注射用盐酸万古霉素无菌检查方法学验证研究

注射用盐酸万古霉素无菌检查方法学验证研究

作者：李占芳,宋建建,李俊卿

来源：《中国医药导报》2010年第31期

[摘要] 目的：确定可行的注射用盐酸万古霉素无菌检查方法。方法：采用薄膜过滤法，以不同的冲洗量，消除抗生素的抑菌活性。结果：样品、阴性对照及试验组菌在5 d内生长良好。结论：注射用盐酸万古霉素对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性，采用薄膜过滤法，用0.1%蛋白胨缓冲液冲洗500 ml，可有效除去注射用盐酸万古霉素中的抑菌成分，使检验结果更准确、可靠。

[关键词] 盐酸万古霉素；无菌检查法；方法学验证

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2010）11（a）-050-02

Studies on test for sterility of Vancomycin hydrochloride for Injection

LI Zhanfang, SONG Jianjian, LI Junqing

(Dongying Institute for Drug Control, Dongying 257091, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for slerility test of Vancomycin hydrochloride for Injection． Methods: Membrane filtration method was used by modifying the amount of rinsing fluid． Results: All of positive strains and test strains reveaded growth of microorganism in five days and the substance control and negative control gave no evidence of growth. Conclusion: Vancomycin hydrochloride for Injection have higher antibacterial activity on staphylococcus aureus. It can obtain satisfied results by using membrane filtration method and 0.1% peptone buffer solution and flushing dose 500 ml which can eliminate the antibacterial activity.

[Key words] Vancomycin hydrochloride; Slerility test; Testing and verifying of the method

盐酸万古霉素为窄谱抗生素，仅对革兰阳性菌有效，如溶血性链球菌、肺炎球菌、淋球菌及肠球菌等均属敏感，对耐药金黄色葡萄球菌尤为敏感。其作用机制是抑制细菌细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。临床主要用于耐青霉素金黄色葡萄球菌所引起的严重感染，如肺炎、心内膜炎及败血症等，对溶血性链球菌引起的感染及败血症等也有较好的疗效。《中国药典》2010年版规定，在建立一种药品微生物限

度检查的方法时，应对方法进行验证以保证方法的可靠性，通过对注射用盐酸万古霉素进行每一株试验菌的验证，证明所用的方法有效地去除了抑菌活性，适合该药品的无菌检查[1]。

1 材料与仪器

1.1 供试品

注射用盐酸万古霉素（规格： 500 mg/瓶，批号：16501、16502、9408，政德制药股份有限公司）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]，均来自中国药品生物制品检定所。

1.3 缓冲液

0.1%蛋白胨缓冲液。

1.4 培养基

虎红琼脂（批号：051109）、营养琼脂（批号：051023）、硫乙醇酸盐液体培养基（批号：050930）、改良马丁培养基（批号：051020）、改良马丁琼脂培养基（批号：050925），均由中国药品生物制品检定所提供。

1.5 仪器

YAMATO SM-Z型自动高压灭菌锅（日本樱花公司）；PL203型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；WH2型涡旋混合仪（上海沪西医疗仪器厂）；HYT-2000A型智能集菌仪及配套反复使用过滤器（杭州高得医疗器械有限公司）；全封闭无菌试验过滤培养器（北京牛牛基因技术有限公司，批号：20060510）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备[2]

2.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐液体培养物，30～35℃培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50～100 cfu的菌悬液，备用。

2.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每毫升含50～100 cfu的菌悬液，备用。

2.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，使大量孢子产生，加入3～5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至灭菌试管内，将菌液稀释至每毫升含50～100 cfu的菌悬液，备用。

2.2 供试品溶液配制[3]

取供试品10瓶，分别按无菌操作溶于0.9%无菌氯化钠溶液溶解并稀释成药液浓度约10 mg/ml的供试液。

2.3 方法[4-5]

先湿润滤膜，取样品10瓶溶解于500 ml 0.9％无菌氯化钠溶液中，取三联无菌过滤器将样品全部过滤，每个滤筒用100 ml 0.1％蛋白胨水冲洗3～5遍，总量分别为300、400和500 ml/膜，之后分别灌注100 ml硫乙醇酸盐流体培养基，再分别加入1 ml稀释好的大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞和金黄色葡萄球菌菌液，枯草芽孢杆菌菌液和生孢梭菌如法操作，细菌置35℃培养，逐日观察结果；白色念珠菌和黑曲霉菌过滤与冲洗方法同细菌，最后灌注100 ml 改良马丁液体培养基，置28℃培养逐日观察结果。不过滤样品，单纯冲洗滤膜，加入阳性菌灌注相应培养基作为阳性对照；不加阳性菌只灌注培养基作为阴性对照。

2.4 结果

供试液浓度为10 mg/ml样品的冲洗量为300～500 ml/膜的梯度冲洗量中有效清除抗生素残留的最佳冲洗量，结果见表1、2。

3 讨论

溶解注射用盐酸万古霉素时不宜采用0.1%蛋白胨水溶液，使用时易产生白色絮状物，阻塞滤膜，采用0.9%无菌氯化钠水溶液则可避免[6-8]。

开始用冲洗液冲洗时，滤器内易产生白色泡沫，所以开始前200 ml最好先50 ml/次，同时充分震摇，利于抑菌成分冲洗干净。

冲洗量为400 ml/膜时，枯草芽孢杆菌开始第1天是阳性，慢慢到第2天会转为阴性；冲洗量在500 ml/膜时，不会出现此现象。

盐酸万古霉素对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有强抑制作用，特别是金黄色葡萄球菌，验证实验表明，将供试品配成10 mg/ml，采用薄膜过滤法，冲洗量为500 ml，此法简单有效，方便可行。