TRI zol 总RNA 提取试剂
Trizol-法提取RNA实验步骤
Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
提取总rna的方法
提取总rna的方法
总RNA是指从细胞或组织中提取出的含有所有类型RNA的混合物。
总RNA的提取是RNA研究的重要步骤之一，可以用于分析基因表达、RNA修饰、RNA结构等。
以下是一种常用的总RNA提取方法：材料与试剂：
- 细胞或组织样本
- TRIzol试剂（Invitrogen）
- 氯仿
- 异丙醇
- 离心管
- 离心机
- 热板
步骤：
1. 将细胞或组织样本加入到离心管中，用PBS或生理盐水洗涤
一遍。
2. 加入TRIzol试剂，按照试剂和样本的比例加入。
比例一般为1mL TRIzol/1g细胞或组织。
3. 用均质器将样本均质，使细胞或组织完全破碎，并使其与TRIzol完全混合。
4. 加入氯仿，并彻底混合，使其与TRIzol完全分离。
5. 离心管离心15分钟（4℃，12000rpm），使混合液分为两层，上层为清亮的上清液，下层为混浊的有机相。
6. 将上清液转移至新的离心管中，加入相同体积的异丙醇，混匀。
7. 离心管离心10分钟（4℃，12000rpm），使RNA沉淀在管底。
8. 倒掉上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，离心管离心5分钟（4℃，7500rpm）。
9. 将乙醇洗涤RNA沉淀挥干，加入适量的RNase-free水溶解即可。
注意事项：
1. TRIzol是一种强还原剂，需避免与其他化学物质接触。
2. RNA样本处理过程中需注意RNase污染的防止，使用
RNase-free试剂和器材。
3. RNA的保存需避免RNase污染和长时间保存，最好在-80℃低温下保存。
RNA抽提指南(TRIZOL)
警告: 有毒物接触皮肤或者不慎吞服。
会导致灼伤。
一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。
若感不适，看医生并寻求苯酚和其他成分(JTSRN 80100437-5000p)的正确治疗方案。
）TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。
尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2—8°C的环境下。
一般描述：TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA 和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA 酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
RIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和0.3 kb之间(tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8预防RNA酶污染:提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
TRIzol试剂
TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIzol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。
主要成分：TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。
TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。
加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
※ 0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
乙醇能够消除核酸的水化层 使带负电荷的磷酸基团暴露出来。
Na 之类的平衡离子能够与这些带电基团结合 在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。
因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀可以利用DNA和RNA在不同浓度的氯化钠水溶液中溶解度不同进行分离，RNA 核蛋白在易于溶解在0.14mol/L氯化钠溶液中但是DNA核蛋白在此浓度中难溶，然后便可以通过离心分离将两者分开，上清液中有RNA，沉淀含DNA，这样便可以分开了并且两者都会得到较好的保留而不会分解或者变性等。
希望您能采纳，盐析法 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解而使杂质沉淀或者相反以达到分离目的 DNA 在NaCl溶液中的溶解度先增大后减小在DNA溶解度最低时 DNA从溶液中析出而其他杂质还留在溶液中达到粗提取的目的酶水解法采用RNase（可以买）水解杂质RNA如果混入DNase酶可以采用100度加热15min使其失活 RNase不会失活反之采用DNase可以提取RNA 混了RNase、时加入蛋白酶K或加碘乙酸钠。
细胞总RNA提取
细胞总RNA的提取一、准备1、物品：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、75%灭酶异醇、冷PBS、1.5ml 灭酶EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管2、打开冷冻离心机4℃预冷二、操作步骤：将Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管等物品带入细胞室。
