发光免疫技术.ppt
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化学发光免疫分析技术【检验科】--ppt课件
是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，化学发光
免疫分析技术具有高度的准确性和特异性，成为检验方法 中最为重要的技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病 诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病 、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等方面 的体外诊断实验中。
化学发光免疫分析的优势
• 灵敏度高
• 参考范围： FT3：2.3—4.0pg/mL FT4：0.6—1.2ng/dL
• 临床意义：
血清FT3和FT4升高：⑴甲亢；⑵低T3综合征，由于5’脱碘酶受抑制，T4外 周脱碘作用障碍使FT4升高；⑶甲状腺素不敏感综合征， FT3和FT4升 高，而无甲亢表现；⑷某些药物，胺碘酮、肝素等可使FT4升高；FT3 适合于甲亢和左旋甲状腺素治疗中药物是否过量的判断。
电化学发光免疫分析示意图
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
目前我院最新引进的迈瑞CL-2000i 全自动化学发光免疫分析系统 主要以化学发光酶免疫分析为主。拥有国内完全自主知识产权，它的 酶促化学发光是目前免疫诊断中最灵敏的化学发光体系之一，其核心 性能达到了国际同类产品先进水平。
• 化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清内待测物质从而 对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清 和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不 透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结 合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的 游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液 ，利用化 学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能 量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通 过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔 的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学 模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊 断。
化学发光介绍-PPT
26
肿瘤标志物
组织多肽抗原（TPA） 临床意义：主要见于恶性肿瘤；也可见于急性肝炎、胰腺炎、肝 炎等，但增高程度较轻。 前列腺特异性抗原（PSA） 临床意义：主要见于前列腺癌，是前列腺癌首选和最有应用价值 的肿瘤标志物。前列腺增生、前列腺炎、良性前列腺瘤、肾脏和泌 尿生殖系统疾病时，PSA可轻度升高
乙肝五项标志物的检测 3、HBeAg和HBeAb（HBeAg作为乙肝病毒复制增殖的间接指标） HBeAg阳性：说明病毒复制活跃，传染性强，是乙肝患者具有传
染性指标。可见于急、慢性乙肝和乙肝病毒携带者，如持续阳性， 表明乙肝转为慢性迁延性肝炎 HBeAb 在急性肝炎时，此抗体阳性表明乙肝复制缓解或终止，在慢性肝 炎或肝硬化患者，此抗体阳性说明乙肝病毒DNA与肝细胞发生整 合，提示病情较长，预后不佳。
27
肿瘤标志物
游离前列腺特异抗原（F-PSA）与F-PSA/PSA比值 临床意义：F-PSA 见于前列腺增生和前列腺癌，但前列腺癌增高 程度不如前列腺增生明显。 F-PSA/PSA降低 见于前列腺癌和前列腺增生，但前列腺癌的降低 程度明显高于前列腺增生 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 临床意义：见于前列腺癌、前列腺增生，但前列腺癌增高更明显
22
肿瘤标志物
甲胎蛋白（AFP）
临床意义：常见于原发性肝炎、大多数卵巢和睾丸胚胎性肿瘤或 畸胎瘤，生殖腺外生殖细胞瘤，肝母细胞瘤，肝细胞瘤，转移性肝 癌等，也可见于婴幼儿肝炎，肝硬化、急性肝炎、重症肝炎恢复等， 但多为一过性升高，胎盘梗塞、剥离、羊水栓塞、高危妊娠、母儿 血型不合、糖尿病孕妇等血清AFP也升高。
15
感染性疾病检测
乙肝五项标志物的定量检测
4、HBcAb
阳性：表示既往感染乙肝病毒，如高抗体水平持续存在提示乙肝 病毒可能还在复制，乙肝病毒感染后，此抗体是最早出现的标志 性抗体，持续时间长，并且几乎所有患者均产生抗体，所以此抗 体是流行病学调查指标。
肿瘤标志物
