水解酶的作用使酶分子被水解。
6.简述酶活力测定方法的原理直接测定法：有些酶促反应进行一段时间后，酶底物或产物的变量可直接检测。
间接测定法：有些酶促反应的底物或产物不易直接检测，一次必须与特定的化学试剂反应，形成稳定的可检测物。
酶偶联测定法：与间接测定法相类似，只是使用一指示酶，使第一酶的产物在指示酶的作用下转变成可测定的新产物。
第二章 酶工程
（四）发酵方法
1.温度的控制
– 枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃，黑曲霉 的最适生长温度为28～32℃。
2.通气和搅拌 – 在发酵过程中必须不断供给氧，一般通过供给 无菌空气来实现；
3. pH值的控制
– 细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5～8.0；霉 菌和酵母的生长最适pH值为4～6；植物细胞的 生长最适pH值为5～6。
（3）粘性末端（sticky
ends，cohensive ends）
含有几个核苷酸单链的末端。
分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
② 3’端凸出（如Pst I切点）
（4）粘性末端的意义
①连接便利 i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补 就可以连接。这比连接两个平齐末端容易。
ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末 端可以连接成环形分子。
2．酶的特性 （1）酶催化作用的专一性强 （2）酶催化作用的效率高
（3）酶催化作用的条件温和
3. 酶的分类：
氧化还原酶、转移酶、水解酶、 裂解酶、异构酶、合成酶
（二）酶工程
– 狭义：是指在一定的生物反应器中，利用酶的催 化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术
– 广义：是指研究酶的生产和应用的一门技术性学 科，它包括酶的发酵生产、酶的固定化、酶的化 学修饰、酶反应器和酶的应用等方面内容。
(2)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂
①底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部 的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳 定状态。 ②对巯基酶．可加入SH—保护剂。如巯基乙醇、GSH(谷 胱甘肽)、DTT（二硫苏糖醇)等。
第四节 分子生物学技术常用的工具酶
核酸酶类是基因工程操作中必不可少的 工具酶，基因克隆的许多DNA分子的制备、 DNA片段的切割与连接、核酸探针的标记 cDNA的合成等，都需要用一系列的功能特 意核酸酶来完成。没有酶就没有基因工程。
【发酵工艺学总论】第二章_工业发酵菌种
代表微生物类型 革兰氏阳性球菌
高产培养基设计的几个原则
制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分； 避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物 阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。
酶发酵生产常用的微生物
微生物
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉
生产的酶类
α -淀粉酶、蛋白酶、β -葡聚糖酶、碱性磷酸酶等 谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等 糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等 葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核 酸酶等 纤维素酶等 糖化酶、 α -淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果 胶酶、纤维素酶等
样品的预处理
目的：提高分离效率 方法：
物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法（浓缩）； 离心法（浓缩） 化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特
