人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备

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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析

人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。

由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。

必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。

常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。

是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。

外周血淋巴细胞培养与染色体制备

300ul37恒温箱65和70小时后加秋水仙素继续培养到72小时收集细胞1000转7分钟低渗预固定固定滴片染色显微镜观察离心管号1和3对照2和3对照秋水仙素ugml0513h168h168h168h低渗液ml1720min1735min1720min1720min预固定ml052min052min052min23滴2min固定ml515min515min515min310min韩齐染色体组型分析图原因分析客观1有一管血液放置时间过长大概有一个小时2操作时不小心引入杂菌使加进口pha的管被污染了3其它管pha量加入过多使细胞在培养时凝集长得不好4收集细胞时离心转数太低时间太短1000转7min使细胞大量丢失5在细胞很少的情况下固定次数太多使细胞进一步丢失主观1对方案没有嚼烂不能及时想出补救措施2没有最大限度的发挥团结的力量对细胞培养染色体制备等知识有了更深的把握和体会团结就是力量对实验要深入了解本质遇到问题才能及时想出应对的办法对科学实验态度要严谨southwestuniversity
离心管号
秋水仙素
ug/ml
1（和3对照） 2（和3对照） 3
0.5(1-3h) 1(6-8h) 1(6-8h)
4（书）
1(6-8h)
低渗液ml 预固定ml 固定ml
1+7(20min) 1+7(35min) 1+7(20min) 1+7(20min) 0.5（2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 0.5(2min) 5(15min) 2-3滴(2min) 3(10min)
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
绝对长度/mm 相对长度短臂/mm 长臂/mm 臂比着丝粒指数随体 24.0 0.0778 12.0 12.0 1.0000 0.5000 22.0 0.0713 6.0 16.0 2.6667 0.2727 20.0 0.0648 9.5 10.5 1.1053 0.4750 19.0 0.0616 7.0 12.0 1.7143 0.3684 16.5 0.0535 6.0 10.5 1.7500 0.3636 16.0 0.0519 4.5 11.5 2.5556 0.2813 16.0 0.0519 6.0 10.0 1.6667 0.3750 14.5 0.0470 4.5 10.0 2.2222 0.3103 13.5 0.0438 5.0 8.5 1.7000 0.3704 13.5 0.0438 4.0 9.5 2.3750 0.2963 12.5 0.0405 4.0 8.5 2.1250 0.3200 12.5 0.0405 5.0 7.5 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 4.0 6.0 1.5000 0.4000 10.0 0.0324 5.0 5.0 1.0000 0.5000 9.0 0.0292 0.0 9.0 #DIV/0! 0.0000 9.0 0.0292 2.5 6.5 2.6000 0.2778 8.5 0.0276 3.5 5.0 1.4286 0.4118 8.0 0.0259 2.0 6.0 3.0000 0.2500 8.0 0.0259 3.5 4.5 1.2857 0.4375 7.0 0.0227 3.0 4.0 1.3333 0.4286 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333 6.0 0.0194 0.0 6.0 #DIV/0! 0.0000 27.0 0.0875 11.0 16.0 1.4545 0.4074 6.0 0.0194 2.0 4.0 2.0000 0.3333

外周血细胞染色体培养操作

外周血细胞染色体培养操作实验六人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验目的1、了解人体外周血淋巴细胞短期培养的原理及方法。

2、初步掌握人外周血淋巴染色体的制备技术。

实验用品1.设备：超净工作台（或无菌接种箱）、光学显微镜（带照相装置）、分水恒温培养箱、干燥箱、卧式离心机、冰箱、恒温水浴箱、高压蒸汽灭菌器、真空泵（或电动吸引器）、10ml刻度离心管、，10ml培养瓶（可用环磷酰胺瓶代替）、2ml注射器、吸管、滴管试管架、三角瓶、染色瓶、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷板、铝饭盒、酒精棉球、消毒用碘棉球等。

