金属硫蛋白检测方法研究进展

金属硫蛋白检测方法研究进展
梁 鹏，吴晓萍，廖爱琳
（广东海洋大学食品科技学院，湛江 524025）
作者：梁鹏（1985～ ），硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。

通讯作者：吴晓萍
摘 要：金属硫蛋白是一种富含金属和半胱氨酸的低分子蛋白质，主要包括A g、A u、B i、C d、H g、Z n等硫蛋白，具有在体内可被金属和其他因素诱导合成的生物学特性。

本文综述了目前7种常用的金属硫蛋白检测方法。

关键词：金属硫蛋白；金属结合法；电化学法金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量（约6500D a）金属结合蛋白，富含半胱氨酸，又叫金属硫氨酸甲基内盐，能被金属诱导。

主要存在于动物的肝脏、肾脏、胰腺和小肠中。

近年来，很多实验表明，金属硫蛋白参与体内微量元素的储存、转运和代谢，具有拮抗电离辐射、清除自由基以及对重金属解毒的作用，还与机体生长发育、延缓衰老及某些疾病有关。

到目前有几种方法已用于生物组织和体液中M T的定量，但尚无标准方法。

本文重点综述7种方法，介绍其特点，有助于在进行有关研究时选择和建立适宜的检测方法。

1 金属结合法
金属结合法(Metal binding )主要基于MT对金属的高亲合力、且不同金属的亲合力具有差异性及其热稳定性而建立。

主要通过测定M T结合金属—竞争性替换金属含量来检测M T中金属含量的增高，从而计算出MT的含量。

1973年，P i o t r o w s k i等首先建立了金属结合法(203H g-T C A法)用于测定组织中的M T。

由于H g 2+在酸性环境下不仅可与M T结合而且还可置换其他金属离子(如p H=2.1时，分别有98％的H g 2+和1％的C d 2+与M T 结合)。

因此，本法适用于在利用酸沉淀其他蛋白而将M T分离出来时的测定[1]。

但此法的203H g的加入量极其重要，如加入量过小，反应体系中尚有未与203H g结合的M T，而导致测定结果偏低；相反，加入量过大, 则
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H g呈游离状态或与不被T C A所沉淀的低分子量组分
相结合，又可使测定结果偏高。

张保林等[2]运用银饱和分析法结合原子吸收光谱(A A S)检测了兔肝Z n-M T，具体方法为：向含M T的溶液中加入过量的A g +，待反应完全后，再逐次加入血红蛋白，以结合剩余的A g +，加热使血红蛋白沉淀，与M T结合的A g +则完全存在于上清液中，通过A A S测定其中A g +含量，便可计算出M T的浓度。

该方法与其他方法比较，不需要去除样品中共存的其它蛋白质和含S H基剂，可直接计算出M T含量，且不需特殊的仪器设备，操作简便，具有很高的重复性和准确性，该法检测的最低限为1μg/ml。

金属结合法具有一定的缺陷，如H g饱和法中H g +
除与M T结合外, 还与其他一些小分子量化合物结合；A g +不能置换已与M T结合的H g，且由于利用金属含量间接推算MT含量，特异性较差。

2 电化学法
电化学方法(Electrochemical )是利用巯基（-SH）在汞滴电极表面产生氧化还原反应出现的电位变化建立的，通过测定巯基以计算M T的含量。

运用检测M T 的电化学方法有：示差脉冲极谱法(DPP)、微分脉冲极谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法(DPASV) 和循环伏安法(CV)等。

1979年Olafson等建立了示差脉冲极谱法[3]测定M T，检出限为10-8M，且不受分子中金属含量的影响。

因此, 此法或许更能特异地反映M T而不是金属的量。

1992年，Bebianno等人应用差分微分脉冲极谱法测定了贻贝组织中MT的浓度[4]；后来Bordin等通过改变体系的p H值，利用D D P方便的检出了多种形式的M T，并快速分析出还原型的M T；B e b i a n n应用微分脉
2010年第09期
No.09，2010
中国食物与营养Food and Nutrition in China
冲极谱法测定了贻贝整个软件组织中的C d-M T浓度。

铁峰[5]报道用电化学分析仪单扫极谱法测定-S H基含量，李明春[6]采用组织化学方法，用简化的巯基试剂(DTNB)测定-SH含量。

3 免疫法
免疫法具有灵敏、特异的优点，所以近年来许多学者们建立了放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附分析法(ELISA)用于MT的检测。

Mallie等人于1979年首先应用RIA检测大鼠血清中的M T。

此方法的检测范围在0.1～100n g/m l之间，但此方法要用到放射性同位素，另外需时过长(3d),给常规检测带来不便。

1986年T h o m a s等首先建立了E L I S A，测定速度快、无需接触放射性同位素，与R I A无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相似，但ELISA的测定相对迅速，且无需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。

郑军恒[7]等于1999年用E L I S A法测定人血液中的M T，直接型E L I S A检测范围为1～10n g，竞争性E L I S A[8]检测范围为50～500ng。