定微生物的数量。
几丁质——放线菌；CaCO3——嗜碱性放线菌
诱饵法
石蜡、花粉、蛇皮、毛发等
分离方法的选择
根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 选择性分离 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离
增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长 或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选， 存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶工程第二章微生物发酵产酶
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参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
酶制剂生产工艺流程
酶制剂生产工艺流程酶制剂是一种由酶制备的药物，被广泛应用于医药、食品、化学工业等领域。
酶制剂的生产工艺流程主要包括五个步骤：原料准备、酶发酵、分离和纯化、干燥和包装。
首先，原料准备是酶制剂生产的第一步。
原料主要包括基础培养基、基因工程菌株和辅助物质。
基础培养基是酶发酵的基础，其中包含有机氮源、碳源、无机盐等成分，其他还需要加入一些辅助物质如缓冲剂、抗泡剂等。
基因工程菌株是通过基因重组技术构建的，用于产生目标酶。
辅助物质是为了提高发酵的效果和酶的稳定性。
第二步是酶发酵。
将准备好的基础培养基中添加基因工程菌株，并进行培养。
培养条件包括温度、pH值和气氛等。
通常情况下，酶发酵一般分为激活阶段、生长阶段和酶合成阶段。
在激活阶段，菌株将从冷冻状态中恢复活性。
在生长阶段，菌株将进行繁殖，并伴随有机物的消耗和产生。
在酶合成阶段，酶的合成量开始增加。
整个发酵过程需要严格控制各个参数，以确保酶的产量和质量。
第三步是分离和纯化。
将发酵后的培养液通过离心、过滤等分离方法，将酶分离出来。
之后，通过流动层析、离子交换等纯化方法，除去杂质，得到纯净的酶制剂。
分离和纯化过程中需要选择合适的材料和工艺条件，以确保酶的活性和稳定性。
第四步是干燥。
将纯化后的酶制剂进行干燥处理，以去除水分，防止酶的降解和微生物的污染。
干燥方法主要有喷雾干燥、冷冻干燥等。
选择适当的干燥方法可以减少酶的损失并提高产量。
最后一步是包装。
将干燥后的酶制剂进行包装，通常采用密封、无菌的包装方式，以确保酶的稳定性和长期保存。
综上所述，酶制剂的生产工艺流程主要包括原料准备、酶发酵、分离和纯化、干燥和包装等五个步骤。
每个步骤都需要严格控制各项参数，以确保酶制剂的产量和质量。
同时，工艺流程中的每个环节都需要选择适当的材料和工艺条件，以确保酶的活性和稳定性。
2012级名词解释酶工程
名词解释：每章的关键词（英文），就是表达本章中心内容的有实质意义的词汇。
各章重点第一章绪论一、酶工程的概念、分类及其研究内容。
生物酶工程的内容、什么是核酶二、简述酶活力测定方法的原理；酶活力单位；比活力等第二章酶的生物合成与发酵生产一、克隆酶：利用DNA重组技术而大量生产的酶。
二、什么是抗体酶？抗体酶：抗体酶是一类免疫系统产生的、具有催化活性的抗体。
三、酶生物合成的模式四、一些概念的区别：操纵子与操纵基因、诱导酶与组成酶、胞内酶与胞外酶、产酶动力学五、原核酶合成调节的类型有哪些？六、在酶制剂工业生产中为什么以微生物发酵生产为主？七、如何提高酶的产量？1选育优良的产酶细胞株系（生产组成型酶突变株的筛选，抗分解代谢阻遏突变株的选育，抗反馈阻抑突变株的筛选）2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂第三章酶的提取与分离纯化一、细胞破碎的目的、方法及原理。
二、酶抽提的目的及方法。
三、常用沉淀法的种类及原理。
四、常用沉淀法的种类及原理。
盐析法分离蛋白质的原理。
五、简述酶分离纯化方法及工艺程序的选择策略。
先选用非特异的、低分辨的技术，去除主要的杂质并使酶溶液浓缩；如沉淀、超滤和吸附等。
随后采用高效分离的手段；如离子交换层析、亲和层析。
将最昂贵、最费时的分离单元放在最后阶段。
如凝胶过滤层析。
六、简述影响酶提取的主要因素及影响规律。
抽提溶质的性质（酸性酶宜用碱性溶剂抽提，碱性酶宜用酸性溶液抽提，极性大的酶宜用极性溶剂抽提，含有较多非极性基团的酶宜用有机溶剂抽提。
）。
