高效液相色谱法
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
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液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
高效液相色谱法
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特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
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2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
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第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
高效液相色谱法
60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
高效液相色谱方法及应用
高速、高效、高灵敏度、高自动化。
1.1.2 与气相色谱法比较
应用范围广、更利于选择最佳分离条件且可在常 温下操作。
1.1.3 高效液相色谱法的特点
（1）分离效能高 （2）选择性高 （3）检测灵敏度高 （4）分析速度快 适合于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离 分析方法。
1.2 高效液相色谱法的分类
按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类 1.2.1 吸附色谱（Adsorption
Chromatography） 1.2.2 分配色谱（Partition Chromatography） 1.2.3 离子色谱（Ion Chromatography） 1.2.4 体积排阻色谱（Size Exclusion
2.3.3 柱温箱的温度控制要求比较精确，因 为流体的粘度受温度的影响较大。
2.4 检测器
2.4.1 检测器的性能指标 （1）噪声 （2）基线漂移 （3）灵敏度 （4）线性范围 （5）检测器的池体积
2.4.2 检测器的种类
2.4.2.1 紫外吸收检测器
（ultraviolet－visible detector，UVD ）
• 进样系统：进样器，进样阀。 • 分离系统：色谱柱，恒温箱。 • 检测系统记录系统：检测器、记录装置
2.1 高压输液系统
2.1.1 贮液罐 2.1.2 流动相脱气
（1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法 （4）超声波脱气法 （5）在线真空脱气法
2.1.3 高压输液泵
（1）恒流泵：输出恒定体积流量的流动相 （2）恒压泵：又称气动放大泵，输出恒定压力的泵。
Chromatography） 1.2.5 亲和色谱（Affinity Chromatography）
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
中国药典-高效液相色谱
分离度(R)
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
8
二极管阵列检测器 （diode array detector，DAD）
特点：在任一时间内，均可同时得到
物质在不同波长下的吸收情况，即三
维图谱
多组分混合物的三维图谱
流动相
反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末 端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合 时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液 的流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
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ห้องสมุดไป่ตู้
正文规定的定量方法如果不是内标法，建议用固定体积的定量环 进样器； 色谱柱通常为不锈钢柱，其尺寸规定在正文中（长度和内径）； 正文中规定的固定相如以字母表示，即指本节所附的固定相，该 固定相的粒度在字母后的括号内写明，有时标明适用牌号，并不 等于别的牌号不能用。 本节所附的固定相有：固定相A为硅胶颗粒，固定相B为表面化学 键合辛烷基硅烷的硅胶颗粒，固定相C为表面化学键合十八烷基 硅烷的硅胶颗粒。 除另有规定外，色谱分离是在恒定的室温下进行，光度检测器的 流通池体积以10ul为宜。对色谱条件的变更未作详细说明，但说 明了分析工作者改变色谱条件，应能得到与要求一致的结果。溶 剂和试剂的质量应适于液相色谱法的应用。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