1、取出EP管、做好标记2、取出细胞、收集上清保存备用3、用冷PBS冲洗细胞两次4、加入1ml Trizol （24孔板每孔加0.5ml即可），调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清（生化：摇动混匀后室温孵育10min）5、将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，用黄枪头加入氯仿0.2ml（1/5 Trizol 体积），用手剧烈震摇15秒，置室温5min（生化：3min dxyer：15min），分层6、4℃、12000g（12300rcf）离心15min，可见分层。
7、用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中（确保不要吸入中间层和有机相）。
8、各管分别加入0.5ml异丙醇（等体积），用力摇匀，置室温10min。
（提前将异丙醇4℃预冷，或混匀后置-20℃ 60min，提取效果更好）9、4℃、12000g离心10min，可见RNA沉淀。
10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1ml，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起洗涤。
11、4℃、7500g（7700rcf）离心5min，生化为10min，（亦有dxyer用12000g），沉淀即为总RNA。
12、弃上清，真空干燥约4min或空气中干燥5~10min，加入20祃（30祃）DEPC 水。
13、 56℃水浴小于10min助溶，取少量测OD值，其余-70℃保存备用。
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Trizol法提取总RNA Protocol
Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。
然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。
最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。
所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。
2.氯仿：用于抽提RNA。
3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。
4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。
6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。
实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。
2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。
3.移液器：用于吸取试剂和样品。
4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。
5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。
准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。
2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。
3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。
实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。
2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。
3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。
4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。
5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。
注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA
TRIzol法提取真核细胞和动物组织总RNA简介TRIzol是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA试剂，可以从动物组织，真核细胞等中提取总RNA。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA。
加入氯仿离心后，溶液会形成上清层，中间层和有机层，RNA 分布在上清层中，收集上清层经异丙醇沉淀后便可以回收得到总RNA。
材料（1）试剂：RIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水、PBS 缓冲液等。
（2）器材：RNase Free EP管、冷冻离心机、组织匀浆器等。
实验步骤1、样品处理（1）细胞：收集细胞沉淀，加入1ml TRIzol吹打混匀。
（2）组织样品：取一小块样品于1.5ml离心管中，剪碎，加入TRIzol后匀浆器匀浆。