抽提溶剂的用量（增加用量可以提高酶的提取率。
但是过量的抽提溶剂，会使酶的浓度降低，对酶的进一步分离纯化不利。
用量一般为原料体积的3~5倍，最好分次抽提）温度（提取时温度对酶的提前效果有明显影响。
一般来说，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，增大酶分子的扩散速度。
但温度过高易引起酶变性失活，所以提取温度不宜过高。
要根据被抽提酶的酶学性质选择适宜温度）pH 对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
发酵食品学第二章发酵的生化历程及工艺调控课件
（周期短，质量稳定，便于调控）
三、环境条件（发酵条件）
❖ 决定了微生物作用的方向，也决定了产 物的形成。
❖ 环境条件包括：
❖ 固态发酵：原料配比及预处理、气体环境、 Aw、RH、pH、热传递与控温等。
❖ 液态发酵：发酵液浓度（基质浓度变化）、 溶氧、pH、T、发泡与消泡、无菌检查、发 酵终点判断等。
❖ 老化本质：α化的淀粉分子又自动排列成序，形 成致密、高度晶化的不溶性的淀粉分子胶束
可视为糊化的逆转，但不是彻底复原，仍为生淀粉 （β—）的结构状态，但晶化程度比生淀粉低。
淀粉的水解
❖ 淀粉水解历程： 淀粉（深蓝）
（多苷链的片段）
糊精（蓝）
（低于6个残基）
无色糊精
单糖
寡糖
注：糊精化程度低的称为可溶性淀粉，碘检时仍呈蓝色
第二节、发酵食品生产的一般工艺
一、发酵工艺的类型
❖ 按发酵基质的物理性质分： ❖ 固态发酵（SSF， Solid State Fermentation） 是指在没有或几乎没有游离水的不流动基质上培养微生物 的过程，此基质称为“醅”。 ❖ 液态发酵（LSF，Liquid State Fermentation 或 Liquid Submerge Fermentation）基质是流动状态，称 为发酵“液”。 ❖ 半固态发酵（Semi---SSF）发酵基质是流动状 态，原料颗粒悬浮于液体中。 基质呈流动状态，称为“醪”
（4）果胶和木质素的降解
果胶酯酶、果胶水解酶、果胶裂解酶
果胶
单体、二聚体、三聚体
酚氧化酶、漆酶、过氧化物酶
木质素
香气成分前体（如：愈创木酚）
植物性原料用于发酵，果胶、木质素需先水解成糖，才 能将纤维素和其它内部成分暴露出来
酶工程--酶的微生物发酵生产 ppt课件
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养
种子罐培养 培养基 发酵罐
分离纯化 酶
无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
DNA
转录
RNA
发酵与酿造技术16.酶制剂发酵生产
酶的概念
核酶的发现，改变了有关酶的概念，即 “酶是具有生物催化功能的生物大分子 （蛋白质或RNA）。 酶分两大类： 主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶） 主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）
1、酶的认识
1833年，佩恩(Payen)和帕索兹(Persoz)首先发现酶； 1857年，巴斯德(Pasteur)提出酒精发酵是酵母细胞活 动的结果； 1878年，库尼(Künne)提出“酶”（Enzyme)这个名 称； 1897年，巴克纳(Büchner)兄弟成功地用不含细胞的 酵母汁实现了发酵，证明了发酵与细胞无关； 1913年，米彻利斯(Michaelis)提出了酶的动力学说； 1926年，萨姆纳(Sumner)第一次从刀豆中提出脲酶结 晶，并证明酶具有蛋白质性质； 1930年，Northrop分离出结晶的胃蛋白酶、胰蛋白酶 及凝乳蛋白酶，并进行了动力学探讨，确立了酶的蛋白质 本质。 1982年，切克(Cech)等发现核糖体(RNA)也具有催化 活性。
纤维素酶 半纤维素 酶 β-葡聚糖 酶 异淀粉酶 里氏木霉、黑曲霉 水洗布生产，饲料添加剂， 消化植物细胞壁 饲料添加剂，消化植物细胞 壁，低聚木糖生产
木霉、曲霉、根霉
枯草芽胞杆菌，黑 曲霉， Penicillium emersonii 产气克雷伯氏菌， 芽孢杆菌
啤酒酿造，饲料添加剂
淀粉加工
乳糖酶
果胶酶
酶工程是生物技术的重要组成部分
酶工程是酶学基本原理与化学工程相结合而形成的一门新 兴的技术科学。研究酶制剂大规模生产及应用所涉及的理 论与技术方法。 常规菌（或常规细胞株） 改造物种 基因工程、细胞工程 生物工程（学） 工程菌（或工程细胞株）
医用酶制剂的发酵原理