2、材料：人外周血3.试剂：rpmil 640培养基（含10~20%小牛血清）、碳酸氢钠（AR）、PHA、青霉素、链霉素、肝素、5%NaHCO 3溶液、1mol/lhcl、三重蒸馏水或二重蒸馏水、0.075mol/lkcl、甲醇、冰醋酸、吉姆萨储备液、pH 6 8磷酸盐缓冲液。

实验原理根据测量，健康成年人的淋巴细胞总数约为500×109，其中约2%在外周血中循环。

外周血淋巴细胞主要为小淋巴细胞（每毫升血液中的淋巴细胞含量可达1~3）×106）。

在正常情况下，它们处于间期的G0或G1期，因此很难看到分裂的淋巴细胞。

然而，Nowell （1960）发现，植物血凝素（PHA），一种从芸豆（菜豆）中提取的能够凝集红细胞的物质，可以刺激淋巴细胞有丝分裂。

在PHA的作用下，G0期淋巴细胞可转化为淋巴细胞，重新进入增殖周期进行有丝分裂。

体外培养约72小时后，大多数淋巴细胞处于第二个增殖周期。

此时，用有丝分裂阻断剂秋水仙碱治疗细胞，可以停止中间阶段的细胞分裂，然后进行低渗固定，其他治疗可以获得更多的中期染色体用于分析。

以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本具有取材方便，用血量少（0.3～1.0ml即可），培养简单等优点，故该方法在临床上已得到广泛的应用。

内容和方法一、器材的清洗1.清洁培养瓶；将培养瓶在肥皂水中煮沸30分钟，趁热刷洗，然后用自来水冲洗肥皂。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告

人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。

说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。

这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。

毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。

乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。

血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。

简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。

你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。

先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。

想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。

咱们要讲到“染色体标本制备”了。

这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。

你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。

所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。

为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。

你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。

在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。

人类外周血染色体标本制备

14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）
四、试剂和药品 1、培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度链霉素终浓度
10、再固定：加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定 20分钟。
11、再离心
1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。
12、再固定加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定 20分钟。
13、制片
固定后， 1000rpm离心10分钟，留下 0.2ml 沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dir drying）。
5、甲醇（ methanol ）
6、冰醋酸（acetic glacid）
二者以不同比例配合使用
新鲜配制
７、吉姆沙染液（Giemsa）
吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液＋ 9份磷酸缓冲液
８、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。

人外周血淋巴细胞培养及染色体观察

37 ℃低渗处理20min后，发到同学手中
低速离心机使用图解
离心机顶盖
转速旋钮电源指示灯电源开关
转速显示
时间旋钮
对称放置离心管后方可启动离心机！！！
离心后倒去上清
7、固定：固定液成分为甲醇:冰醋酸=3:1 。每只离心管中，加入固定液2ml（2只离心管共需4ml），立即用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15min后，准备：在接种罩内，用移液器将培养液分装入 10ml培养瓶中，每瓶量为： – 1640培养液4ml – 小牛血清1ml – PHA 0.2ml – 肝素 0.05ml – 双抗(青霉素和链霉素)：终浓度为100U/ml – pH：7.2‾7.4用3.5%碳酸氢钠调节
实验用药品
细菌过滤器
光源亮度调节手轮
实验全程录像
染色体G带核型图
染色体核型图
优秀实验报告展示一
优秀实验报告展示二
Motic B1 目镜瞳距调节拉板物镜转换器物镜载物台聚光镜焦距粗\微调螺旋集光镜视度调节圈
Motic B1 目镜瞳距调节拉板物镜转换器物镜载物台聚光镜载物台左右推进螺旋集光镜焦距粗\微调螺旋视度调节圈
10倍镜下镜检
玻片夹
使用油镜前，在玻片上滴加香柏油
油镜使用结束，用擦镜纸蘸洗镜液
擦洗油镜头
10倍镜下观察到的染色体分裂相
40倍镜下观察到的染色体分裂相
数码显微镜100X染色体观察一
数码显微镜100X染色体观察二
数码显微镜100X染色体观察三
五、实验结果
1．核型分析：绘制自己观察到的染色体图谱，并注明分组编号（A,B和G组）注明材料编号，并确定男女。 2，完成实验报告，当场打分。

