核酸及蛋白质的生物合成

第十一章核酸及蛋白质的生物合成
1. DNA的生物合成：以亲代DNA双链为模板按碱基配对原则合成出与亲代链相同的两个DNA双链。

1）半保留复制：DNA复制时以亲代DNA两条链为模板指导合成与其互补的DNA链，在子代DNA 中，一条链来于亲代DNA，另一条链是新合成的。

Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12
①同位素实验：Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH
4
代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明DNA的半保留复制。

②意义：表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。

2）DNA复制的起点和方向：能独立复制的单位叫复制子，每个复制子都含有控制复制起始的起始点。

原核生物的染色体只有一个复制子；真核生物DNA有多个复制子。

双链DNA解开形成两条单链，分别作模板进行复制，此结构为复制叉。

大多数生物的DNA复制是双向、对称的。

3）半不连续复制：DNA复制时，两条链都能作为模板同时合成两条新的互补链，一条连续复制，另一条则不连续。

领头链是不间断延长的，随从链则生成一个个冈崎片段后连接成一条。

①前导链/领头链：两条链均按5’→3’方向合成，一条链3’末端的方向朝复制叉前进的方向，可连续合成；②滞后链/随从链：另一条5’末端朝着复制叉前进的方向，不连续合成。

4）DNA复制的酶系四种脱氧三磷酸核苷酸
DNA pol/DDDP催化dNTP聚合到核酸链
①5’→3’聚合活性②核酸外切酶活性
5）DNA聚合酶：原核生物DNA polⅠ——聚合作用5´→3´外切酶活性：切除引物、切除突变的片段；3’→5’外切酶活性：校对功能。

引物酶：一种特殊的RNA聚合酶；在DNA复制开始时,在5´–端(5´3´方向）合成一小段RNA引物，确定起始部位、引导复制开始。

※RNA聚合酶催化起点处通过碱基互补连接引物RNA链。

DNA连接酶：在有模板指导的条件下，催化2个DNA片段的连接，在一个DNA片段的3´-OH 末端和另一个DNA片段的5´-P末端形成3´，5´–磷酸二酯键，从而实现连接（两片段间的距离为1个3´，5´–磷酸二酯键的键长）。

※DNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。

解螺旋酶：能断裂互补碱基间的氢键，使DNA双链分离形成“复制叉”；具有这种功能的酶有复制蛋白(rep蛋白)、解链酶II等。

DNA拓扑异构酶：改变DNA拓扑性质；对DNA分子既能水解、又能连接磷酸二酯键。

可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。

※拓扑是物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。

5）原核生物DNA复制的起始、延伸和终止；
①复制的起始：辨认起始点，形成单链；合成引发体；合成引物。

引发体：含有解螺旋酶、DnaC蛋白引物酶和DNA复制起始区域的复合结构；
双向复制：原核生物从一个固定的复制起始点（ori）开始，同时向两个方向进行；
引物：由引物酶催化合成的短链RNA分子。

②链的延长：在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

③终止阶段：原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。

6）真核生物DNA的复制：半保留复制；多个复制点，可分段进行复制；复制从复制起点向两个方向进行，一直到相邻的复制子相遇，随后RNA引物被除去，由DNA连接酶连接两个DNA片段。

末端结构——端粒进行不依赖模板的复制保证线性DNA不会变短。

7）逆转录：存在于逆转录病毒中，以RNA为模板合成RNA和DNA的互补链；依赖于逆转录酶。

8）DNA的体外扩增——多聚酶链式反应（PCR）的基本原理：变性、复性、半保留复制；用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

※每经过一次变性、退火、延伸为一个循环。

①变性：90~97℃使双链DNA变性分开为两条单链；
②退火：45~55℃下低温进行退火，使引物与单链DNA配对结合；
③延伸：结合后在72℃下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。

反应体系：双链DNA模板、对目的序列特异性的PCR引物、TaqDNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸和反应缓冲液。

8）DNA的损伤：生物体受某些理化和生物等外源性因素或体内环境改变的影响，引起DNA分子
结构的任何异常改变。

修复——复制过程所发生的突变（碱基配对错误），由核内DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）以其校读功能予以纠正（切去错配碱基，补回正确碱基）。

2.RNA的生物合成：以DNA为模板在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程为不对称转录。

RNA的转录起始于DNA模板的一个特定起点，并在另一个终点处终止，此区域为“转录单位”；DNA分子上编码蛋白质的基因片段为结构基因；插入而不编码的序列为内含子；被间隔的编码蛋白质的基因部分为外显子。

