全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs及其诱导分化
中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第36期 2009–09–03出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
7073Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Cai Peng ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
warriormd@https://www.360docs.net/doc/608318648.html,
Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chief
physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, Union
Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. com
Supported by: the Natural Science
Foundation of Fujian Province, No. C0710018*
Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25
全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★
蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇
Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method
Cai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong Abstract
Cai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [https://www.360docs.net/doc/608318648.html, https://www.360docs.net/doc/608318648.html,]
摘要
蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [https://www.360docs.net/doc/608318648.html, https://www.360docs.net/doc/608318648.html,]
基础医学
蔡鹏，等.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.360docs.net/doc/608318648.html,
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福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001
蔡 鹏★，男，1982年生，福建省漳州市人，汉族，福建医科大学在读硕士，医师，主要从事干细胞在泌尿外科疾病治疗方面的研究。warriormd@qq. com
通讯作者：朱绍兴，博士，主任医师，副教授，硕士生导师，福建医科大学附属协和医院泌尿外科，福建省福州市 350001
zsxing2005@ https://www.360docs.net/doc/608318648.html,
福建省自然科学基金资助项目(C0710018)*
中图分类号:R394.2 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2009)36-07073-05
收稿日期：2009-06-12
修回日期：2009-07-25 (20090522021/ ZS ·Q)
0 引言
由于骨髓间充质干细胞具有诸多优势，其作为种子细胞在组织工程、细胞替代治疗、基因治疗等领域得到了日益广泛的应用[1-6]。但骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极少，每
1×104~1×105
个单核细胞中约有1个骨髓间充质
干细胞[7]，需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。
实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养方法，观测骨髓间充质干细胞生物学特性，及其成骨、成脂分化潜能，为后续进行基因修饰骨髓间充质干细胞及体内移植实验做好准备。
1 材料和方法
设计：细胞学体外观察。
时间及地点：于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。
材料：清洁级雄性近交系SD 大鼠30只，四五周龄，体质量80~100 g ，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK 沪2007-0005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验用主要试剂：
实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞的原代分离培养：用1 mL
注射器抽取体积分数为10%水合氯醛0.3 mL 腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min 。铺无菌单盖住大鼠上身，无菌条件下分离出双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM 浸泡清洗。眼科剪切除两端骨骺，显露骨髓腔，用10 mL 注射
器吸取L-DMEM 培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓，反复冲洗待骨髓腔变白后停止。收集骨髓悬液于15 mL 离心管中，1 000 r/min 室温离心3~5 min ；离心后去上清，用5 mL 新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移
至25 cm 2
培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为
5%的CO 2饱和湿度培养箱中培养。约48 h 后首次换液，以后每两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况。