2、抽提RNA（1）室温孵育5min，加入200ul氯仿/1ml TRIzol，震荡混匀，室温静置3min。
（2）（提前预冷离心机）4°C ，12000×g离心15 min，离心后液体分为三层，小心吸取上层水相至新的EP管。
RNA在上层水相，中间层为DNA，下层为蛋白质。
吸上清时，不可吸到中间层，宁可少吸也不能多吸。
（3）加入500ul异丙醇/1ml TRIzol，上下颠倒混匀，冰上孵育10min。
（4）4°C ，12000×g离心10 min，弃上清。
（5）加入1ml 75%乙醇轻柔洗涤沉淀，短暂涡旋使沉淀漂起。
（6）4°C ，7500×g离心5 min，吸弃上清，静置干燥沉淀。
沉淀不能过干或过湿，待沉淀会变为半透明色即可。
（7）视沉淀量加入适量DEPC水溶解，轻轻吹打，-80°C长期保存。
3、总RNA 纯度、浓度和完整性检测（1）One Drop检测RNA纯度和浓度：纯净RNA的A260/A280的比值为2.0，小于1.9说明存在有机物污染，大于2.1则说明RNA发生了降解。
trizo提取RNA
Trizol (总RNA抽提试剂)产品编号产品名称包装 R0016Trizol (总RNA抽提试剂)100ml产品简介：¾碧云天生产的Trizol是一种用于细胞或组织总RNA抽提的试剂。
本产品采用和Invitrogen 公司的TRIzol完全相似的原理和方法，抽提的方法和步骤完全相同。
¾ Trizol的颜色和TRIzol相同，加入氯仿后上层呈无色，下层呈紫红色，便于吸取上层水相。
¾ Trizol对动植物细胞或组织及细菌的总RNA抽提均适用。
¾ Trizol可以抽提长达15 kb的RNA，也可以抽提microRNA等小RNA。
抽提小RNA时宜-70℃沉淀过夜。
¾ Trizol抽提所得RNA无DNA和蛋白污染。
一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.8-2.0。
¾裂解细胞或和组织共匀浆时，Trizol可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解。
¾每一百万细胞用Trizol抽提可得5-15µg RNA；每毫克组织用Trizol抽提可得1-10µg RNA。
产量因细胞和组织不同而异。
¾抽提两个样品约需一小时。
¾ Trizol抽提所得RNA可直接用于Northern，点杂交，纯化mRNA，体外翻译，RNase protection assay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序(deep sequencing)等对RNA质量要求较高的情况。
¾碧云天生产的Beyozol(R0011)和Trizol(R0016)的成分有细微差别，实际抽提效果无任何显著差异。
¾每100ml Trizol可以抽提100个六孔板中的样品或100个50-80mg的组织样品。
包装清单：产品编号产品名称包装R0016 Trizol 100ml —说明书 1份保存条件：4℃保存，一年有效。
trizol法提取rna实验报告
trizol法提取rna实验报告trizol 法提取 RNA 实验报告一、实验目的RNA 提取是分子生物学实验中的一项关键技术，本次实验旨在使用 trizol 法从细胞或组织样本中提取高质量的 RNA，为后续的基因表达分析、反转录 PCR（RTPCR）、Northern 印迹等实验提供纯净的RNA 样本。
二、实验原理Trizol 试剂是一种用于提取细胞或组织总 RNA 的常用试剂。
其主要原理基于以下几个步骤：1、裂解细胞：Trizol 中的苯酚和异硫氰酸胍能够迅速裂解细胞，使细胞内的蛋白质、核酸等成分释放出来。
2、抑制 RNA 酶活性：异硫氰酸胍能够有效地抑制细胞内源性和外源性 RNA 酶的活性，防止 RNA 的降解。
3、分离 RNA：加入氯仿后，通过离心将细胞裂解液分为三相：上层为无色的水相，主要包含 RNA；中间层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相，主要包含 DNA 和蛋白质。
4、沉淀 RNA：吸取上层水相，加入异丙醇沉淀 RNA。
5、洗涤 RNA：用 75%乙醇洗涤沉淀的 RNA，去除杂质。
三、实验材料与试剂1、材料培养的细胞系（如HeLa 细胞）或新鲜组织样本（如小鼠肝脏组织）2、试剂Trizol 试剂（Invitrogen 公司）氯仿（分析纯）异丙醇（分析纯）75%乙醇（用无水乙醇和 DEPC 处理水配制）DEPC 处理水（用于配制 75%乙醇和溶解 RNA）无 RNA 酶的离心管、移液器吸头3、仪器设备台式离心机移液器涡旋振荡器恒温水浴锅核酸蛋白测定仪（Nanodrop）四、实验步骤1、样本处理细胞样本：将培养的细胞收集到离心管中，离心弃去培养基，用PBS 洗涤细胞两次，离心弃去 PBS。
组织样本：将新鲜组织切成小块，放入液氮中速冻，然后转移至研钵中，加入适量 Trizol 试剂，迅速研磨成匀浆。
2、加入 Trizol 试剂对于细胞样本，按照每 1×10^6 个细胞加入 1 mL Trizol 试剂的比例加入 Trizol，反复吹打使细胞充分裂解。
Trizol提取总RNA-LiCL
鼠疫菌大片段RNA提取方案（LiCL沉淀）【器材准备】（一）试验器材准备1.DEPC处理的水:(DMDC) 0.1%将1ml DEPC加入1L去离子水中，剧烈混匀，37℃过夜后，高压灭菌15-20min.2.0.5×TBE(DEPC处理的水配制):3.玻璃器皿准备玻璃器皿处理：在150℃-200℃烘烤4-6h，可去除RNA酶污染。
4.塑料器材处理：将塑料管、EP管等置于0.5M N aOH浸泡10min,再用灭菌双蒸水彻底冲洗后，高压灭菌。
