猪圆环病毒2型cap蛋白B细胞线性抗原表位鉴定

截短蛋白SDS-PAGE分 析
将诱导后的菌液离心，取上 清进行SDS-PAGE分析，其中 将空载体pMAL-c4x表达的 MBP标签作为对照，结果显 示在43kd左右的位置出现与 MBP大小相似的目的条带， 表达量较大。
Cap蛋白抗原表位初步鉴定
用表达好的JD1--JD19进行ELISA板包被和Dot-blotting分析，将MBP蛋白作 为对照孔，孵育杂交瘤细胞上清作为一抗:结果显示;. 1E7仅与J D-4成阳 性反应，所识别的抗原表位位丁一as 71-86; 4E2仅与JD-10成阳性反应， 所识别的抗原表位位于aa131--146; ELISA与Dot-blotting结果相一致。
分别取诱导前和诱导后的菌液处理， 进行SD S-PAGE分析，电泳结果显示经 过160C诱导后在34kd的位置与诱导前 比较有一条明显条带，该条带为目的 带。将诱导后的菌液进行SDS-PAGE分 析，结果显示大部分的目的蛋白存在 于上清之中，可知原核表达的Cap蛋白 为可溶性蛋白。
Cap蛋白诱导前后SDS-PAGE分 析
重组质粒pET-Cap的酶切鉴 定
对重组质粒pET Cap进行Not I 和Sal I双酶切鉴定，双酶切后 得到两条目的带，一条大小 约为710bp左右，该条带为 Cap蛋白基因目的条带;另一条 带大小约为5400bp左右，该 条带为线性pET 30a载体条带。
Cap蛋白的SDS-PAGE分 析
Cap蛋白抗原表位图谱绘制分 析
利用生物学软件DS2.5对已鉴定出的抗原表位进行表位图潜绘制。
讨论：Cap蛋白的原核表达与酵母表达的比较
猪圆环病毒2型基因组全长大小为1767bp一1769bp，含有主要的2个 开放阅读框:ORF 1和ORF2;其中ORF2编码该病毒唯一的结构蛋白Cap 蛋白。Cap蛋白在病毒之间的同源性约为65%。Cap蛋白由于可以诱 导机体免疫应答，产生特异性抗体，从而使其成为研究PCV2的免疫 机理和诊断技术的一个目标。本研究采用常规的大肠杆菌对Cap蛋 白进行原核表达，与实验室采用的毕赤酵母表达的去核定位信号的 Cap蛋白做比较。两种表达系统的蛋白均采用Ni十蛋白柱对其进行 纯化，但是纯化后的蛋白浓度有着明显不同。虽然大肠杆菌表达系 统的诱导表达时间较短，但由于该表达系统在表达蛋白过程中常因 诱导条件不够理想导致包涵体的形成，从而对表达量造成影响。而 毕赤酵母表达系统虽然在前期表达上需要进行密码子的优化，GC含 量的调整，但是由于选取表达的菌株GS115为分泌型菌株，所以不 用担心包涵体的形成对蛋白浓度造成的影响。
最后，由于单克隆抗体进行间接免疫荧光鉴定时与病毒反应强弱不同，利用生物学软件 对已鉴定的抗原表位进行分析，绘制Cap蛋白和PCV2病毒粒子图谱，分析表位在图谱上 的位置。 综上所述，本研究制备抗Cap蛋白的单克隆抗体，利用短肽扫描的方法鉴定出2个 Cap蛋白的抗原表位，其中表位138YDPYVNY144为最新发现的表位，通过生物学软件对 该表位在蛋白和病毒粒子上定位，从而进行分析，可知抗原表位在病毒粒子上的位置与 其反应原性有关。
讨论：Cap蛋白的抗原表位鉴定