1）转录体系：①模板：两条互补的DNA链由一条作为RNA合成的模板，为模板链/无义链，在其上以碱基配对的方式合成RNA分子；另一条链为编码链/有义链，与转录出的RNA链碱基序列一样，无转录功能，只进行复制。

※转录过程中以尿嘧啶代替复制过程中的胸腺嘧啶与腺嘌呤互补。

②原料：4种核苷三磷酸——ATP、GTP、UTP、CTP；③蛋白质因子；④RNA聚合酶。

※转录不需要引物，RNA合成是连续的。

2）RNA聚合酶（DDRP）：又称为转录酶，依赖DNA的RNA聚合酶或DNA指导的RNA聚合酶。

3）转录起始：RNA聚合酶结合到DNA模板上，DNA双链局部解开，第一个NTP加入形成起始复合物。

启动子——在DNA分子中，RNA聚合酶能够结合并导致转录起始的序列，是基因转录的开始部位：①DDRP能直接识别的启动子；②需蛋白质辅助因子的帮助才能识别的启动子。

DDRP通过σ因子能识别有义链，从而使全酶定位到并结合到启动子；被识别到的DNA区段为-35区的TTGACA序列。

酶在启动子附近将DNA局部解链（17个碱基对），形成开放转录起始复合体。

第一个核苷三磷酸(GTP或ATP)结合到全酶，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。

4）转录延长：①亚基脱落，RNA-pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；
②在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长：(NMP)
n +NTP→(NMP)
n+1
+PPi。

5）转录终止：RNA聚合酶在DNA模板上停顿不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。

①依赖Pho(ρ)因子的转录终止；②非依赖Rho因子的转录终止。

6）RNA转录后的加工修饰：在细胞内，由RNA聚合酶合成的原始转录物往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5’和3’末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。

此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。

原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。

真核生物转录后加工：①mRNA前体的加工修饰（5’端“帽子”结构的形成、3’端polyA“尾巴”的形成、hnRNA 内含子的切除和外显子的拼接、分子内部的核苷酸甲基化修饰）；
②tRNA前体的加工修饰；③rRNA前体的加工修饰。

3.RNA的复制：以单链RNA（正链）为模板合成其互补链（负链），再以负链为模板合成RNA正链。

蛋白质的生物合成——中心法则：生物遗传信息通过DNA的复制传递给子代，以DNA分子模板、按照碱基互补位原则进行复制、转录，传递给mRNA，按照mRNA的碱基排列顺序翻译合成蛋白质。

蛋白质的生物合成体系：mRNA为模板，rRNA构成核糖体作为合成蛋白质的场所，tRNA为转运工具，20种氨基酸（AA）为原料，蛋白质因子（起始因子IF、延申因子EF、释放因子RF等），酶
+。

（氨基酰-tRNA合成酶，转肽酶，转位酶），无机离子Mg
2
1）mRNA与遗传密码：mRNA是遗传信息的携带者。

顺反子：编码一个蛋白质或多肽的遗传单位；原核细胞中数个结构基因串联为一个转录单位生成的mRNA可编码几种功能的蛋白质，为“多顺反子”；真核mRNA只编码一种蛋白，为“单顺反子”。

①遗传密码/密码子：在mRNA中，从AUG开始，按照5’→3’方向，每三个相邻的核苷酸组成一个三联体结构；AUGC四种核苷酸可组成64个密码子。

②起始密码：AUG代表甲硫氨酸，也表示多肽链合成的起始信号；
③终止/无义密码；UAA、UAG、UGA不编码任何氨基酸，作为肽链合成的终止信号。

2）遗传密码的4种特性：①方向性：起始密码子总是位于5’端，终止密码子总是位于3’端；翻译时从5’→3’方向，不能倒读。

②连续性：每个三联体密码子决定一种氨基酸，两个密码子之间没有如何起标点作用的密码子加以隔开，构成一个连续不断的读码框；基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，导致框移突变。

③简并性：一种氨基酸具有多个密码子；编码同一氨基酸的密码子叫“同义密码子”，密码子的简并性只涉及第三位碱基，因为密码子的专一性由头两位碱基决定，所以当第三位碱基发生突变时仍能翻译出正确的氨基酸，这种特性叫“摆动性”。

④通用性：除线粒体和叶绿体外，各种高等和低等动物，包括微生物几乎通用同一套密码子。

3）核糖体RNA/rRNA：核糖体（核糖核蛋白）是蛋白质合成的主要场所，由蛋白质和rRNA组成；rRNA由大、小两个亚基组成；小亚基与mRNA、GTP和起动tRNA结合；大亚基有多个活性部位：
①A位：氨基酰位，结合氨酰基-tRNA；
②P位：肽酰位，结合肽酰-tRNA；※两个不同的tRNA结合点。