大鼠骨髓间充质干细胞的纯化扩增：待细胞融合
至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS 轻轻冲洗后，吸去PBS 。加入2.5 g/L 胰蛋白酶1.0~2.0 mL ，于培养箱中温育1.0~2.0 min ，置于显微镜下观察细胞形态变化，待镜下细胞之间突起消失、变圆后，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，用吸管轻轻吹打数次，转移至15 mL 离心管，1 000 r/min 室温离心5 min ，弃上清，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM 培养液重悬，用吸管轻柔吹打成细胞悬液。计数板计数后，调整细胞密度，以5 000个/cm 2接种于新的25 cm 2培养瓶，置于37 ℃、含体积分数为5%的CO 2饱和湿度培养箱中继续培养。以后每两三天换液1次，此时细胞记为P1(第1代)，以后待细胞80%~90%融合后重复上述步骤进行传代。
流式细胞仪检测细胞表面标记：待P3细胞
融合至90%左右，吸去培养基，用PBS 充分洗涤细胞2次，加入2.5 g/L 胰蛋白酶室温消化1 min ，加入新鲜含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM 培养基终止消化，吸管仔细吹打，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，加PBS 并轻轻吹打数次制成单细胞悬液，倒置显微镜下计数，并调整每个检测样本的细胞数为1×106，分装至EP 管中，1 000 r/min 室温离心7 min ，弃上清，于待检测的样本中各加入90 μL PBS ，轻轻吹打成细胞悬液，分别加入CD34，CD90，CD11b ，CD106，CD44，CD45一抗及其同型对照各10 μL ，充分吹打混匀，37 ℃避光孵育30 min 后，测试前再加400 μL PBS 至总体积500 μL ，充分混匀，上机检测。
向成骨细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充
质干细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105/孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成骨诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。成骨诱导14~21 d 后进行茜素红染色。
试剂
来源
低糖DMEM 细胞培养基、
优质胎牛血清 EDTA-胰酶 FITC 标记小鼠抗大鼠CD34、 CD90单克隆抗体 FITC 标记小鼠抗大鼠CD44、
CD45
、CD106、CD11b 单克隆抗体 茜素红、油红O
成骨诱导分化培养液、成脂诱导
分化培养液
Hyclone 公司
Gibco 公司
ABD Serotec 公司
Biolegend 公司
Sigma 公司 广州赛业公司
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向成脂肪细胞诱导分化：待培养的P3骨髓间充质干
细胞生长至80%~90%融合，常规消化传代，以1×105
/
孔密度接种于6孔培养板，常规培养1 d 后，诱导组加入2 mL 成脂肪诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3 d 换液1次。成脂肪诱导14 d 后进行油红O 染色，检测脂肪沉积情况。
设计、实施、评估者：设计为第一~三作者，实施为第一、三、四作者，由第二作者进行评估。均经过系统培训，未使用盲法评估。
2 结果
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察
2.2 大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，培养的第3代骨髓间充质干细胞均一表达CD90，CD44，CD106，阳性率分别为91.50%，99.87%，78.02%；而CD34，CD45，CD11b 呈阴性，阳性率分别为0.07%，0.15%，0.21%，见图2。
2.3 成骨诱导分化鉴定 成骨诱导21 d 后茜素红染色，诱导组显示大量橘红色矿化结节形成，对照组呈阴性，见图3。
a: 5 days of primary culture
b: 9 days of primary culture
c: 4 days of P2 BMSCs
d: 4 days of P5 BMSCs
Figure 1 Morphological observation of rat bone marrow
mesenchymal stem cells (BMSCs) of primary and successively passaged culture(×100)
图1 原代及连续传代培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态观
察(×100)
a b
Figure 2 Surface marker expression of P3 rat bone marrow mesenchymal stem cells
图2 第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物的表达
c d e f g h i
FITC-isotypism control was shown in Figure 2a and PE-isotypism control in Figure 2d, Figure 2h. The quantitative data of CD34 was shown in Figure 2b,CD90 in Figure 2c,CD44 in Figure 2e,CD45 in Figure 2f,CD106 in Figure 2g,CD11b in Figure 2i, respectively
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2.4 成脂诱导分化鉴定
成脂诱导2周后油红O 染色，诱导组可见细胞以长梭形为主，胞浆内出现大量红染的脂滴，折光性较强，形态大小不一，成串排列或围绕细胞核分布，部分脂滴融合为较大团块，将细胞核挤向一边；对照组染色后细胞内未见红染脂滴，见图4。
3 讨论