组织多肽抗原（TPA） 临床意义：主要见于恶性肿瘤；也可见于急性肝炎、胰腺炎、肝 炎等，但增高程度较轻。 前列腺特异性抗原（PSA） 临床意义：主要见于前列腺癌，是前列腺癌首选和最有应用价值 的肿瘤标志物。前列腺增生、前列腺炎、良性前列腺瘤、肾脏和泌 尿生殖系统疾病时，PSA可轻度升高
乙肝五项标志物的检测 3、HBeAg和HBeAb（HBeAg作为乙肝病毒复制增殖的间接指标） HBeAg阳性：说明病毒复制活跃，传染性强，是乙肝患者具有传
染性指标。可见于急、慢性乙肝和乙肝病毒携带者，如持续阳性， 表明乙肝转为慢性迁延性肝炎 HBeAb 在急性肝炎时，此抗体阳性表明乙肝复制缓解或终止，在慢性肝 炎或肝硬化患者，此抗体阳性说明乙肝病毒DNA与肝细胞发生整 合，提示病情较长，预后不佳。
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肿瘤标志物
游离前列腺特异抗原（F-PSA）与F-PSA/PSA比值 临床意义：F-PSA 见于前列腺增生和前列腺癌，但前列腺癌增高 程度不如前列腺增生明显。 F-PSA/PSA降低 见于前列腺癌和前列腺增生，但前列腺癌的降低 程度明显高于前列腺增生 前列腺酸性磷酸酶（PAP） 临床意义：见于前列腺癌、前列腺增生，但前列腺癌增高更明显
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肿瘤标志物
甲胎蛋白（AFP）
临床意义：常见于原发性肝炎、大多数卵巢和睾丸胚胎性肿瘤或 畸胎瘤，生殖腺外生殖细胞瘤，肝母细胞瘤，肝细胞瘤，转移性肝 癌等，也可见于婴幼儿肝炎，肝硬化、急性肝炎、重症肝炎恢复等， 但多为一过性升高，胎盘梗塞、剥离、羊水栓塞、高危妊娠、母儿 血型不合、糖尿病孕妇等血清AFP也升高。
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感染性疾病检测
乙肝五项标志物的定量检测
4、HBcAb
阳性：表示既往感染乙肝病毒，如高抗体水平持续存在提示乙肝 病毒可能还在复制，乙肝病毒感染后，此抗体是最早出现的标志 性抗体，持续时间长，并且几乎所有患者均产生抗体，所以此抗 体是流行病学调查指标。
化学发光法检测传染病.ppt
1、关于灵敏度的两个概念
（1）分析灵敏度 决定因素： a.单个抗原决定族的抗原性强弱。 b.试剂盒的信号放大能力
（2）流行病学敏感度 决定因素： a.抗原片段的种类是否齐全。 b.是否含构像抗原。 c.分析灵敏度的高低。
• 2、抗原片段种类不全
C E1E2/NS1 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b
4、光信号检测，提高信噪比
信号放大代替靶标放大，减少靶标放大带来的非特异性 反应，远远大于ELISA的信噪比。
60 50 40 30 20 10
0 ELISA
CLIA
本底噪音 信号
新型丙肝化学发光试剂---降低漏检率
1、在CORE、NS3、NS4、NS5的基础上增加了E1区 ，保证抗原片段的齐全
分析敏感度
adr 0.1IU/mL adw 0.1IU/mL ay 0.2IU/mL
10 mIU/mL 1# ≥1:64 2# ≥1:128 3# ≥1:32 1# ≥1:32 2# ≥1:64 3# ≥1:64 1# ≥1:128 2# ≥1:128 3# ≥1:256
L1、L2阳性， L3阴性，L4阴性
(-/-)30/30 (+/+)30/30 (-/-)20/20 (+/+)20/20 (-/-)20/20 (+/+)10/10
精密度
8.03% 7.45% 8.03%
8.20%
10.34%
7% 10% 7.98%
试剂性能多中心临床评估（乙肝）
乙肝 HBsAg Anti-HBs hiv Anti-HBe Anti-HBc
4.50% 1.79%
AFP
批内 批间
4.91% 2.14%
（1）分析灵敏度 决定因素： a.单个抗原决定族的抗原性强弱。 b.试剂盒的信号放大能力
（2）流行病学敏感度 决定因素： a.抗原片段的种类是否齐全。 b.是否含构像抗原。 c.分析灵敏度的高低。
• 2、抗原片段种类不全
C E1E2/NS1 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b
4、光信号检测，提高信噪比
信号放大代替靶标放大，减少靶标放大带来的非特异性 反应，远远大于ELISA的信噪比。
60 50 40 30 20 10
0 ELISA
CLIA
本底噪音 信号
新型丙肝化学发光试剂---降低漏检率
1、在CORE、NS3、NS4、NS5的基础上增加了E1区 ，保证抗原片段的齐全
分析敏感度
adr 0.1IU/mL adw 0.1IU/mL ay 0.2IU/mL
10 mIU/mL 1# ≥1:64 2# ≥1:128 3# ≥1:32 1# ≥1:32 2# ≥1:64 3# ≥1:64 1# ≥1:128 2# ≥1:128 3# ≥1:256
L1、L2阳性， L3阴性，L4阴性
(-/-)30/30 (+/+)30/30 (-/-)20/20 (+/+)20/20 (-/-)20/20 (+/+)10/10
精密度