（二）试剂准备1.3M醋酸钠（分子量82.03，pH5.2 ）用70ml DEPC处理的水溶解24.6g无水醋酸钠，用冰醋酸调pH5.2，用DEPC处理的水定容至100 ml，再高压灭菌。
2.75%乙醇(DEPC处理的水配制)：配制200ml。
方法：取无水乙醇150ml,加入用DEPC处理的水50 ml，即得75%乙醇（DEPC处理）3.5M LiCl（分子量42.39，5M LiCl、20 mM Tris-HCl, pH 7.4, and 10 mM EDTA）方法：取21.2g的LiCl溶于70ml DEPC处理的水，0.2423g Tris, 0.2923 g EDTA,调pH7.4，定容至100ml，高压灭菌。
4. 5×TBE（500ml）Tris （分子量121.14 ,890mM）. 54g硼酸（分子量61.83 ,890mM）. 27.5gEDTA (分子量292.25,20 mM pH 8.0) 2.92 g向烧杯中加无菌去离子水400ml溶解以上成分，调pH 8.0定容到500ml。
用时稀释10倍使用。
【实验步骤】1.细菌培养鼠疫菌122接种至4ml TMH培养基（含100μM FeSO4）中，26 °C培养至OD620nm=0.8-1.0。
培养物20倍分别稀释到2只4ml新鲜TMH培养基（含100μM FeSO4）中，26 °C培养至OD620nm=1.0，收集提取菌体总RNA。
TRIzol RNA提取方法及步骤
TRIzol法RNA提取的具体步骤及方法（一）试剂准备1．TRIzol试剂。
2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC H2O配制）5．DEPC H2O（二）操作步骤1．样品处理：（1）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。
4℃，7500g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二、总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似。
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。
因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml 的单链RNA。
如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。
若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
TRIzol试剂法提取总RNA
TRIzol试剂法提取总RNA一、实验目的1.掌握RT-PCR的基本原理和操作步骤；2.了解RT-PCR技术在基因克隆疾病诊断方面的应用。
二、实验原理RT-PCR是将RNA的反转录（reverse transcription，RT）和cDNA的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）相结合的技术，是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。
RT是在反转录酶的作用下，以总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程。
以mRNA为模板，经逆转录合成与mRNA碱基序列互补的DNA链。
此法称为cDNA 法。
PCR技术是模拟DNA的天然复制过程，在体外扩增目的基因的技术，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由“变性→退火→延伸”三个基本反应步骤构成：DNA模板变性：95℃左右高温变性单链DNA模板与引物退火：引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性引物的延伸一个PCR循环即“变性—退火—延伸”经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数n个循环后，5 '端是特定的人工合成的引物，3 '端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n。
二、仪器与试剂1.PrimescritП 1st cDNA合成试剂盒2.PCR反应试剂3.上游引物和下游引物4.无菌H2O5.DNAMARKET6.琼脂糖7.50*TAE缓冲液8.SRBR Green1 缓冲液9.6*载样缓冲液三、实验步骤1．防止RNase污染的准备2．样品处理处死小鼠，取半只肝脏，用生理盐水洗去血迹，加入5mL TRIzol，充分匀浆。
3．每组取1mL匀浆液加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3min。
4．4℃ 12 000rpm离心10min，转移水相至新的无RNase离心管中。
4．加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，室温静置5min。
5．4℃ 12 000rpm离心5min，弃上清。
trizol法提取rna实验报告
trizol法提取rna实验报告trizol 法提取 RNA 实验报告一、实验目的RNA 的提取是分子生物学实验中的一项基本技术，本实验旨在使用 trizol 法从细胞或组织样本中提取高质量的 RNA，为后续的分子生物学实验如 RTPCR、Northern blotting 等提供纯净的 RNA 样品。
二、实验原理Trizol 试剂是一种基于异硫氰酸胍和酚的单相溶液，能够有效地裂解细胞，同时抑制 RNA 酶的活性，使 RNA 从细胞中释放出来。