人们逐渐认识到骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间
充质干细胞。1968年，Friedenstein 等[8]
首次对骨髓间
充质干细胞进行了描述，此后骨髓间充质干细胞受到学者的广泛关注，该细胞易于体外分离扩增，在适宜的条件刺激下可向多方向分化，遗传背景稳定，有内在的组织相容性。同时骨髓间充质干细胞还易于外源基因的转染和表达，因而在细胞治疗和基因治疗方面有良好的应用前景[9-10]。
目前对于骨髓间充质干细胞分离纯化及体外培养还没有统一的方法，有根据细胞大小或者细胞表面的一些特殊标志来进行分离，即免疫磁珠法和流式细胞仪分选法；有根据骨髓间充质干细胞与其他细胞密度不同，而采用细胞分离液来分离，即密度梯度离心法；而最早也最简单的是根据骨髓间充质干细胞易于黏附塑料底物的特性来分离，即贴壁筛选法。利用免疫磁珠法和流式细胞仪技术进行分选虽可获得高纯度的骨髓间充质干细胞，但对细胞的活性影响较大，细胞增殖能力严重减低，甚至导致细胞活性完全丧失[11-12]，加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志，故应用较少；尽管采用密度梯度离心法可以有效地将红细胞、白细胞、单核细胞分层且对细胞活性影响较小，但也破坏了骨髓间充质干细胞生长的骨髓微环境，可能丢失骨髓微环境中对骨髓间充质干细胞生长有利的细胞因子和促黏附物质，亦对细胞体外扩增有不利影响[13]。而全骨髓贴壁分离法分离骨髓间充质干细胞，是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长而造血细胞悬浮生长的特性对二者进行分离，虽然所得细胞成分较复杂，但由于骨髓冲洗液中存在滋养细胞和某些细胞因子，促使骨髓间充质干细胞生长增殖旺盛，并且经换液传代后细胞仍可达到很高的纯度[14]。
实验采用全骨髓贴壁分离法成功分离大鼠骨髓间充质干细胞，原代细胞培养时增殖活力良好，骨髓间充质干细胞贴壁生长，而造血系细胞悬浮生长，每次换液去除悬浮生长的造血系细胞；再则根据各种细胞对消化酶的反应不同，传代时利用骨髓间充质干细胞较巨噬细胞、单核细胞易脱落的特点，严格掌握消化酶的量和消化时间，使易于消化的骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分离，而巨噬细胞、单核细胞因贴壁较强仍贴附于培养瓶底；从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化。经几次传代，细胞由最初的多角形克隆样生长变为形态均一、排列有序的梭形平行状或旋涡状。这一方法具有操作简便、快速、对细胞活性影响小等优点。在整个实验过程中，要获得活性好、
a: Experimental group
b: Control group Figure 3 Alizarin red staining identification after bone marrow
mesenchymal stem cells were induced into osteoblasts(×100)
图3 大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后茜素红染色结
果(×100)
a: Experimental group b: Control group Figure 4 Oil red O staining identification after bone marrow
mesenchymal stem cells were induced into adipocytes(×200)
图4 大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化后油红O 染色结
果(×200)
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形态均一的骨髓间充质干细胞，需要严格的无菌操作。除基本的无菌要求外，在剪取大鼠的双下肢及剥离皮毛后，应更换器械，避免动物取材和分离骨髓间的交叉污染。骨髓间充质干细胞生长时密度依赖性极强[15]，应注意传代细胞的种植密度，以1∶2或1∶3的比例进行传代为宜。由于骨髓间充质干细胞很容易产生老化现象，因此注意传代时的融合程度，以尽量延缓骨髓间充质干细胞出现老化现象的时间。传代应注意掌握消化时间，以消化2.0~3.0 min ，贴壁细胞突起开始收缩变形时进行轻柔吹打为宜。细胞传代六七代后，形态无明显变化，但扁平形的大细胞逐渐增多，梭形细胞减少。不添加任何生长因子，骨髓间充质干细胞经培养传代10代后，细胞生长未见老化现象。
骨髓间充质干细胞没有典型的形态特征，所以单凭光镜形态学、细胞大小、颗粒的有无等都很难鉴别骨髓间充质干细胞，而目前研究尚无发现骨髓间充质干细胞的特异性表面标记[16]。多数学者认为要鉴定骨髓间充质干细胞只能通过培养过程中出现的表面CD 表型[17]，以及其具有成骨、成脂诱导分化的能力，综合推断是否为间充质干细胞。有研究表明，骨髓间充质干细胞缺乏CD14，CD34和CD45等造血谱系标志，但对SH2，SH3，CD29，CD44，CD71，CD90，CD106，CD120和CD124等均呈现阳性反应[7，18]。实验通过流式细胞仪检测CD90，CD44，CD106，并通过脂多糖受体CD11b ，CD34、白细胞普通抗原CD45的鉴定排除骨髓来源的造血干细胞，再通过成骨、成脂诱导分化培养检测所培养细胞的分化潜能。实验发现，在分离除去了造血祖细胞，又没添加任何刺激诱导物的情况下，所培养的第3代细胞稳定、均一地表达细胞表面抗原CD44，CD90，CD106，几乎不表达CD34，CD11b 及CD45，并且第4代细胞在成骨、成脂诱导液的培养下，能成功地向骨细胞、脂肪细胞分化，证实所分离培养的细胞是实验所需要的骨髓间充质干细胞，为今后进一步进行基因转染及回输体内迁移与横向分化奠定了实验基础。
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高脂血症资料
实验动物学综述 题目：《高脂血症动物模型的探讨》姓名：张阳慧 学号： 2010109118 院系专业班级：硕2010级12班生理学任课老师刘政江老师 付建华老师