8.03% 7.45% 8.03%
8.20%
10.34%
7% 10% 7.98%
试剂性能多中心临床评估（乙肝）
乙肝 HBsAg Anti-HBs hiv Anti-HBe Anti-HBc
4.50% 1.79%
AFP
批内 批间
4.91% 2.14%
化学发光免疫分析PPT幻灯片课件
HRP
+N2 + H2O +光
8
对-羟基苯乙酸（HPA）
• HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。
1.2 HPA
H2O2 HRP
HO
CH2 COOH +荧
光
HO
CH 2 COOH
氧化二聚体
9
AMPPD
化学发光免疫技术
第一节 发光与化学发光剂 第二节 发光酶免疫测定（CLEIA） （chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA) （chemiluminescence immunoassay） 第四节 电化学发光免疫测定技术(ECLI) (electrochemiluminescence immunoassay)
一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一
步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应
发出的光在特定的仪器上进行测定。
二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术
根据免疫学反应模式分
1.双抗体夹心法和双抗原夹心法
3.固相抗原竞争法：
14
荧光酶免疫测定技术反应原理图
R R
CH 3 N
O CO O
+ CO2+ 光
12
3.电化学发光剂
• 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。
特点：①反应在电极进行； ②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌
三联毗啶钌 分子结构图
N
N
N
+N2 + H2O +光
8
对-羟基苯乙酸（HPA）
• HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。
1.2 HPA
H2O2 HRP
HO
CH2 COOH +荧
光
HO
CH 2 COOH
氧化二聚体
9
AMPPD
化学发光免疫技术
第一节 发光与化学发光剂 第二节 发光酶免疫测定（CLEIA） （chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA) （chemiluminescence immunoassay） 第四节 电化学发光免疫测定技术(ECLI) (electrochemiluminescence immunoassay)
一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一
步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应
发出的光在特定的仪器上进行测定。
二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为： 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术
根据免疫学反应模式分
1.双抗体夹心法和双抗原夹心法
3.固相抗原竞争法：
14
荧光酶免疫测定技术反应原理图
R R
CH 3 N
O CO O
+ CO2+ 光
12
3.电化学发光剂
• 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。
特点：①反应在电极进行； ②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌
三联毗啶钌 分子结构图
N
N
N
《发光免疫技术》课件
和有害物质。
PART 05
发光免疫技术的实验操作 流程
实验前的准备
实验材料
确保所有实验材料都经 过校准和验证，确保其
准确性和可靠性。
实验环境
确保实验室环境清洁、 无尘，并符合相关规定
和标准。
实验人员
实验人员应具备相关知 识和技能，熟悉实验操
作流程和注意事项。
实验设计
根据实验目的和要求， 设计合理的实验方案， 明确实验步骤和注意事
结果能够赢得客户的信任和行业的认可。
03
符合法规要求
按照相关法规和标准进行质量控制是实验室的法定义务，也是实验室取
得相关资质和开展业务的前提条件。
质量控制的方法与措施
制定严格的操作规程
根据发光免疫技术的特点和要求，制 定详细、规范的操作规程，确保检测 过程的准确性和可靠性。
定期进行仪器校准和维护
对发光免疫技术所需的仪器进行定期 校准和维护，确保仪器性能稳定、准 确可靠。
实施样品质量控制
通过采用标准品、质控品等方式对样 品进行质量控制，确保检测结果的准 确性和可靠性。
进行内部比对和外部质评
参加行业组织的外部质评或与其他实 验室进行比对，以评估本实验室发光 免疫技术的准确性和可靠性。
标准化与认证的必要性
标准化是保证检测结果准确性和可靠性的基础