医用酶制剂的发酵原理医用酶制剂是由酶通过发酵过程获得的，在医疗领域具有广泛的应用。
这些酶能够帮助人体进行消化、代谢和修复等生理过程，具有医学价值。
医用酶制剂的发酵原理涉及酶的产生、提取和纯化等过程。
首先，酶的产生是通过酵母、细菌、真菌或植物细胞等微生物进行发酵。
发酵过程包括酶生产菌株的培养、发酵培养基的配制和发酵条件的控制等步骤。
在酶生产菌株的培养过程中，首先需要选择适合生产酶的菌株。
通常选择的菌株能够迅速生长并产生高活性酶。
例如，泛菌纤维素酶生产菌株常用枯草杆菌和木霉菌等。
接着，将选择的菌株接种到含有营养物质的培养基中，提供碳源、氮源和微量元素等。
同时，酶产生的最佳pH和温度条件也需要被设定，以促进菌株生长和酶合成。
在发酵过程中，通过精确调控培养基中的各种物质含量和发酵条件，促进酶的生产。
培养基的发酵液通常包含有机碳源（如葡萄糖或甘酒）、氮源（如酵母提取物或氨基酸）、矿物元素和维生素等。
此外，酶的产生还受到发酵条件的影响，如温度、pH和氧气浓度等。
在发酵过程中，这些条件需要不断调整和优化，以实现最佳的酶产率和活性。
酶的提取和纯化是医用酶制剂发酵过程的关键步骤之一。
提取酶的方法通常可以通过机械破碎和物理处理等，以将酶从微生物体内释放出来。
接下来，通过离心、过滤和溶剂沉淀等方法，去除杂质和固体颗粒。
经过初步提取后，通过离子交换或凝胶过滤等层数分离纯化步骤，进一步净化酶。
最后，纯化的酶通常被结冰干燥或冷冻保存，以保持长时间的稳定性和活力。
为了确保酶制剂的质量，通常会进行质量检测和活性测定，例如酶的比活性、酶的纯度和酶的稳定性等。
这些测试方法可以确保酶制剂符合医用酶的要求，安全有效地应用于临床领域。
综上所述，医用酶制剂的发酵原理可以分为酶的产生、提取和纯化等过程。
通过选择适宜的菌株、优化发酵条件以及合理的提取和纯化方法，可以获得高质量和高活性的医用酶制剂。
这些酶制剂在临床应用中发挥着重要的作用，帮助人们解决各种消化、代谢和修复等问题。
酶的发酵生产
特点： ①适用性强，可用于各种细胞的悬浮培养和发酵； ②易于人为控制； ③机械化程度高，酶产品质量较好，酶产率及产品回收率较 高。 （三）固定化细胞发酵（70 年代后期） 固定化细胞： 固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命 活动（生长、繁殖和新陈代谢）的细胞。
优点： ①固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提 高生产能力； ②发酵稳定性好，固定化细胞可以反复使用或连续使用较长的 时间，易于连续化，自动化生产； ③细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续 发酵，大大提高设备利用率； ④发酵液中含细胞较少，利于产品分离纯化，提高产品质量。 缺点： ①只适用于胞外酶的生产； ②技术要求较高，需要特殊的固定化细胞反应器，且许多技术 问题都有待研究解决。
二．发酵液的分离、过滤：得到粗品 设备：转鼓式真空吸滤机，离心沉降分离机，板框压滤机。 三．酶液的脱色 活性炭或使用无离子交换作用的脱色树脂。 四．发酵液的浓缩与初步提纯 （一）盐析 1．常用的盐：MgSO4, (NH4)2SO4, (Na)2SO4, NaH2PO4, 它们 盐析蛋白质的能力一般按以上顺序依次增大。实际应用得最多的 是(NH4)2SO4，因其溶解度 在较低的温度下仍相当高。 2．优点：在常温沉淀过程中不会造成酶的失活，沉淀物在室温 下可长期放置，分级沉淀可去除大部分杂质，适用于多数酶的沉 淀。 3．缺点：要经脱盐处理。
七．提高酶产量的其它措施 1．添加诱导物 诱导物一般分为三类：酶的作用底物或底物类似物以及酶的 反应产物。 选择： a. 特异性； b. 诱导效果； c. 来源。 2．控制阻遏物浓度 根据不同的阻遏类型，采取不同的控制方式 ①分解代谢物阻遏
a. 采用其它的碳源； b. 控制浓度，或分次流加； c. 加一定量的cAMP. ②反馈阻遏 a. 控制终产物浓度； b. 添加末端产物类似物。 3．添加表面活性剂 4．添加产酶促进剂
酶工程终结版名词解释