高脂血症动物模型的探讨 张阳慧综述司军强?审校 （石河子大学医学院民族高发病与地方病教育部重点实验室电生理研究室石河子 832002） 摘要：随着生活水平日益提高,高脂血症( hyperlipidemia) 发病率在逐年升高,大量流行病学调查和研究均表明,高脂血症是导致动脉粥样硬化(AS) ,冠心病、糖尿病等多种疾病最重要的的危险因素之一。高脂血症已经成为研究热点,但至今尚未明显突破,除了其他原因外,理想的动物模型(animal model) 制备可能也是制约其发展的重要原因。在研究高脂血症的模型动物中,有野生型、自然缺损和基因修饰的,动物种类包括大鼠、小鼠、兔、金黄地鼠、豚鼠和小型猪等。本文就对先天性、化学物质诱导的和转基因动物模型作一综述,为研究高脂血症的模型选择提供依据。 关键词: 高脂血症; 动物模型; 文献标识码: A Discussion on the animal model of hyperlipidemia Yanghui Zhang, Si Jun-qiang? （Division of Electrophysiology, Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Shihezi University Medical College, Xinjiang Shihezi, 832002） Abstract:With the increasing standard of living, hyperlipidemia incidence has increased year by year, a large number of epidemiological surveys and studies show that hyperlipidemia is a cause of atherosclerosis(AS), coronary heart disease, diabetes and the risk factors of other important disease . Hyperlipidemia is the hot point in the medicine field, but has not been broken through. Besides other reason, the experimental animal models play an important role in the study of the disease. In the study of animal models of hyperlipidemia, there are wild-type,natural defects and genetic modification, the animal species are including , rats, mice, rabbits, hamsters, guinea pigs and small pigs. To provide information for the choice of the animal models for the study of hyperlipidemia, congenital,chemical - induced and transgenic models were introduced in the review. Key words：hyperlipidemia ; animal model； 高脂血症( hyperlipidemia) 又称脂质代谢紊乱或异常, 是导致脂肪肝、动脉粥样硬化等多种疾病的重要因素。随着发病率的持续增加, 高脂血症的病因学、预防和治疗依然是医学界研究的热点。然而至今药物治疗尚未取得明显突破, 究其原因, 除了其它因素而外, 高脂血症动物模型的制备也可能是影响该类药物发展的重要原因之一, 因此, 选择理想的高脂血症动物模型是推进高脂血症研究进程的关键。本文就近年来高脂血症动物模型的研究概况作一综述, 为该领域的研究者正确合理选择高脂血症动物模型提供依据。 1常见高脂血症模型动物的种类及特点 1.1 大鼠建立大鼠高脂血症模型, 方法简单, 成本适中, 采血量较大, 可以满足一次做多种指标, 且模型建立的方法最多。更重要的是大鼠的食性与人类相似, 所形成的病变与人类早期病理改变相似, 且适应性较强, 是目前国内研究脂质代谢最多的实验动物。但大鼠有对抗动脉粥样硬化形成的能力, 不宜作为抗动脉粥样硬化药物
大鼠解剖图
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
全骨髓法分离培养大鼠MSCs实验指导
大鼠骨髓间充质干细胞培养 干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。 源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。 本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。 工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、全骨髓提取 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。 用无菌PBS浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
骨质疏松常见模型
骨质疏松常见模型 1. 概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致骨脆性 增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2. 临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3. 按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性骨折。依 次程度增加。 4. 现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原发性骨 质疏松症（primary osteoporosis ，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis ，POMP ）和Ⅱ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类 现代医学的研究 1. 发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素导致骨 吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2. 诊断与治疗：① 诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density ，BMD ）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD 测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD 的方法有双能X 线吸收测定法 （DXA ）、外周双能X 线吸收测定法（pDXA ）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA 测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准” 。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3 等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D 等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失单独使用钙剂是没有治疗骨质疏松症的作用，必须配合骨形成促进剂或骨吸抑制剂。