随后Anderse等人采用二抗改进Western Blotting法检测MT，检测限可达1ng。

任宏伟[9]等用E L I S A测定鱼类体内的M T，结果表明比金属C d血红素饱和法具有更高的特异性，检测范围为10～40ng/ m l；黄波[10]等用竞争型E L I S A法测定人尿中的M T，检测限为20n g/m l。

对免疫检测方法，有学者[11]认为M T 具有较多的二硫键易被氧化，从而使共免疫性发生改变，进而影响免疫法的测定结果。

4 色谱分析法
对M T中不同亚型的检测，色谱分析法(L a w chromatography)较为适合, 应用的色谱分析法主要有H P L C、R P H P L C、H P L C-I C P-M S、H P L C-A A S。

Hunziker等[12]使用RPHPLC从兔组织样品中分离出7种亚型, 通过A A S来检测样品的金属含量，对M T定量测定。

鉴于常规色谱层析法分辨力差, 洗脱费时，Suzuki 使用凝胶渗透柱的H P L C将C d诱导大鼠的肝组织样品的M T分离出来，经直接联于A A S来检测样品的金属含量，对M T定量测定。

本法可在1h内检出浓度小于1μg/m l的1m l上柱样品中的M T含量，而且，可分别测定不同型的M T。

J i n等[13]利用H P L C分离M T，然后根据样品对250n m紫外吸收特性来直接对M T定量。

该法的灵敏度小于1μg/ml。

5 蛋白质印迹分析法
1986年，Aoki等利用蛋白质印迹分析法(Western Blotting Analysis)检测MT，检测限为0.6ng, 不仅可检测M T，而且可检测其它与镉结合的蛋白质。

随后，A n d e r s e n等建立了以兔抗鼠M T抗体为一抗，过氧化物酶联羊抗兔I g G为二抗，4-氯-萘酚作显色剂的蛋白质印迹技术用于检测M T，其检测限可达1n g[14]。

本法主要用于M T同分异构体的特性以及M T与各种金属离子相互作用的研究[15]。

6 巯基显色法
巯基显色法(SH Color Code)适合于检测MT含量较高的样品，对含量较低的样品灵敏度较差。

李立丽等[16]用Z n S O
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诱导猪肝产生M T，然后将M T粗提液加入巯基试剂(1:1)，在分光光度计420nm处读取吸光度A 值。

用自制的M T纯品制作标准曲线，根据A值可在标准曲线上读出M T浓度。

诱导后的猪肝中因M T含量较高采用其它方法均不能灵敏地进行检测，相对而言更适合采用巯基显色进行检测，并且巯基显色法操作简单、特异性较好，又可以避免放射性接触。

7 偶联技术
金属饱和分析对单一M T亚型缺乏选择性：免疫学分析不能定量混合物中单一M T亚型，不能给出原始金属组成，根据U U信号或染色定量灵敏度相对较低, 不能测定非诱导M T s。

若将高效分离技术和灵敏特异的选择性检测器联合起来， 将是一种理想的M T s检测策略。

最近发展的电喷离子化M S、碰撞诱导分离(C I D) M S和离子喷射源加强片段分别根据分子量、氨基酸序列、金属含量给出MT的详细特征。

偶联技术(coupled techniques)是快速灵敏、全面定性定量生物标本中MT 亚型的一种最具吸引力的工具，未来能有效代替金属饱合分析、免疫分析而进入生化和临床实验室[17]。

高效的分离技术与灵敏的检测技术“杂交”形成的偶联技术，恰能克服以前各种方法的缺点，快速、有效测定M T。

因此，偶联技术的应用与发展，必将成为未来MT检测方法的发展方向。

综上所述，灵敏性（即最小检出量）是选择检测MT 方法的一个重要指标。

因而测定组织器官中的M T的含量，首推HPLC-AAS法，测定体液(如血液、尿液等)中的MT含量，选用RIA和ELISA法为佳。

每种检测方法其结果
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梁鹏等：金属硫蛋白检测方法研究进展
都可能会受到某些因素的影响：（1）样品的处理方法；（2）M T结合金属的种类；（3）M T同形体的多态性；（4）大量MT蛋白和非MT蛋白中MT的高比例等。

金属结合法适于测定M T含量较高的样品；H P L C 适于分离和检测M T的同分异构体，此外，电化学法和蛋白印迹分析还可用于研究M T的构型变化及其与金属离子相互作用的关系；免疫法则适于检测M T含量较低的样品；M T检测方法需要标准化，对所测得的结果作出适当的解释，如所测得的M T是总量还是其中的一种类型或亚型，或者是氧化状态还是还原状态，有待进一步探讨。

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参考文献
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Advancement of Metallothionein Detection Methods
LIANG Peng，WU Xiao-ping，LIAO Ai-lin
(College of food science and technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524025)
Abstract：Metallothionein was a kind of low-molecular-weight protein rich in metals and 2-amino-3-thiopropionic acid such as sulfurprotein with Ag，Au，Bi，Cd，Hg，Zn，etc., which had biocharacteristics of been indued synthesis by metals and other factors. Seven methods to detect MT were discussed in the paper.
Keywords：Metallothionein；Metal-binding Method；Electrochemical Method
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