B细胞的抗原表位是指天然抗原分子表面的表位，根据结构划分可 分为氨基酸连续的线性表位和空间上氨基酸连续的构象表位。针对B细 胞的线性表位的鉴定现在多采用噬菌体展示法、截短肤扫描法、X一衍 射与核磁共分析和表位预测法等。有文献已经报道了Cap蛋白的抗原表 位情况，已经鉴定出一些Cap蛋白的免疫原性优势区，包括构象表位第 4785, 165200, 230233位氨基酸和线性表位区域为第65--87,117--131, 156--162, 169--180，175--192, 231--233位氨基酸等;其中，能够构 成Cap蛋白中和表位的多为构象表位，如第231--233位氨基酸是具有中 和活性的构象表位，又如第59位氨基酸也是构成中和构象表位的一个重 要氨基酸。
技术路线：
PCV2 Cap蛋白基因 的扩增与鉴定
Cap蛋白的原核表达和抗原性比较
Cap蛋白原核表达 及SDS-PAGE分析
PCV2 Cap蛋白原核 表达载体的构建
原核表达Cap蛋白纯化
转化与挑菌
原核表达与真核表达Cap 蛋白的反应原性比较
重组质粒的提取、鉴 定和测序
技术路线：PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
单克隆抗体的IFA鉴 定
在接种PCV2病毒的pK15细胞上进 行间接免疫荧光反应，将杂交瘤细 胞上清作为一抗，感染猪圆环病毒 的猪血清做为阳性对照，SPF猪血 清作为阴性对照，在荧光显微镜下 观察，结果显示，1E7与4E2两株杂 交瘤细胞均与病毒粒子产生荧光反 应。
纯化腹水的SDS-PAGE分 析
将1E7, 4E2两株杂交瘤细胞系在小 鼠腹腔内制备腹水，纯化;将纯化 后的腹水进行SDS-PAGE电泳分析， 结果显示在大约SOkd和20kd的位 置上分别出现两条目的带，与单 抗条带相符，初步获得纯化单抗。
腹水的效价分析
将纯化后的腹水进行倍比稀释， 进行间接ELISA检测，结果显示 纯化后的腹水1E7稀释至 1:256000仍可与抗原反应;腹水 4E2与抗原反应的OD4sonm值较 低，稀释至1:128000倍时与抗 原反应较弱。
讨论：Cap蛋白的单克隆抗体制备和鉴定
结果显示3株单克隆抗体均是IgG 1型，由结论可知在免疫小鼠时 Cap蛋白的免疫效果较好。单克隆抗体进行IFA检测试验发现，虽然都产 生荧光反应，但是1E7的荧光效果要强于4E2。用获得的杂交瘤细胞注入 小鼠腹腔制备腹水，之后用G蛋白柱进行纯化，对单抗腹水效价进行摸 索，由结果可知二者的差异较大，可能是由于在腹水制备过程中小鼠自 身存在差异，如在抽取腹水过程中出现溶血现象，导致单抗腹水效价差 异。
讨论：Cap蛋白的原核表达与酵母表达的比较
此外，本研究在大肠杆菌系统表达Cap蛋白时对该蛋白的全部233个 氨基酸进行表达，而之前实验室利用毕赤酵母表达的Cap蛋白对前 1--41氨基酸去除后进行表达。有研究表明Cap蛋白的前141氨基酸 是该蛋白的核定位信号该核定位信号抑制Cap蛋白的大量表达;所以 在酵母表达系统中去除核定位信号，不仅不影响Cap蛋白的表达， 反而还能够使Cap蛋白在该表达系统中更为高效。而且通过 Western-blotting结果分析表明，两种表达系统的表达对该蛋白的 反应原性并未造成不同。由此可见，Cap蛋白的核定位信号的去除 并未对该蛋白造成影响。
Cap蛋白抗原表位空间位置 分析(利用蛋白结构分析软 件spdbv和DS2.5C)
结果：Cap蛋白基因PCR扩增