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定 目的：对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定，观察其生长方式和分化特征。方法：运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养，对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin 表达情况。用血清诱导其分化，分化7 d后，采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况。结果：大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中，呈悬浮状态生长，形成细胞球，经免疫荧光检测，细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后，转为贴壁生长，经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性。结论：采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。 脑血管病是威胁全世界人类生命健康的一类疾病，其中缺血性脑梗死作为神经系统的常见病、多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。且随着人口结构的老龄化和吸烟人口的增加，脑血管病的发病率有进一步上升的趋势。传统的治疗方法包括药物、康复理疗和功能锻炼等，但效果均不理想。近年来，随着干细胞（Stem cells，SCs）理论的提出，不少研究者相继报道从神经组织、脂肪组织、骨髓等组织中分离并培养出了各自的干细胞，其中神经系统来源的干细胞被称之为神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，部分研究者将骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功诱导为骨髓源神经干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。BMSCs-NSCs的开发和应用，克服了从成体脑组织中获取神经干细胞和危险性和局限性，也避免了胚胎来源干细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。骨髓基质细胞源性神经干细胞的移植治疗修复中枢神经系统损害成为了研究重点，这给脑梗死的细胞移植治疗带来了新思路[1-3]。因此，本研究选用Wistar大鼠骨髓基质细胞，运用含bFGF和EGF的无血清DMEM/F12培养基对其进行诱导培养，拟培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞，为骨髓源神经干细胞的进一步研究打下基础，现具体报道如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年Wistar大鼠，雄性，体重（200±50）g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。 1.1.2 主要试剂DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen 公司。表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Peprotech 公司，小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon 公司，小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulin Ⅲ抗体购自Abcam公司，兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG购自Molecular Probes公司。DAPI
造血干细胞分离培养方法
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
骨质疏松动物模型
骨质疏松的动物模型 骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微观结构为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨的脆性增加、易于发生骨折。骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病之一。骨质疏松起病隐袭，一旦发现，多已发展到一定程度。随年龄增加，骨丢失和骨折发生率明显增加。骨质疏松性骨折可发生在任何部位，但以椎骨、腕部和髋部多见。髋部骨折最为严重，多需手术处理，且患者常合并慢性疾病，如高血压、心血管、慢性呼吸道阻塞疾病及糖尿病等，导致医疗费用和死亡率增加，一部分患者日常生活不能完全独立，年平均生活质量下降。女性由于峰骨量较低及绝经后雌激素水平下降，发病率较男性为高。近年来随着社会老龄化，人口寿命的延长，女性绝经后生存年限约占一生的1/3，据估计，从1990－2025，欧洲50岁以上妇女将增加30％－40％。男性预计增加更快，可达50％。在同一时期内，北美预期将增加83％。亚非绝对增加数将为更为明显。在1990年全世界仅髋部骨折达130－170万，预期到2025年为200万，甚至更多［1］。骨质疏松症已成为全世界范围的严重的社会和经济问题。 骨质疏松症的预防和治疗已成为一个多学科的、当前研究最活跃的课题之一。建立理想的骨质疏松症的动物模型是对治疗和预防骨质疏松症新药的体内过程、药物代谢动力学、药效学和影响药物作用因素的基础。随着对骨质疏松症的研究的不断深入，认为骨质疏松症的发生与遗传、营养、生活习惯、激素、运动、机械负荷和多种细胞因子有关。对骨质疏松症的动物模型提出了严格的要求。Rodgers等指出理想的动物模型应有三个特点：（1）方便性（Convenience）：动物购来容易，价格低廉，实验操作易行。（2）关联性（Relevance）：与人体条件比较相似，得到的信息能转化为人体的规律。（3）适宜性（Appropriateness）：为研究某一特定问题，最好用特定的动物模型模拟人体［2］。骨质疏松症的动物模型涉及动物的选择和复制的方法等方面，本文就此将国内外的有关进展进行综述。 复制骨质疏松模型的动物选择 用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型［3］。灵