通过标准化可以统一发光免疫技术的操作规程、仪器设备、试剂耗材等，从而保证检测结 果的准确性和可靠性。
局限性
成本较高
发光免疫技术所需的仪器和试 剂成本较高，可能限制其在一 些资源有限地区的普及和应用
。
交叉反应
有时发光免疫技术可能会产生 交叉反应，导致假阳性或假阴 性结果，影响检测的准确性。
PART 05
发光免疫技术的实验操作 流程
实验前的准备
实验材料
确保所有实验材料都经 过校准和验证，确保其
准确性和可靠性。
实验环境
确保实验室环境清洁、 无尘，并符合相关规定
和标准。
实验人员
实验人员应具备相关知 识和技能，熟悉实验操
作流程和注意事项。
实验设计
根据实验目的和要求， 设计合理的实验方案， 明确实验步骤和注意事
结果能够赢得客户的信任和行业的认可。
03
符合法规要求
按照相关法规和标准进行质量控制是实验室的法定义务，也是实验室取
得相关资质和开展业务的前提条件。
质量控制的方法与措施
制定严格的操作规程
根据发光免疫技术的特点和要求，制 定详细、规范的操作规程，确保检测 过程的准确性和可靠性。
定期进行仪器校准和维护
对发光免疫技术所需的仪器进行定期 校准和维护，确保仪器性能稳定、准 确可靠。
实施样品质量控制
通过采用标准品、质控品等方式对样 品进行质量控制，确保检测结果的准 确性和可靠性。
进行内部比对和外部质评
参加行业组织的外部质评或与其他实 验室进行比对，以评估本实验室发光 免疫技术的准确性和可靠性。
标准化与认证的必要性
标准化是保证检测结果准确性和可靠性的基础
通过标准化可以统一发光免疫技术的操作规程、仪器设备、试剂耗材等，从而保证检测结 果的准确性和可靠性。
局限性
成本较高
发光免疫技术所需的仪器和试 剂成本较高，可能限制其在一 些资源有限地区的普及和应用
。
交叉反应
有时发光免疫技术可能会产生 交叉反应，导致假阳性或假阴 性结果，影响检测的准确性。
《化学发光免疫技术》课件
总结词
利用酶催化反应放大信号，将化学发光物质作为底物，通过测量发光强度来检测 目标分析物。
详细描述
酶促化学发光免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与目标分析物结合后，通过酶催 化反应放大信号，使化学发光物质的生成量大大增加，再通过测量发光强度来检 测目标分析物。
电化学发光免疫分析
总结词
利用电化学反应产生激发态的化学发光物质，通过测量发光 强度来检测目标分析物。
直接化学发光免疫分析
总结词
直接利用化学发光物质作为标记物，与抗体或抗原结合，通过测量发光强度来 检测目标分析物。
详细描述
直接化学发光免疫分析中，化学发光物质直接与抗体或抗原结合，形成复合物 ，当激发时，产生光子并释放出来，通过光电倍增管等设备测量发光强度，从 而确定目标分析物的浓度。
酶促化学发光免疫分析
特点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、检测速度快、可自动化等。
化学发光免疫技术的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测肿瘤标志物、激 素、病毒抗原抗体等。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留等有害物质 。
环境监测
用于检测水体中的重金属 离子、有机污染物等有害 物质。
化学发光免疫技术的发展历程
《化学发光免疫技术》 ppt课件
CATALOGUE
目 录
• 化学发光免疫技术概述 • 化学发光免疫技术的原理 • 化学发光免疫技术的分类 • 化学发光免疫技术的优缺点 • 化学发光免疫技术的应用实例
01
CATALOGUE
化学发光免疫技术概述
定义与特点
定义
化学发光免疫技术是一种利用化 学发光物质和免疫反应相结合， 对生物体内微量物质进行定性和 定量检测的技术。
利用酶催化反应放大信号，将化学发光物质作为底物，通过测量发光强度来检测 目标分析物。
详细描述
酶促化学发光免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与目标分析物结合后，通过酶催 化反应放大信号，使化学发光物质的生成量大大增加，再通过测量发光强度来检 测目标分析物。
电化学发光免疫分析
总结词
利用电化学反应产生激发态的化学发光物质，通过测量发光 强度来检测目标分析物。
直接化学发光免疫分析
总结词
直接利用化学发光物质作为标记物，与抗体或抗原结合，通过测量发光强度来 检测目标分析物。
详细描述
直接化学发光免疫分析中，化学发光物质直接与抗体或抗原结合，形成复合物 ，当激发时，产生光子并释放出来，通过光电倍增管等设备测量发光强度，从 而确定目标分析物的浓度。
酶促化学发光免疫分析
特点
高灵敏度、高特异性、操作简便 、检测速度快、可自动化等。
化学发光免疫技术的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测肿瘤标志物、激 素、病毒抗原抗体等。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留等有害物质 。
环境监测
用于检测水体中的重金属 离子、有机污染物等有害 物质。