在加入氯仿后，溶液会分为水相和有机相，RNA 存在于水相中。
通过异丙醇沉淀和乙醇洗涤，可以得到纯净的 RNA 沉淀。
三、实验材料与试剂（一）材料1、培养的细胞系（如 HeLa 细胞）或新鲜组织样本（如小鼠肝脏组织）2、无 RNA 酶的离心管、移液器吸头、微量移液器（二）试剂1、 Trizol 试剂（Invitrogen 公司）2、氯仿3、异丙醇4、 75%乙醇（用无 RNA 酶的水配制）5、无 RNA 酶的水四、实验仪器1、台式高速离心机2、恒温水浴锅3、移液器4、涡旋振荡器5、超净工作台五、实验步骤（一）细胞或组织样本的收集与处理1、细胞收集：对于贴壁细胞，倒掉培养液，用 PBS 冲洗细胞两次，加入适量的胰酶消化细胞，待细胞变圆脱壁后，加入含血清的培养基终止消化，将细胞悬液转移至无RNA 酶的离心管中，离心（1000 rpm，5 min）收集细胞。
对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。
2、组织处理：将新鲜组织剪成小块，放入预冷的匀浆器中，加入适量的 Trizol 试剂，在冰上匀浆至组织完全破碎。
（二）细胞或组织的裂解1、向收集的细胞或匀浆后的组织中加入 1 ml Trizol 试剂（每 10^6个细胞或 100 mg 组织），用移液器反复吹打，使细胞或组织充分裂解，室温放置 5 min。
（三）相分离1、向裂解液中加入 02 ml 氯仿，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法提取RNA实验步骤及原理RNA（核糖核酸）在基因表达、调控等生命活动中起着至关重要的作用。
Trizol 法是一种广泛应用于提取细胞或组织中总 RNA 的方法，其具有高效、稳定、适用性广等优点。
下面将详细介绍 Trizol 法提取RNA 的实验步骤及原理。
一、实验原理Trizol 试剂主要成分包括苯酚、异硫氰酸胍等。
异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，抑制细胞内源性核糖核酸酶（RNase）的活性，从而保持RNA 的完整性。
苯酚则能促使蛋白变性，并使核酸从蛋白中分离出来。
在酸性条件下，RNA 分子会溶于水相，而 DNA 和蛋白质则留在有机相。
通过后续的离心、沉淀等操作，可获得纯净的 RNA 样品。
二、实验材料与设备1、材料细胞或组织样本Trizol 试剂氯仿异丙醇75%乙醇（用无 RNase 的水配制）无 RNase 的水或 DEPC 处理水2、设备冷冻离心机移液器及枪头（均为无 RNase）涡旋振荡器恒温水浴锅冰盒三、实验步骤1、样本处理细胞样本：将培养的细胞收集到离心管中，离心弃去培养液。
组织样本：将新鲜组织在液氮中迅速研磨成粉末，然后加入适量Trizol 试剂。
2、加入 Trizol 试剂对于细胞样本，根据细胞数量加入适量的 Trizol 试剂，通常每10^6 10^7 个细胞加入 1 ml Trizol 试剂。
对于组织样本，每 50 100 mg 组织加入 1 ml Trizol 试剂。
3、匀浆用移液器反复吹打细胞悬液，使其充分裂解。
对于组织样本，继续研磨或用匀浆器匀浆，直至组织完全裂解。
4、室温静置将裂解液在室温下静置 5 分钟，使核酸蛋白复合物充分解离。
5、加入氯仿按每 1 ml Trizol 试剂加入 02 ml 氯仿的比例加入氯仿，盖紧盖子，剧烈振荡 15 秒，然后室温静置 2 3 分钟。
6、离心在 4℃下，12000 g 离心 15 分钟。
离心后，溶液分为三层：上层为无色的水相，含有 RNA；中间层为白色的蛋白层；下层为红色的有机相，含有 DNA 和蛋白质。
实验操作过程
总RNA的提取：总RNA提取试剂：TRI zol®LS Reagent total RNA isolation system (G IBCO BRL®)(可以使细胞破碎，释放RNA)。
方法：组织总RNA的提取。
1．剪取50-100mg组织，(用生理盐水冲洗或直接研磨)，在玻璃匀浆器中研磨后，加750µl的TRI zol®R eagent在玻璃匀浆器中快速匀浆(样品量不应超过用于匀浆的TRI zol®R eagent的10%)。
将液相转移至1.5ml eppendorf管内。
(匀浆至无颗粒均匀即可)。
2．在15-30℃(一般在室温20℃)孵育5分钟，使核酸蛋白完全降解，加入0.2ml氯仿(chloroform)，(每1ml TRI zol®R eagent加0.2ml氯仿，轻轻颠倒混匀。
置于15-30℃(一般在室温20℃)孵育2-15分钟(一般10分钟)。
3．在2-8℃(4℃为宜)小于12000g(一般11500g)离心15分钟，取上层水相于一新管中(一般水量约占所用TRI zol®R eagent量的60%)。
离心后，混合物分为红色(下层，降解液)；白色(中层，蛋白)和无色(上层，RNA液体相)。
4．每1mlTRI zol®R eagent处理样品加0.5ml异丙醇(isopropanol),混匀以沉淀RNA，先在15-30℃孵育2-15分钟(一般为10分钟)，通常置-20℃过夜，以使RNA充分沉淀，在2-8℃(4℃)11500g离心10分钟。
5．弃上清，用75%乙醇(用DEPC处理过的水配制，存放于4℃，用前放入-20℃备用)洗RNA沉淀一次或两次(第一次洗时直接倒掉，第二次洗时用枪尖轻轻吹打RNA沉淀)，每1mlTRI zol®R eagent处理样品加至少1ml75%乙醇轻轻吹打混匀，在2-8℃小于7500g(7400g)离心5分钟，以混匀样品，再以11500g离心10分钟，弃上清。
Trizol试剂
Trizol Reagent/总RNA提取试剂发布日期：[2007-7-13] 共阅[7177]次Trizol Reagent/总RNA提取试剂说明书产品简介TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。
