全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs及其诱导分化

中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第36期 2009–09–03出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7073Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, ChinaCai Peng ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, Chinawarriormd@Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chiefphysician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, UnionHospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. comSupported by: the Natural ScienceFoundation of Fujian Province, No. C0710018*Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence methodCai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong AbstractCai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [ ]摘要蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [ ]基础医学蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7074www.CRTER.org福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001蔡 鹏★，男，1982年生，福建省漳州市人，汉族，福建医科大学在读硕士，医师，主要从事干细胞在泌尿外科疾病治疗方面的研究。

warriormd@qq. com通讯作者：朱绍兴，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001zsxing2005@ 福建省自然科学基金资助项目(C0710018)*中图分类号:R394.2 文献标识码:B文章编号:1673-8225 (2009)36-07073-05收稿日期：2009-06-12修回日期：2009-07-25 (20090522021/ ZS ·Q)0 引言由于骨髓间充质干细胞具有诸多优势，其作为种子细胞在组织工程、细胞替代治疗、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用[1-6]。

但骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞[7]，需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。

实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养方法，观测骨髓间充质干细胞生物学特性，及其成骨、成脂分化潜能，为后续进行基因修饰骨髓间充质干细胞及体内移植实验做好准备。

1 材料和方法设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。

材料：清洁级雄性近交系SD 大鼠30只，四五周龄，体质量80~100 g ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK 沪2007-0005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验用主要试剂：实验方法：大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养：用1 mL注射器抽取体积分数为10%水合氯醛0.3 mL 腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min 。

铺无菌单盖住大鼠上身，无菌条件下分离出双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM 浸泡清洗。

眼科剪切除两端骨骺，显露骨髓腔，用10 mL 注射器吸取L-DMEM 培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓，反复冲洗待骨髓腔变白后停止。

收集骨髓悬液于15 mL 离心管中，1 000 r/min 室温离心3~5 min ；离心后去上清，用5 mL 新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至25 cm 2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO 2饱和湿度培养箱中培养。

约48 h 后首次换液，以后每两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。

大鼠骨髓间充质干细胞的纯化扩增：待细胞融合至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS 轻轻冲洗后，吸去PBS 。

加入2.5 g/L 胰蛋白酶1.0~2.0 mL ，于培养箱中温育1.0~2.0 min ，置于显微镜下观察细胞形态变化，待镜下细胞之间突起消失、变圆后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，用吸管轻轻吹打数次，转移至15 mL 离心管，1 000 r/min 室温离心5 min ，弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬，用吸管轻柔吹打成细胞悬液。

计数板计数后，调整细胞密度，以5 000个/cm 2接种于新的25 cm 2培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为5%的CO 2饱和湿度培养箱中继续培养。

以后每两三天换液1次，此时细胞记为P1(第1代)，以后待细胞80%~90%融合后重复上述步骤进行传代。

流式细胞仪检测细胞表面标记：待P3细胞融合至90%左右，吸去培养基，用PBS 充分洗涤细胞2次，加入2.5 g/L 胰蛋白酶室温消化1 min ，加入新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 培养基终止消化，吸管仔细吹打，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，加PBS 并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1×106，分装至EP 管中，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，于待检测的样本中各加入90 µL PBS ，轻轻吹打成细胞悬液，分别加入CD34，CD90，CD11b ，CD106，CD44，CD45一抗及其同型对照各10 µL ，充分吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min 后，测试前再加400 µL PBS 至总体积500 µL ，充分混匀，上机检测。

向成骨细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成骨诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。

成骨诱导14~21 d 后进行茜素红染色。

试剂来源低糖DMEM 细胞培养基、优质胎牛血清 EDTA-胰酶 FITC 标记小鼠抗大鼠CD34、 CD90单克隆抗体 FITC 标记小鼠抗大鼠CD44、CD45、CD106、CD11b 单克隆抗体 茜素红、油红O成骨诱导分化培养液、成脂诱导分化培养液Hyclone 公司Gibco 公司ABD Serotec 公司Biolegend 公司Sigma 公司 广州赛业公司蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH7075www.CRTER.org向成脂肪细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成脂肪诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。

成脂肪诱导14 d 后进行油红O 染色，检测脂肪沉积情况。

设计、实施、评估者：设计为第一~三作者，实施为第一、三、四作者，由第二作者进行评估。

均经过系统培训，未使用盲法评估。

2 结果2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代骨髓间充质干细胞均一表达CD90，CD44，CD106，阳性率分别为91.50%，99.87%，78.02%；而CD34，CD45，CD11b 呈阴性，阳性率分别为0.07%，0.15%，0.21%，见图2。

2.3 成骨诱导分化鉴定 成骨诱导21 d 后茜素红染色，诱导组显示大量橘红色矿化结节形成，对照组呈阴性，见图3。

a: 5 days of primary cultureb: 9 days of primary culturec: 4 days of P2 BMSCsd: 4 days of P5 BMSCsFigure 1 Morphological observation of rat bone marrowmesenchymal stem cells (BMSCs) of primary and successively passaged culture(×100)图1 原代及连续传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态观察(×100)a bFigure 2 Surface marker expression of P3 rat bone marrow mesenchymal stem cells图2 第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达c d e f g h iFITC-isotypism control was shown in Figure 2a and PE-isotypism control in Figure 2d, Figure 2h. The quantitative data of CD34 was shown in Figure 2b,CD90 in Figure 2c,CD44 in Figure 2e,CD45 in Figure 2f,CD106 in Figure 2g,CD11b in Figure 2i, respectively蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化P .O. Box 1200, Shenyang 110004 7076www.CRTER.org2.4 成脂诱导分化鉴定成脂诱导2周后油红O 染色，诱导组可见细胞以长梭形为主，胞浆内出现大量红染的脂滴，折光性较强，形态大小不一，成串排列或围绕细胞核分布，部分脂滴融合为较大团块，将细胞核挤向一边；对照组染色后细胞内未见红染脂滴，见图4。