从PCV2病毒中提取DNA，并且 以其为模板利用引物进行PCR 扩增出Cap蛋白基因，电泳进 行结果分析，所扩增出目的片 段大小为722bp，与Cap蛋白基 因大小相符，并且阴性对照没 有条带，结果成立
猪圆环病毒2型cap蛋白B细 胞线性抗原表位鉴定
汇报人：
导
师：
摘要：
研究报道，Cap蛋白由233-235个氨基酸组成，其中包含多个线性和构 象抗原表位，本研究基于目前的研究报道对Cap蛋白的抗原表位进行鉴定和 分析。首先构建重组载体pET Cap，利用原核表达系统表达Cap蛋白。对己 经表达的Cap蛋白与之前实验室己有的酵母Cap蛋白进行反应原性比较，酵 母表达的Cap蛋白要好于原核表达的Cap 蛋白。用酵母表达的Cap蛋白作为 抗原对BALB/c雌鼠进行免疫制备单克隆抗体获得3株杂交瘤细胞株，命名为 1E7, 4E2, 5D1，其中1E7和4E2可分泌抗Cap蛋白的单克隆抗体，5D1可分泌 抗 His 标签的单克隆抗体。 其次，本研究对 Cap 蛋白进行截短表达，去除 Cap蛋白的核定位信号后，设计引物构建载体表达19个短肽，命名为JD1-JD19。利用短肽扫描法，将短肽与单克隆抗体反应，初步鉴定出两个线性 抗原表位;再利用该方法对已经鉴定的表位进行进一步的截短，最后确定两 株单克隆抗体所识别的精确表位分别为77NDFLPPG83和’138YDPYVNY144。在 已经定的表位当中 77NDFLPPG83 与之前文献报道的表位有部分重叠，而 138YDPYVNY144之前文献并无报道,为最新发现的表位，补充了关于Cap蛋 白抗原表位的分析。
Cap蛋白抗原表位精确鉴 定
在已经初步鉴定抗原表位的基础上，对已经确定的肽段 分别从两端各去除一个氨基酸直至无阳性反应。
Cap蛋白抗原表位精确鉴 定
Cap蛋白抗原表位精确鉴 定
通过Dot-blotting和间接ELISA进行鉴定，二者结果相一致，结果显示，1E7所 识别的的核心表位为77NDFLPPG83. 4E2所识别的核心表位为138YDPYVNY144。
讨论：Cap蛋白的单克隆抗体制备和鉴定
Cap蛋白作为PCV2的衣壳蛋白，具有良好的免疫原性，目前作为PCV2免 疫原性研究、病毒组织嗜性以及宿主相互作用的主要对象，由于全世界 的PCV2抗原性极为相似，存在着广泛的血清交叉反应。Cap蛋白可以特 异性的结合感染PCV2的猪血清，可见使用Cap蛋白免疫动物可以使其产 生中和抗体，Cap蛋白具有中和作用。根据前人研究，用Cap蛋白免疫 SPF猪，免疫后猪体内的PCV2病毒复制得到了抑制，表明了Cap蛋白具有 免疫原性。为了具体研究Cap蛋白的相关特性，针对Cap蛋白的单克隆抗 体的制备就显得至关重要。由于之前实验室酵母表达的Cap蛋白要优于 本研究原核表达的Cap蛋白，所以本研究选用酵母表达的Cap蛋白进行小 鼠免疫制备单克隆抗体。对于获得3株单克隆抗体进行鉴定，其中SD1可 以和带有His标签的PRVVPS蛋白反应，证明该单克隆抗体是针对His标签 的单抗;而其他2株单抗均是抗Cap蛋白。而且通过Western-blotting结 果进行分析，单抗都可以与Cap蛋白进行反应，单抗识别的抗原表位均 是线性表位。对于单克隆抗体的亚型鉴定，结
Hale Waihona Puke 将可溶性蛋白进行Ni+柱 纯化，纯化得到的Cap蛋 白进行SDS-PAGE分析。