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仪器分析练习题（二）——高效液相色谱法部分一、选择题1. 分离一组高聚物（分子量>2000）时最宜采用的色谱方法是（ D ）A. 气固色谱B. 反相键合相色谱C. 离子交换色谱D. 凝胶色谱2. Si-O-Si-C型的18烷基固定相可用于（ B ）A. 正相色谱B. 反相色谱C．离子交换色谱 D. 空间排阻色谱3. 反相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（ A ）。
A. 增大B. 减小C. 不变D. 不能确定4. 下列试剂中可作为正相色谱流动相的是（ C D ）。
A. 水B. 甲醇C．乙腈 D. 正已烷5. 在惰性担体表面健合上基团－SO3ˉ后的离子交换树脂称为（ B ）。
A．强碱性阳离子交换树脂 B. 强酸性阳离子交换树脂C．强碱性阴离子交换树脂 D. 强酸性阴离子交换树脂6. 分离一组高沸点的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ D ）。
A. 气液色谱B. 气固色谱C. 毛细管气相色谱D. 液相色谱7. 应用正相色谱法分析一组组分时，组分的出峰顺序为（ A ）。
A. 极性小的组分先出峰B. 极性大的组分先出峰C. 分子量小的先出峰D. 分子量大的先出峰8. 火焰光度检测器是（ C ）检测器。
A. 通用型、质量型B. 通用型、浓度型C. 选择型、质量型D. 选择型、浓度型9. 梯度洗脱适用于下列哪种色谱分析方法是（ C ）。
A. 气液色谱B. 液液分配色谱C. 凝胶色谱D. 反相键合相色谱10. 下列试剂中最适宜作为反相色谱流动相的是（ A ）。
A. 甲醇水B. 环已烷C．四氯化碳 D. 正已烷11. 在惰性担体表面健合上基团－NR3＋后的离子交换树脂称为（ C ）。
A．强碱性阳离子交换树脂B. 强酸性阳离子交换树脂C．强碱性阴离子交换树脂D. 强酸性阴离子交换树脂12. 分离一组难挥性、可离解的物质时最宜而是采用的色谱方法是（ C ）。
A. 气液色谱B. 正相色谱C. 离子交换色谱D. 气固色谱13. 应用反相键合相色谱分离R-CH3、R-COOH及R-COCH3（R为一长碳链）时出峰顺序为（ A ）。
A. R-COOH、R-COCH3 、R-CH3B. R-CH3 、R-COCH3 、R-COOH、C. R-COCH3 、R-COOH、 R-CH3D. R-CH3 、R-COOH、R-COCH314. 离子交换色谱法通常以（ C ）为流动相的主体。
A. 正已烷B. 环已烷C．水 D. 甲醇15. 分离一组蛋白质时，最宜采用的色谱方法是（ D ）。
A. 气固色谱B. 反相键合相色谱C. 离子交换色谱D. 凝胶色谱16. 正相离子对色谱法分离试样组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留时间（ B ）。
A. 增大B. 减小C. 不变D. 不能确定17. 离子交换色谱法分离柠檬酸离子、Brˉ、HCOOˉ、OHˉ时，滞留次序为（ A ）。
A. 柠檬酸离子>Brˉ>HCOOˉ>OHˉB. 柠檬酸离子<Brˉ<HCOOˉ<OHˉC. HCOOˉ<OHˉ<柠檬酸离子<BrˉD. 柠檬酸离子<OHˉ<HCOOˉ<Brˉ二、判断题1. 应用正相液液分配色谱分离样品时可通过梯度洗脱方式提出分离效果。
（×）2. 离子色谱分析样品时常采用电解质作为流动相。
（√）3. 空间排阻色谱法是依据组分的分子量或分子尺寸进行分离的。
（√）4. 液液分离色谱可采用改变流动相梯度的方式来提高分离效果。
（×）5. 由于分子的扩散系数较小，在高效液相色谱中分子扩散项对色谱峰扩展的影响可以忽略。
（√）6. 热稳定差的有机化合物原则上可采用高效液相色谱法分离、分析。
（√）7. 在液-液色谱法中，为了避免固定相的流失，对于亲水性固定相可采用疏水性流动相。
（√）8. 静电力是非极性分子间存在的相互作用力。
（×）9. 色谱分析时，如应用内标法分析试样中某组分含量，则测量结果与进样量无关。
（×）10 离子交换色谱法分析样品时，被分析物质电离后产生的离子电荷符号与树脂上的反离子的电荷符号相同。
（√）11. 应用空间排阻色谱法分析样品时，分子量小的组分先出峰，分子量大的组分后出峰。
（×）12. 反相色谱法分离物质时，极性小、沸高低的先出柱。
（×）13. 由于使用了高压输送流动相，在高效液相色谱法分析样品时，谱峰展宽仅与传质阻力有关。
（×）三、填充题1. 高效液相色谱法中流动相传质阻力项分为流动状态的流动相传质阻力项和滞留的流动相中的传质。
2. 液相色谱法中，影响谱峰扩展的因素除了柱内效应还有柱外效应。
3. 在应用反相离子对色谱分离组分时，随着对离子浓度的增大，组分的保留值将增大。
4. 空间排阻色谱法是以凝胶作为固定相。
5. 为了避免固定相的流失，在液-液色谱法中，对于亲水性固定相可采用疏水性作流动相。
7. 离子交换色谱主要依据待测离子对交换剂具有不同的亲和力而进行分离的。
8. 色谱分析时，随着柱温的提高，组分的分配系数将降低。
9. 化学键合固定相的分离机制包括分配和吸附两方面。
10. 分子间的作用力包括静电力、诱导力、色散力和氢键。
11. 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术。
12. 应用反相色谱法分析极性组和非极性组分时，极性组分先出峰。