化学发光免疫技术的发展历程
《化学发光免疫技术》 ppt课件
CATALOGUE
目 录
• 化学发光免疫技术概述 • 化学发光免疫技术的原理 • 化学发光免疫技术的分类 • 化学发光免疫技术的优缺点 • 化学发光免疫技术的应用实例
01
CATALOGUE
化学发光免疫技术概述
定义与特点
定义
化学发光免疫技术是一种利用化 学发光物质和免疫反应相结合， 对生物体内微量物质进行定性和 定量检测的技术。
化学发光介绍.ppt
分析诊断试剂发光类型为辉光型。
4
化学发光免疫分析的优势
▪ 灵敏度高
▪ 灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度 可达 10-22 mol/L （ RIA 为 10 -12 mol/L ）。化学发光 免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法 无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意 义。
化学发光介绍
二零零九年元月
1
▪ 化学发光免疫分析方法简介
▪ 化学发光免疫分析
▪ （Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）
▪
是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析。它
具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无
污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分
这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。并且目前病毒性肝炎和其他
病因所致的肝病甚多，而且临床症状、体征及肝功能无特殊改变差异，故
只有依靠高灵敏度的病原学鉴别诊断。
10
▪ 1．缩短急性乙肝HBsAg 测定“窗口期” ▪ 2．如病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而化
学发光免疫分析定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时测定 出HBsAg和HBsAb。 ▪ 3. 可发现低浓度HBsAg携带者。特别是一些群体如医护工作者、病人 家属等，由于长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝， 而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，可能呈低浓度感 染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展成 乙肝或慢性携带者。
9
▪ 一、化学发光极大地提高了检测灵ห้องสมุดไป่ตู้度
▪
HBsAg是HBV感染的特异标志，HBsAg的出现就可作为乙肝的早期诊
4
化学发光免疫分析的优势
▪ 灵敏度高
▪ 灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度 可达 10-22 mol/L （ RIA 为 10 -12 mol/L ）。化学发光 免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法 无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意 义。
化学发光介绍
二零零九年元月
1
▪ 化学发光免疫分析方法简介
▪ 化学发光免疫分析
▪ （Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）
▪
是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析。它
具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无
污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分
这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。并且目前病毒性肝炎和其他
病因所致的肝病甚多，而且临床症状、体征及肝功能无特殊改变差异，故
只有依靠高灵敏度的病原学鉴别诊断。
10
▪ 1．缩短急性乙肝HBsAg 测定“窗口期” ▪ 2．如病毒发生变异后，表达量较低，常规ELISA测不出抗原，而化
学发光免疫分析定量具有极高的灵敏度，可发现并极有可能同时测定 出HBsAg和HBsAb。 ▪ 3. 可发现低浓度HBsAg携带者。特别是一些群体如医护工作者、病人 家属等，由于长期密切接触，但又非直接经血传播感染成急性乙肝， 而是长期少量感染，并刺激机体产生一定的免疫力，可能呈低浓度感 染，特别应当引起人们的足够重视，密切关注并采取措施防止发展成 乙肝或慢性携带者。
9
▪ 一、化学发光极大地提高了检测灵ห้องสมุดไป่ตู้度
▪