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养 发表时间：2015-07-24T10:18:58.373Z 来源：《医药前沿》2015年第13期供稿作者：邹瑾1 李雅2 尹进3 [导读] 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一。 邹瑾1 李雅2 尹进3 （1湖南科技职业学院湖南长沙 410014） （2湖南中医药大学湖南长沙 410004） （3湖南疾病预防控制中心湖南长沙 410007） 【摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明 CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠 【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02 Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China 【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle, after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation. 【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。 1.材料与方法 1.1材料 雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。 1.2方法 1.2.1原代培养BMSCs 将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。 1.2.2传代、纯化BMSCs 当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。 1.2.3测定BMSCs的生长曲线选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。 1.2.4鉴定BMSCs 选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。 2.结果 2.1 BMSCs细胞培养的形态 BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。
小鼠骨髓干细胞取样制备方法
小鼠骨髓干细胞取样制备方法 Mouse SP protocol 1.水浴设置在37度，并用温度计量确认温度。预热DMEM+，预冷HBSS+ 2.使用 5-8 周龄雄性小鼠，取大腿骨和胫腓骨处的骨髓悬浮于HBSS+、 1)杀死小鼠，背朝下躺着，用70% 酒精喷洒腹部灭菌、 2)臀部稍下方用齿状刀口的剪刀水平切开腹部皮肤、 3)从此刀口同时向上向下同时撕裂皮肤，用钳子钳住膝盖骨扯下所有腿部皮肤、 4)从膝盖处剪断，取下胫腓骨，尽可能将肌肉组织剔除干净，剪掉脚，将其放于陪替 氏培养皿，其中放有5 ml左右预冷的HBSS+，置于冰上、 5)剔除干净大腿骨上的肌肉类组织，在臀部处剪掉大腿骨，骨髓细胞主要在这里，所 以尽可能取得更多的大腿骨，骨上组织尽可能剔出的越干净越好，以免骨髓细胞粘 附上面、将其置于培养皿、 6)一个小鼠取得四段腿骨, 用钳子固定垂直培养皿方向固定腿骨，用27-G 10ml注射 器打入HBSS+、骨髓细胞会从另一端推出，尽可能取得更多细胞，腿骨上下颠倒再 推打, 骨髓取出后腿骨会变白的、 7)用 18-G 针头反复推吸4-5次培养皿里的细胞，以打散团块细胞、但尽量不要打入 气体，因为气泡容易导致细胞死亡、将细胞转移到50ml的PP离心管里，同时用 70um的滤网过滤去处碎骨或团块, 计数有核细胞、 3.精确计数有核细胞、（平均5 x 107 有核细胞/6周龄的C57Bl/6 小鼠）、 4. 5 min 500g 4°C离心，弃上清，加溶血素裂解红细胞： 注：当红细胞较多时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：8室温静置10min 当红细胞较少时细胞悬液：红细胞裂解液＝1：4室温静置5min 红细胞裂解液为10×，临用前用DDW稀释成1× 5.用HBSS+（2%FBS）洗细胞（5 min 500g 4°C离心） 6.用预热的DMEM(2%FBS)调整细胞浓度为106/ml 7.分两管，其中一管加入verapamil，verapamil的终浓度为100 μM，封口膜封好37度水 浴10min后，和另一管同时加入Hoechst 33342染色，终浓度5ug/ml ，37度水浴90min，
骨质疏松常见模型(1)
骨质疏松常见模型 1.概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致 骨脆性增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2.临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3.按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性 骨折。依次程度增加。 4.现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原 发性骨质疏松症（primary osteoporosis，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，POMP）和Ⅰ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类 现代医学的研究 1.