人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备

人体外周血淋巴细胞培养与染色体制备[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 6学时一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

2、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

向标本。

三、仪器设备显微镜，离心机，水浴箱，温箱，锥形离心管，毛细滴管，量简，烧杯，培养瓶，冷湿载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，定时钟，天平。

四、相关知识点（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。

由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。

2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。

2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。

为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。

3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。

4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。

人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理

实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。

在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。

这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。

人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。

血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。

在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。

这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。

这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。

1912年，Warfter 最先研究人类染色体。

1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。

细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。

技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。

如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。

（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。

（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。

1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。

1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。

1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。

实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。

磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。

外周血淋巴细胞培养与染色体制备

01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求，选择合适的提交方式，如纸质版或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与讨论，对实验结果进行深入探讨和改进。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
04 外周血淋巴细胞培养注意事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基，如RPMI-1640或DMEM培养基。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状态良好时，可以收获用于后续实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、抗生素等添加剂，以促进细胞生长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情况，记录细胞密度、形态等指标。
定期进行微生物检测，确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)

人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。

二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。

组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。

这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。

染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。

根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。

对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。

外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备

乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
•
1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
•
•
完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备,染色体组型分析
实验目的
•
1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
•
实验原理
•
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
•
9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高倍油镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
• •
1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、载玻片，常规清洗烘干，培养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理，天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品完全培养基凝血素(PHA ) 5mg/ml

实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备

实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。

(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。

【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。

在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。

但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。

因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。

【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。

2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。

【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。

2、培养至68 -70h。

然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。

3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。

(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。

中途混匀一次。

(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。

人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备

人类染色体标本的制作
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加入 BrdU
68 hrs 时加入秋水仙素
人类外周血
植物血球凝集素 ( PHA）肝素、培养基、小牛血清
体外培养
72 hrs 后收集细胞
制作玻片标本
固定
预固定紫外线照射
四、实验方法
1.外周血细胞培养
（1）采血：无菌，肝素抗凝。用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。）（2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培养箱中培养68小时。（20滴） • • （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μ g∕ml培养基，轻摇混匀后，继续培养至72小时。
人类外周血体外培养收集细胞制作玻片标本固定预固定低渗处理植物血球凝集素pha肝素培养基小牛血清72hrs68hrs入秋水仙素24hrs入brdu紫外线照射giesma染色处理荧光染料染色染色体带的制作方法giesma染色外周血外周血中的淋巴细胞几乎都是处在中的淋巴细胞几乎都是处在gg00期或gg11期期一般情况下是一般情况下是不分裂不分裂的
外周血淋巴细胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。

人外周血淋巴细胞染色体标本制作

人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［目的与要求］ 1、掌握外周细胞培养物收获方法; 2、掌握外周血细胞染色体标本制备； 3、熟悉相关试剂的配制。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［原理］经低渗处理，细胞膨胀，然后用固定液使细胞膜蛋白变性，保持细胞处于膨胀状态；调节上述收获细胞的浓ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，制成细胞悬液，滴片，即可得到有丝分裂中期的染色体标本。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 1、离心
将培养物转入刻度离心管内，以1500r/min 离心10min，弃上清液，留下沉淀物。
2、低渗在离心管中加入预温至37℃的低渗液
（0.075 mol/L KCl）8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置入37℃水浴箱中低渗30min。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 3、预固定
低渗处理后，在离心管中加入固定液[甲醇 : 冰乙酸=3:1，新配备]2ml或至10ml刻度，混匀。以 1500r/min离心10min，弃上清液，留下约0.5ml液体盖着沉淀物，轻柔重悬细胞。
4、第1次固定预固定后，往离心管加入新鲜因定液至10ml刻度，
充分混匀细胞，在室温中固定30min。以1500r/min离心10min，弃上清液，留下沉淀。
［培养］培养72h，并每天将培养瓶振荡1~2次，在终止
培养前2h~4h，在培养物中加入秋水仙素（10mg/L） 0.2ml，混匀，继续培养到收获。
染色体标本制作准备--载玻片清洁
［载玻片清洁］
1、用过饱和洗衣粉溶液浸泡载玻片1h以上； 2、用自来水彻底冲洗干净载玻片上的洗衣粉成分； 3、将干净的载玻片置于长方形浅缸，蒸馏水冲洗3 次后，用蒸馏水浸泡置于冰箱冷冻待用。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案复习过程