加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。
TRIzol试剂可用于小量样品（50－100mg组织、5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107个细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的稳定性。
保存条件2-8℃避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。
操作步骤1. 匀浆处理（Homogenization）组织中提取总RNA1) 植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1ml TRIzol。
2) 动物组织：按10-30mg组织加入1ml TRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。
培养细胞中提取总RNA1) 贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1ml TRIzol。
2) 悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1ml TRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。
血液中提取总RNA直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。
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2) 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS 洗涤细胞，吸除PBS，向细 胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有 血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free 的离心管中，300×g 离 心5 分钟，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。 注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA 的 产量降低。 d. 细胞悬液：离心取细胞。每5×106－107 动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞 加入1 ml ZOzol。加入ZOzol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞 可能需要匀浆仪处理。 e. 血液处理：直接取新鲜的血液，加入3 倍体积ZOzol（推荐0.25ml 全血加入0.75ml ZOzol），充分振荡混匀。 2. 将匀浆样品在15－30℃放置5 分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 离心10 分钟，取上清。 注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。 离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪 组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。 4. 每使用1 ml Z0zol 加入0.2 ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 秒，室温放置3分钟。 注意：如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2 分钟代替。 5. 4℃ 12,000 rpm(~13,400×g)离心10-15 分钟，样品会分成三层：黄色的有机相，中 间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约600 μl）转移到新的离心管 中。（如要分离DNA 和蛋白质，可向天根公司索取提取方法）。 6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 分钟。 7. 4℃ 12,000 rpm(~13,400×g)离心10 分钟，去上清。离心前RNA 沉淀经常是看不见 的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 8. 加入1 ml 75%乙醇（DEPC 处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1 ml NOzol至少用 1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。 9. 4℃ 5,000 rpm(~2,300×g)离心3 分钟。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量 液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。 10. 室温放置晾干（不要晾的过干，RNA 完全干燥后会很难溶解，大约晾干2－3分钟 左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-free ddH2O，反复吹打、混匀， 充分溶解RNA。