发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素 导致骨吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2.诊断与治疗：①诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density， BMD）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD的方法有双能X线吸收测定法（DXA）、外周双能X线吸收测定法（pDXA）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准”。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。 此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失。单独使用钙剂是没
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成
第十二章造血干细胞及免疫细胞的生成 免疫细胞都属于血细胞，所有血细胞都来源于造血干细胞。因此在一定意义 上讲，免疫细胞的发育分化就是造血干细胞分化成熟的过程。 第一节 造血干细胞的特性和分化 一、造血干细胞的起源和表面标记 （一）造血干细胞的起源 哺乳动物的造血最早发生在卵黄囊，随后转移到胎肝，胚胎发育中期以后以 及出生后，骨髓成为主要的造血场所，并为B细胞发育的中枢免疫器官；胸腺 是T淋巴细胞的分化成熟的中枢免疫器官。 早期的造血干细胞是多能造血干细胞（pluripotent hematopoietic stem cell）， 具有自我更新（self?renewing）和分化（differentiation）两种重要的潜能，赋予 机体在整个生命过程中始终保持造血能力。多能造血干细胞最初分化为共同淋巴 样祖细胞和共同髓样祖细胞等等。 （二）造血干细胞的表面标记 白细胞分化抗原和单克隆抗体技术的应用，为造血干细胞表面标记的研究及其分离纯化提供了重要的理论和实验依据。人造血干细胞的主要表面标记为CD34和c-kit （CD117），不表达谱系（lineage）特异性标记。 （1）CD34：CD34是一种高度糖基化跨膜蛋白，有1%~4%骨髓细胞表达 CD34，其中包括了造血干细胞，是造血干细胞的一种重要标记，应用CD34单 克隆抗体可从骨髓、胎肝或脐血中分离、富集造血干细胞。随着造血干细胞的分 化成熟，CD34表达水平逐渐下降，成熟血细胞不表达CD34。 （2）CD117：CD117是干细胞因子（stem cell factor，SCF）的受体，是原 癌基因c?kit的编码产物Kit。CD117是属于含有酪氨酸激酶结构的生长因子受体，胞膜外区结构属IgSF。CD117+细胞约占骨髓细胞的1%~4%，50%~70% CD117+骨髓细胞表达CD34，因此，CD117也是多能造血干细胞的重要标记。 （3）Lin－细胞：应用针对T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细 胞、巨核细胞、髓系以及红系等多种谱系相应单克隆抗体的混合抗体（CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A等抗体）结合免
骨质疏松症动物模型的研究进展
科研实践论文 骨质疏松症动物模型构建的研究进展 系（院）：生物科学与工程学院 专业年级：食品质量与安全专业1102班 学生姓名：王晓乐 学号：1112034033 指导老师：郑红星 完成时间：2013年5月21日
骨质疏松症动物模型构建的研究进展 作者：王晓乐 所在单位：（陕理工生物科学与工程学院食品质量与安全专业1102班，陕西汉中723000）指导老师：郑红星 [摘要] 近年常用于骨质疏松的模型动物有大鼠、小鼠、兔、犬、羊、猪等。以大鼠最为常用。用于制模的方法有年龄相关的骨丢失，去势模型,药物类模型，废用性骨质疏松模型，营养类模型等。其中以去势模型，特别是去卵巢动物模型最常用。骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。 [关键字] 骨质疏松；动物模型；研究进展 引言骨质疏松症是可能由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型。 1实验动物 1.1 大鼠 啮齿类动物如大鼠是迄今为止在OP研究中使用最广泛的实验动物，并且美国食品与药品管理局（FDA）也要求治疗OP的药物实验研究采用去卵巢大鼠和另一种非啮齿类动物模型（如狗、猪、羊、灵长目）进行实验。大鼠用于OP研究的优点是：（1）分布广，繁殖快，花费低，体积小，易于饲养和管理。（2）有明显的生长期和成年期，容易观察年龄对骨组织的影响。（3）骨骼系统解剖与人类有众多相似之处。（4）成年大鼠多个部位的松质骨骨量可在一段较长时期内保持稳定，这是研究松质骨重建的合适条件。（5）与人类相似的松质骨分
大鼠骨髓巨噬细胞的分离_纯化_培养以及鉴定_李静
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04 大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定 李静,王亚平 (重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016) =摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。 =关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定 =中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24 Methodology of separation,purification,cultivation an d identification of rat bone marrow macrophage LI Jing,et al (Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage. =Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心 作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士, 主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。