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。

初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA （植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。

通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。

在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。

G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。

医院细胞遗传室人淋巴细胞培养及染色体制备作业指导书

医院细胞遗传室人淋巴细胞培养及染色体制备作业指导书1目的规范外周血标本细胞培养及染色体制备过程，为临床外周血淋巴细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。

2测试方法密闭式培养/手工收获3测试原理外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。

当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。

经过短期培养后，用秋水仙素处理就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察与分析。

4性能特征经G显带处理后可见300-550条显带。

5.样本特征及受检者准备外周血用5ml灭菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml）0.05 ml湿润管壁。

消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml，立即送检。

6试剂人体外周血淋巴细胞培养基（必须具备三证），秋水仙素：浓度20μg/ml低渗液：0.075mol/L的KCl溶液，卡诺固定液7试剂与耗材超净工作台、待检标本、酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。

8操作程序8.1淋巴细胞培养与处理8.1.1取血：外周血用5ml灭菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml）0.05 ml湿润管壁。

消毒皮肤，于肘静脉采血约5ml。

在酒精灯火焰旁，向培养瓶内人体外周血淋巴细胞培养基中接种，外周血每瓶0.3-0.5ml（用5ml的注射器的7号黑色针头垂直滴加；男：G带：1线28滴，2线30滴；女性多种2滴）。

接种后轻轻水平摇动几次混匀。

8.1.2细胞培养：直立于培养箱内密闭式培养箱培养66-72小时。

外周血淋巴细胞培养环境的温度为37ºC±0.5ºC，且一定要以温箱内部温度为准，每隔24小时左右轻摇1次，以促进细胞生长增殖；8.1.3秋水仙素处理：培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙素0.01-0.02ml（用1ml注射器针头垂直滴加2~3滴），使最终浓度为0.04-0.08μg/ml，37ºC±0.5ºC 培养箱中处理4小时；8.1.4低渗处理：秋水仙素处理完毕后，小心地从温箱取出培养瓶，用吸管吸取培养物入离心管，离心（1500rpm,10min）。

人的外周血淋巴细胞培养

A. Na2HPO4· 12H20 28.8g KH2PO4(无水) 2.67g 溶解于1000ml双蒸水中。
B. Na2HPO4· 7H20 2.164g NaH2PO4· 2H20 0.3g 分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养
液和其它各试剂分装入培养瓶，每瓶量为：培养液(RPMIl640或M199) 4ml 小牛血清 lml PHA 0.2ml 肝素 0.05ml 双抗(青霉素加链霉素)培养液中最终浓度各为: 100U／ml 用 3.5 ％ NaHCO3 调 pH 到 7.2—7.4 ，分装到 20ml 的玻瓶中，用橡皮塞塞紧，待用或置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
三、实验材料：
(5)抗菌素青霉素( 以每瓶40万U为例 ): 以4ML生理盐水 (或培养基) 稀释，则每 ML 含 10 万 U 。取 1ml 加入 100ml 培养基中，则最终浓度为100U／ml。链霉素 ( 以每瓶 50 万 U 为例 ) ：以 2ml 生理盐水 ( 或培养基 ) 稀释，则每 ml 含 25 万 U 。取 0.4ml( 含 10U) 加入 1000ml 培养基中，则每 ml 含 100U( 即 100μg) 。 (100 万 U=lg ， lg=1×106μg)。
人的外周血淋巴细胞培养
一、实验目的：
二、实验原理：
三、实验材料：四、操作步骤：五、结果分析：
六、参考文献：
一、实验目的：
掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。
二、实验原理：
外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期 ( 或 Go 期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。