注意事项：
匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃ 放置一个月以上； RNA 沉淀可以保存在75%酒精中，2－8℃一个星期以上或-20℃一年以上。
预防RNase 污染，应注意以下几方面：
1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。 2. 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。 3. RNA 在ZOzol 试剂中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使
5. 水相中混有有机相。
6. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。
RNA 降解 1. 组织取出后没有马上处理或冷冻。
2. 样品或提取的 RNA 沉淀保存于-5– -20℃，未在-60– -70℃
保存。
3. 细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
4. 溶液或离心管未经 RNase 去除处理。
DNA 污染 1. 样品匀浆时加的试剂体积太少。
用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 小时，塑料器 皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。 4. 配制溶液应使用RNase-free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC至终浓度0.1%( v/v)，放置过夜，高压灭菌）。
电话：010-8270 8399 网址： 邮箱：tech@
不同组织或细胞RNA 提取预期得率
物叶片
100–200ug/g 叶片
动物组织
6-10 肝脏组织
动植物培养细胞
5–10 细胞
大肠杆菌
2–10 DH5α 过夜菌
血液
3–5 人全血
问题指南
RNA 提取操作步骤：
准备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-free ddH2O、75%乙醇（用RNase-free ddH2O 配制）。 1. 匀浆处理
a. 植物组织：以叶片RNA 提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶 片剪碎后直接在ZOzol中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 分钟。大约100 mg 叶 片使用1 ml ZOzol。
2. 样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO 等），强缓冲液或
碱性溶液。
蛋白 和多糖 1. 样品中蛋白、多糖含量高。
污染
2. 样品量太大。
3. 水相中混有有机相。
本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
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ZOzol 总 RNA 提取试剂 目录号：ZP401
产品简介：
本产品 ZOzol 是可即用的从细胞和组织中提取总 RNA 的试剂，在样品裂解 或匀浆过程中，可保持 RNA 完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。 加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相，用异丙醇 可沉淀回收 RNA；中间层用乙醇沉淀可回收 DNA；有机相用异丙醇沉淀可回收蛋 白。
1) 直接裂解法： 直接在培养板中加入ZOzol 裂解细胞，每10 cm2 面积加 入1 ml ZOzol。用取样器吹打几次。注意：ZOzol 加量根据培养板面积决定，不 是由细胞数决定。如果ZOzol 加量不足，可能导致提取的RNA 中有DNA 污染。
电话：010-8270 8399 网址： 邮箱：
产品特点：
本公司生产的 ZOzol 为黄颜色，便于区分水相和有机相，方便使用。
保存条件： 2–8℃ 避光保存9–12 个月
警告：本试剂有腐蚀性，请勿直接接触皮肤或吞咽；操作时请穿戴实验服、防护 镜和手套；如果接触皮肤，应立即用洗涤剂和大量水冲洗；易燃。
问题
解决方案
低得率
1. 样品裂解或匀浆处理不彻底。
2. 最后得到的 RNA 沉淀未完全溶解。
A260/
1. 检测吸光度时，RNA 样品不是溶于 TE，而是溶于水。
A280<1.65 2. 低离子浓度和低 pH 条件下，A280 值会较高。
3. 样品匀浆时加的试剂量太少。
4. 匀浆后样品未在室温放置 5 分钟。
b. 动物组织：以鼠肝脏RNA 提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30－ 50mg 组织加入1 ml ZOzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过 NOzol 体积的10%。
c. 单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107）： 可直接在培养容器中裂解（容器体积不超过10cm）,或者使用胰蛋白酶处理后离心 收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。