呕吐毒素标准检测规程完整

呕吐毒素标准操作规程

1、目的

为了规亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。

2、围

本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。

3、检出限和定量限

5.1 原理

测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。

5.2 溶液配制

5.2.1 PBS缓冲液：称取8.0g 氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化

钾，用990mL蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节pH至7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至1L。上述PBS缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。

5.2.2 呕吐毒素标准工作液：先用色谱级甲醇将高标稀释到5ppm，再用水将其稀释到

1ppm，此时标品的溶剂为20%甲醇，然后再用20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。

5.3 样品前处理

5.3.1 玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本

----将样品粉碎，称取25g样品，加入5g聚乙二醇，加入125mL蒸馏水；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取2.5mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：2

5.3.2 麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本

----称取10g样品，加入100mL蒸馏水；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取5mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：2

5.3.3 酒类

----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取2mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：2

5.3.4 酱油、醋、酱及酱制品

----取样品25g，用PBS缓冲液定容至100mL；

----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；

----滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；

----取2mL上样液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：2

5.4 净化

----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和(3mL的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)

----将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；

----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1～2滴/秒的速度流出；

----待液体排干后，方法5.3.1中的样品用蒸馏水或去离子水洗涤2次，每次10mL，其余样品首先用0.1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速2～3滴/秒；

----待液体排干后，上样1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脱液并在50～60℃加热条件下N2气吹干，然后用1mL流动相（20%甲醇）复溶；

----复溶液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于HPLC分析。

* 每次上样前都要将上次液体完全排干。

5.5 液相测定

5.5.1 液相色谱条件

C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；

流动相：20%甲醇

流速：1.0 mL/min；

柱温：40℃；

进样体积：50µL

紫外检测器：218nm

5.5.2 色谱定量

分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中呕吐毒素的峰面积带入标准曲线，得到试样中呕吐毒素的浓度，标准品色谱图参考下图：

数据文件名:DON-500ppb.lcd 样品名:DON-500ppb

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

13.0

14.0

min

0.00.5

1.0

1.5

2.0

mV

检测器A 218nm D O N

附图：DON-500ppb 标准品液相图谱

5.6 注意事项

----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。 ----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。 ----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。 ----柱容量：2000ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当 降低上样液的体积，重新检测。

----pH ：亲和柱的上样溶液pH 需在6～8之间，若偏离此围需要用盐酸或氢氧化钠调 节pH 。

----由于样本中呕吐毒素的含量普遍较高，如果计算后样本含量大于4mg/kg 时，表示已 经超过亲和柱柱容量，需要适当降低上样液的体积，重新检测。 ----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。 ----呕吐毒素可致癌，应戴手套操作。

----使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V ）浸泡过夜。 6、

相关文件

《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、

相关记录 N/A 8、

附件 N/A 9、

修改历史记录