酶:有催化功能的生物大分子分为:蛋白酶(P酶)和核酸类酶(R酶)(主要由RNA组成)酶的特点:催化效率高、专一性强、作用条件温和酶工程主要内容：微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶、酶的提取与分离纯化，酶分子的修饰，酶，细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用酶的催化效率比非酶催化反应高107~1013倍酶催化作用的影响因素：底物浓度、酶浓度、温度、Ph 值、激活剂浓度、抑制剂浓度酶在60度以上易失活常见激活剂：ca、mg 、co、zn 、mn 、cl（α——淀粉酶），钴离子和镁离子是葡萄糖异构酶的激活剂酶的命名：国际酶学委员会ICE ：推荐名和系统名推荐名：底物名+催化反应类型+酶（水解酶类可省略反应类型名，只在底物后加酶字即可）系统名：作用底物+酶的作用基团+催化反应类型按酶的催化作用类型将蛋白酶分为6大类：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂解酶，异构酶，合成酶将R酶分为：剪切酶、剪接酶、多功能酶还可以由酶的底物是RNA分子还是其他分子，可将R酶分为分子内催化和分子间催化酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。
酶催化反应速度，通常用单位时间t内底物S的减少量或产物P的增加量来表示1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定的条件下（温度可采用25摄氏度，pH值等条件均采用最适条件），酶1min催化1umol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat），在特定条件下酶1s催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1kat 酶的比活力，是指在特定的条件下，单位重量(mg)蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
固定化酶：与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶酶的提取：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。
酶提取注意事项：1、目标酶分子的特性及其物理、化学特性，2、酶分子和杂质的主要性质差异，3、酶的使用目的和要求，4技术实施的的难易程度，5、分离成本的高低，6、是否会造成环境污染。
酶制剂的生产优秀课件
2.1.2. 集中垄断，市场全球化：
❖ 规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多 家，占市场90%
❖ 丹麦诺维信novozymes→1978年进入中国（天 津）；
❖ 美国杰能科公司（Genencor）→98年进入中国， 与无锡合资，控股80%（无锡，2005年杰能科国 际公司被丹尼斯克公司收购）；
2.2.1 产酶微生物
❖ 菌种是发酵生产酶的重要条件。 ❖ 菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发
酵条件、工艺等关系密切。 ❖ 已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工
业发酵生产的酶约有50～60种。它们的生产菌种 十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。
第二章 酶的发酵生产
酶源 ❖酶可由动物（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）、
不可培养微生物
❖用PCR技术从土样中直接扩增DNA，能够 从不可培养的微生物中分离到DNA，并用 作克隆来源，可获得更多种类的酶。
链霉菌（Streptomyces）
❖ 链霉菌是一种放线菌。菌落呈放射状，有分枝菌丝体，菌 丝直径0.2-1.2μm，G+。
❖ 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，气生 菌丝形成孢子链。
酵母的形态
红酵母的菌落
产酶微生物的分离筛选方法
（1） 平板分离（选择性分离筛选平板） （2） 摇瓶逐个检测方法
培养基
❖ 细菌：营养肉汤琼脂培养基（pH 7.0，30-37℃） ❖ 霉 菌 ： 可 用 察 氏 、 土 豆 （ PDA ） 、 麦 汁 琼 脂 培 养 基
2.1.4. 应用领域不断扩大：
❖ 美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲 料工业、洗涤剂工业、化学工业。
第二章 微生物产酶
滞后合成型
• 1）细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始酶 的合成，又称非生长偶联型。