HBsAg是HBV感染的特异标志，HBsAg的出现就可作为乙肝的早期诊
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➢ 三丙胺（TPA）作为电子供体，参 与电极表面的氧化还原反应。
24
电化学发光免疫分析（双抗体夹心）
25
检测原理
光线通过偏振 滤光片后，形 成一个方向的 平面光称为偏 振光。
偏振光(蓝光,485nm)
荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～ 550nm)
26
检测原理
27
检测原理
28
检测原理
➢ 荧光在特定偏振面的强度与示踪物激发 时转动的速度呈反比，转动的速度与分 子量大小呈反比。
发光免疫分析技术
发光现象 ➢ 一种物质由电子
激发态回复到基 态时，释放出的 能量表现为光的 发射，称为发光 。
2
化学发光免疫技术
发光酶免疫分析 化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
3
发光酶免疫分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
酶免疫分析的发光底物
➢ 辣根过氧化物酶 ➢ 鲁米诺及其衍生物 ➢ 对-羟基苯乙酸(HPA)
➢ 碱性磷酸酶 ➢ 4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基1,2-二氧乙烷(AMPPD) ➢ 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
疫分析系统（ABS、发光增强剂） ➢ 金刚烷（AP） ➢ Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
12
（直接）化学发光免疫分析
化学发光剂
➢ 吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光
（470nm）
14
制备吖啶酯标记物 ➢ 利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗
体分子中的羧基，再与吖啶酯中的氨基 结合形成酰胺键。
➢ 三丙胺（TPA）
20
电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由 基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
21
电化学发光原理
二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
22
电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
23
标记物的制备
➢ 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学 发光分析的标记物，分子中含有N羟基琥珀酰胺（-NHS）可以抗体、 抗原分子中的氨基结合形成稳定化 合物。
15
双抗体夹心化学发光免疫分析
16
直接化学发光免疫分析 ➢ 吖啶酯发光的氧化反应简单快速： ➢ 具备较低背景，确保敏感度； ➢ 吖啶酯容易标记，稳定也保存： ➢ 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要
求较高；
17
电化学发光免疫分析
发光剂 三联吡啶钌作为发光剂
19
发光剂
➢ 三联吡啶钌
➢ 吡啶（氮杂苯） ➢ 联吡啶 ➢ N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 ➢ 三联吡啶钌活性衍生物
30
应用
➢ 血清学乙肝表面抗原，以前诊断是 否感染HBV用酶法，酶法缺陷为低 表面抗原携带者漏检，化学发光免 疫分析技术具有高灵敏度和线性范 围宽的特点，在病原学诊断方面比 酶法高。
5
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
6
HPA 激发后发射荧光
450nm
350nm
7
AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
8
4-MUP 激发后发射荧光
448nm
360nm
9
双抗体夹心化学发光酶免疫分析
10
双抗体夹心荧光酶免疫分析
11
仪器设备
➢ 直接检测
➢ 鲁米诺（HRP） ➢ VITROS Eci 全自动增强化学发光免
➢ 标记抗原在溶液中转动速度快，偏振荧 光强度大。若待测抗原浓度高，与标记 抗原竞争，抗体结合待测抗原无荧光素 标记，荧光强度减弱。
化学发光免疫分析
➢ 标记物具有较低本底，发光过程简 单；
➢ 容易进行标记物制备且稳定； ➢ 磁性微粒为固相材料，易于包被和
自动化分离； ➢ 瞬间发光，对检测仪器要求高；
24
电化学发光免疫分析（双抗体夹心）
25
检测原理
光线通过偏振 滤光片后，形 成一个方向的 平面光称为偏 振光。
偏振光(蓝光,485nm)
荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～ 550nm)
26
检测原理