③E位：排出位，空载tRNA的排出部位；
④转肽酶活性部位；⑤mRNA结合部位；⑥蛋白因子结合部位。

4）反密码子/转移RNA/tRNA：mRNA与氨基酸分子间需tRNA充当媒介进行结合；一种tRNA只能特异转运一种氨基酸，部分氨基酸可由2~6种tNRA转运，这种tRNA为“同功tRNA”。

①在氨酰基tRNA合成酶的作用下，氨基酸结合到tRNA氨基酸臂3’端的-CCA-OH上，生成氨基酰-tRNA（氨基酸的活化形式）；
②通过tRNA的反密码子对mRNA密码子进行识别，使tRNA上携带的氨基酸可以按mRNA上核苷酸碱基的排列顺序合成蛋白质。

※遵循不稳定或摆动配对原则。

摆动配对原则：反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律。

不稳定配对：反密码子对密码子的识别通常遵循碱基互补原则A-U、G-C，但反密码子的第一个核苷酸与第三个核苷酸之间的配对并不严格遵循，若反密码子第一个核苷酸为I，可与A、U、C配对，若为U，可与A、G配对。

蛋白质的生物合成——包括氨基酸的活化与转运、肽链的合成、肽链的加工修饰3个重要阶段。

1）氨基酸的活化：在细胞质中进行，反应由氨酰-tRNA合成酶（氨基酸活化酶）催化，ATP供能，消耗2个供能磷酸键，生成氨酰-tRNA。

氨基酸+tRNA+ATP+氨酰-tRNA合成酶→氨酰-tRNA+AMP+PPi
氨基酰-tRNA合成酶可发挥较对功能，使误载的氨基酰-tRNA从tRNA上释下，保证遗传信息翻译的准确性。

2）肽链的合成——核糖体循环：氨基酸活化后，由tRNA携带到核糖体上，以mRNA位模板合成肽链，这是蛋白质生物合成的中心环节；
分为起始、延长和终止3个阶段。

①起始：在IF、GTP和Mg2+的参与下，核糖体大小亚基与mRNA及起始氨基酰-tRNA形成起始复合物；真核生物和原核生物的起始物不同。

Met（甲硫氨酸）
真核生物：Met-tRNA
i
Met结合；mRNA在核蛋白体小亚真核生物翻译起始复合物形成：核糖体大小亚基分离；Met-tRNA
i
基就位；核蛋白体大亚基结合。

fMet（甲酰甲硫氨酸）
原核生物：fMet-tRNA
i
原核生物翻译起始复合物形成：核糖体大小亚基分离；小亚基与mRNA结合（SD序列/核糖体结
fMet结合；核蛋白体大亚基结合位点与16SrRNA的3’端富含嘌呤的序列进行碱基配对）；fMet-tRNA
i
合。

②肽链延长：由EF、GTP的参与，多肽链上每增加一个氨基酸都要在核蛋白体上经过进位、转肽和移位（核蛋白体循环）；肽链自N→C端不断延长，在mRNA密码子的指导下，新的氨基酸不断被特异的tRNA转运至核蛋白体A位，在转肽酶的而作用下延长肽链。

每生成1个肽键，要消耗2分子GTP(进位和移位), 而氨基酸活化需消耗2个高能磷酸键，每增加1个氨基酸残基实际消耗4个高能磷酸键。

③终止：核蛋白体沿mRNA的3’端方向移动，P位上出现终止密码子，氨基酰-tRNA不再进位，RF结合大亚基受位后使转肽酶构象改变，起水解作用，使P位上的肽链从肽酰-tRNA释出，mRNA、核蛋白体分离。

释放因子RF：识别终止密码子；诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。

3）翻译后加工
①切割：去除N-端甲硫氨酸残基；信号肽及其他肽段的切除。

②个别氨基酸残基的修饰：二硫键的形成；辅助因子的连接和亚基聚合；多肽链中个别氨基酸的修饰。

③无活性的多肽链折叠后产生具有活性的空间构象。

④结合蛋白质在多肽链合成后于相应辅基连接。

⑤新生肽链的折叠：必需经过一系列严格而复杂的折叠过程，才能形成具有正确空间结构的有活性的蛋白质；此过程需分子伴侣（帮助~进行非共价折叠的Pr）和折叠酶（二硫键异构酶PDI、肽酰脯氨酰顺反异构酶PPI）的参与。