• 2）许多水解酶属于此合成模型。 • 3）阻碍物存在延缓了酶的合成。 • 4）酶的mRNA稳定。 • 5）滞后合成型↔延续合成型。
6）典型例子：黑曲霉培养合成羧基蛋白酶
图2-11，黑曲霉细胞生长约 24h后，几乎进入平衡期， 此时羧基蛋白酶才开始合成， 直至80h，酶的合成还在继 续。
④最好分泌胞外酶，产量高且易纯化。
⑤能利用廉价原料，营养要求低，对培养基要 求不苛刻，发酵周期短、原料利用率高、易于 培养。
采用一个新的产酶菌时，应有大量病理或动物 喂养实验数据作基础。美国FDA认定可用于食 品医药工业的生产菌有：曲霉（黑曲霉、米曲 霉）、枯草杆菌、某些芽孢杆菌、某些酵母、 根霉等。
5）典型例子：米曲霉培养生产单宁酶
图2-8 所示，单宁酶的生物合成与米曲霉细胞生长同步，属于同步合成 型（生长偶联型）
延续合成型
1）酶的生物合成伴随细胞生长开始，当细胞进入 平衡期后酶还可以继续合成。
2）酶的生物合成可以被诱导物诱导，一般不被细 胞代谢物阻碍。
3）酶的mRNA相当稳定。在平台期仍然可以翻译成 酶。
4）典型的例子， 黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶（图2-9A）。
图2-9A，以半乳糖醛酸为诱导物的情况下，培养一段时间以后（约40h）， 细胞生长旺盛，半乳糖醛酸酶开始合成；当细胞生长达到平衡期（约 80h），此酶继续合成，直至约120h以后。呈现延续合成型模式。 图2-9B，以粗果胶（含葡萄糖）为诱导物时，细胞生长较快，但是聚半乳 糖醛酸酶的合成被推迟。 因此，酶合成受到分解代谢物阻遏，葡萄糖被细胞利用完之后，酶才开始 合成，细胞进入平衡期，酶的合成还在继续。呈现滞后合成型模式。
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DNA
RNA聚合酶
③结构基因（Structure）：
是DNA模板，在RNA聚合酶作用下，根据其 碱基序列转录出mRNA。
S
R
P O Lac z Lac y Lac a
RNA聚合酶 mRNA z
mRNA y
DNA 转录
mRNA a
翻译
酶
④操纵基因（Operator）：
位于启动基因和结构基因之间的一段碱基序 列，是阻遏蛋白的结合位点。在操纵子中起 “开关”作用。
mRNAz
转录
mRNAy mRNAa
阻遏蛋白
RNA聚合酶
酶
翻译
利用现代育种技术，使调节基因发生突变，致 使其不能产生阻遏蛋白，使诱导酶变成组成酶。
② 操纵基因O突变
S
R
PO
Lac z Lac y Lac a
转录
阻遏蛋白(有活性)
RNA聚合酶
mRNAZ mRNAY
mRNAa
翻译
酶
利用现代育种技术，使操纵基因发生突变，使 其不与阻遏蛋白作用，使诱导酶变成组成酶。
二、酶合成的反馈阻遏 Repression
❖ 反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产 生阻遏作用
调节基因
操纵基因
结构基因
mRNA
阻遏蛋白
酶代谢产物一旦大量积累
酶蛋白
阻遏蛋白不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。 阻遏蛋白被产物激活，结构基因不表达。
❖ 这一理论在实践意义：
(1)设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈 阻遏。
乳糖
启动 操纵 基因 基因
PO
RNA聚合酶
S 结构基因
Lac z Lac y
Lac a
转录
mRNAZ mRNAY
mRNAA
翻译
酶
Question：
以上理论对指导酶制剂 生产有何实际意义？
3、乳糖操纵子假说对指导 酶制剂生产的意义
在酶合成时添加诱导物
关键：选择合适的诱导物和其浓度
底物 底物的
实验确定
结构类似物
生产实例：酵母生产β- 半乳糖苷酶
以葡萄糖作唯一碳源 培养酵母菌
几分钟后 以乳糖作为唯一碳源 培养酵母菌
乳糖最佳诱导浓度：120g/L
β-半乳 糖苷酶
意义2：利用现代诱变育种技术 使基因发生突变
① 使调节基因R发生突变 ② 使操纵基因O发生突变
① 调节基因R突变
S
R
P O Lac z Lac y Lac a
葡萄糖过量存在——放出的能量部分储存在ATP中
ADP+AMP ——ATP
磷酸二酯酶
cAMP +H2O
AMP
cAMP-CRP复合物的浓度降低 启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合 RNA聚合酶无法结合到启动基因 酶的生物合成无法进行。