27
检测原理
28
检测原理
➢ 荧光在特定偏振面的强度与示踪物激发 时转动的速度呈反比，转动的速度与分 子量大小呈反比。
发光免疫分析技术
发光现象 ➢ 一种物质由电子
激发态回复到基 态时，释放出的 能量表现为光的 发射，称为发光 。
2
化学发光免疫技术
发光酶免疫分析 化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
3
发光酶免疫分析
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
酶免疫分析的发光底物
➢ 辣根过氧化物酶 ➢ 鲁米诺及其衍生物 ➢ 对-羟基苯乙酸(HPA)
➢ 碱性磷酸酶 ➢ 4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基1,2-二氧乙烷(AMPPD) ➢ 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
疫分析系统（ABS、发光增强剂） ➢ 金刚烷（AP） ➢ Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
12
（直接）化学发光免疫分析
化学发光剂
➢ 吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光
（470nm）
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制备吖啶酯标记物 ➢ 利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗
体分子中的羧基，再与吖啶酯中的氨基 结合形成酰胺键。
➢ 三丙胺（TPA）
20
电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由 基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
21
电化学发光原理
二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
22
电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
23
标记物的制备
➢ 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学 发光分析的标记物，分子中含有N羟基琥珀酰胺（-NHS）可以抗体、 抗原分子中的氨基结合形成稳定化 合物。
15
双抗体夹心化学发光免疫分析
16
直接化学发光免疫分析 ➢ 吖啶酯发光的氧化反应简单快速： ➢ 具备较低背景，确保敏感度； ➢ 吖啶酯容易标记，稳定也保存： ➢ 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要
求较高；
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电化学发光免疫分析
发光剂 三联吡啶钌作为发光剂
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发光剂
➢ 三联吡啶钌
➢ 吡啶（氮杂苯） ➢ 联吡啶 ➢ N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 ➢ 三联吡啶钌活性衍生物
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应用
➢ 血清学乙肝表面抗原，以前诊断是 否感染HBV用酶法，酶法缺陷为低 表面抗原携带者漏检，化学发光免 疫分析技术具有高灵敏度和线性范 围宽的特点，在病原学诊断方面比 酶法高。
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鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
6
HPA 激发后发射荧光
450nm
350nm
7
AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
8
4-MUP 激发后发射荧光
448nm
360nm
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双抗体夹心化学发光酶免疫分析
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双抗体夹心荧光酶免疫分析
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仪器设备
➢ 直接检测
➢ 鲁米诺（HRP） ➢ VITROS Eci 全自动增强化学发光免
➢ 标记抗原在溶液中转动速度快，偏振荧 光强度大。若待测抗原浓度高，与标记 抗原竞争，抗体结合待测抗原无荧光素 标记，荧光强度减弱。
化学发光免疫分析
➢ 标记物具有较低本底，发光过程简 单；
➢ 容易进行标记物制备且稳定； ➢ 磁性微粒为固相材料，易于包被和
自动化分离； ➢ 瞬间发光，对检测仪器要求高；