13. 如采用反相色谱法分离甲苯、苯甲酸，先出峰的是苯甲酸。
14. 如采用凝胶色谱法分离分子量为 1.45×107和 5.34×104的两种多糖，先出峰的是 1.45×107。
15. 离子色谱法是以离子交换树脂作为固定相，以电解质作为流动相。
16. 液固色谱法根据物质在固体吸附剂表面活性中心的吸附能力不同来进行分离的。
17. 采用电子捕获检测器分析样品时，一般要求载气的纯度为 >99.99% 。
四、名词解释1. 梯度洗脱:流动相中含有两种或更多不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过流动相中极性的变化改变被分离组分的容量因子k和选择因子，一提高分离效果。
2. 电泳：在外加电场的影响下，带电胶体粒子或离子在分散介质中作定向移动的现象称为电泳。
五、简答题1. 简述高效液相色谱仪的基本结构，并各举例1~2个常用部件说明。
答：高效液相色谱仪基本上由输液系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统等部分组成。
输液系统包括贮液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、梯度洗脱装置、混合室、压力表和阻尼器进样系统包括进样口、注射器或进样阀等；HPLC色谱分离系统包括色谱柱、恒温器、连接管等，是HPLC的核心。
检测系统常用得是电导检测器，紫外光度检测器等。
2.液相色谱的梯度洗提与气相色谱中的程序升温有何异同之处？。
答：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提．是改进液相色谱分离的重要手段．梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度．程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段．3. 从分离原理、应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。
同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。
气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。
而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。
但是二者均可与MS等联用。
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。
而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。
4.简述HPLC中降低板高，提高柱效的方法。
答：①减小填料粒度是提高柱效的最有效途径；②用低粘度溶剂作为流动相；③减小填料孔穴深度及增大孔径；④采用适当低的流速；⑤提高柱温，降低流动相粘度。
5. 液相色谱有几种类型?写出其中三个的保留机理答：液相色谱有以下几种类型:液-液分配色谱; 液-固吸附色谱; 化学键合色谱;离子交换色谱; 离子对色谱; 空间排阻色谱等。
其中;①液-液分配色谱的保留机理是通过组分在固定相和流动相间的多次分配进行分离的。
②液-固吸附色谱是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的。
③化学键合色谱中由于键合基团不能全部覆盖具有吸附能力的载体。
④离子交换色谱和离子色谱是通过组分与固定相间亲合力差别而实现分离的。
⑤离子对色谱色谱中,样品组分进入色谱柱后,组分的离子与对离子相互作用生成中性化合物,从而被固定相分配或吸附进而实现分离的。
⑥间排阻色谱是利用凝胶固定相的孔径与被分离组分分子间的相对大小关系,而分离、分析的方法。
（以上六种任选三种）6. 简述HPLC法所使用的化学键合固定相的优点。
答：①固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；②无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命；③可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析；④有利于梯度洗提,也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集；8. 简述HPLC分析时选择流动相应注意的因素。
答：①流动相纯度，一般采用色谱纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去有干扰的杂质。
②应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。
③对试样要由适宜的溶解度，否则在柱头易产生部分沉淀。
④溶剂的黏度小些为好。
⑤应与检测器相匹配。
9.简述影响高效液相色谱法塔板高度变化的主要因素。
答：①当流动相得线速度大于0.5cm·s-1时，纵向扩散项对塔板高度的变化是可以忽略的。
②流动的流动相中的传质阻力项影响塔板高度是与线速度u和固定相粒度dp的平方成正比，与试样分子在流动相中的扩散系数Dm成反比。
③柱温，流动相的黏度等Welcome !!! 欢迎您的下载，资料仅供参考！。