分解代谢阻遏实例
酶 α-淀粉酶
微生物
引起阻遏作用物质
嗜热脂肪芽孢杆菌 果糖
第二节 产酶微生物的筛选
动物 酶 植物
微生物
微生物易于大量培养，倍增时间短； DNA技术使微生物生产特殊作用的酶， 并大大提高产量； 因此，微生物可以说是酶商业化生产的最佳来源。
1、产酶菌的分布规律
为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可 以从该物质比较丰富的地方寻找。
Exp. 豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌； 油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微 生物； 处理降解合成物质的产酶菌则往往能在污水 处理处获得；
纤维素酶
绿色木霉
葡萄糖、甘油、纤维二糖
蛋白酶
巨大芽孢杆菌
淀粉葡萄糖苷酶 二孢内孢酶
葡萄糖 麦芽糖、葡萄糖、甘油
❖ 用甘油代替果糖培养嗜热脂肪芽孢杆菌，α淀粉酶产量可提高25倍。
❖ 采用甘露糖作为荧光假单胞杆菌培养基时， 纤维素酶的产量比用半乳糖作为培养基时要 高1500倍以上。
❖ 如果微生物需要某些代谢阻遏物作为碳源， 在工业生产中则可采用限量流加碳源的办法， 便可减少或避免这种阻遏作用。
操纵
DNA
基因
Operon 操纵子
①调节基因（Regulatory gene）：
可产生阻遏蛋白，阻遏蛋白能与操纵基因 结合。
S
R
P O Lac z Lac y Lac a
R
DNA
阻遏蛋白
②启动基因（Promotor）：
是RNA聚合酶的结合部位和转录起点。
S
R
P O Lac z Lac y Lac a
（1）决定酶合成有两个不同的基因群。
决定酶合成的 两个基因群
操纵子 （operon）
启动基因P 操纵基因O 结构基因S
调节基因R (Regulatory gene)
P: Promotor O: Operator S: Structure
调节 基因
R
启动 基因
结构 S 基因
P O Lac z Lac y Lac a
第二章 酶制剂发酵生产技术
第一节 酶生物合成调控机制
❖ 酶合成方式： 1958 Crick 中心法则
转录 DNA
翻译
mRNA
酶
RNA聚合酶
转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物， 在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成 RNA的过程。
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的 作用，合成多肽的过程。
2、菌种生产性能鉴定
❖ 生产性能鉴定主要通过初筛和复筛确定。
❖ 初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目 标酶的菌株，要求检出方法快捷、简便
❖ 初筛多选用平板培养透明圈法
❖ 细胞外的水解酶
1、溶解度——不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、 细胞壁等培养基中生长——透明圈大小
2、酸碱度——酸碱指示剂——变色圈大小和颜色
三、酶合成由于葡萄糖的存在 虽然能迅速生长，但明显地抑制某些分解代 谢诱导酶的形成。
将E.coli培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基上，
出现“二峰生长现象”
即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗尽之后诱 导形成-半乳糖苷酶
葡萄糖分解产物对-半乳糖苷酶形成阻遏
S
R
P O Lac z Lac y Lac a
DNA
（2）乳糖酶合成调控方式
A、无诱导物（乳糖）存在
调节 基因
R
阻遏蛋白（ 有活性）
启动 操纵 基因 基因
S 结构基因
P O Lac z Lac y Lac a
RNA聚合酶
转录
mRNA
翻译
酶
B、有诱导物（乳糖）存在
调节 基因
R
阻遏蛋白(有活性) 阻遏蛋白(无活性)
一、诱导作用（Induction）
1、概念： 某些酶在通常情况下生物体不能合成或合成 很少，但加入“诱导物”后，就能大量合 成，这种现象称为诱导。
20世纪60年代初 法国 巴斯德研究所 F. Jacob and J. Monod “乳糖操纵子假说”
Lac z Lac y Lac a
乳糖酶
2、乳糖操纵子假说