8 第八讲(3) 植物单细胞培养技术概述

3.2 看护培养法
程 序： 3 借助于微型移液管从细胞 悬浮液中提取适量单细胞 悬浮液 ，然后接种在无菌 滤纸上面。 4 将在滤纸上由单细胞形成的 细胞团转移到新鲜的固体培 养基中进行继代培养，获得 由单细胞形成的细胞系。
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为什么有愈伤组织的看护就能进行单细胞培养？
可能的原因是： 1 愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息 2 愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件
2.3 通过原生质体再生法获得单细胞
外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶 等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。
外植体 愈伤组织
酶解
原生质体 再生细胞壁
再生植株
愈伤组织
单细胞悬浮液
3 植物单细胞的培养方法
3.1 平板培养法（1960年，Bergman）
3.2 看护培养法（1954年，Muir ）
原因是什么？
？
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
原因： 植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内 源化合物。
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
如何培养完全孤立的单细胞？
？
3.2 看护培养法
程 序： 1 将生长活跃的愈伤组织接 种在固体培养基上
2 在愈伤组织块上方放置一 片面积为1cm2的无菌滤纸， 滤纸下方紧贴愈伤组织
2.1 从外植体直接分离单细胞 2.2 从愈伤组织分离单细胞 2.3 通过原生质体再生法获得单细胞
2.1 从外植体直接分离单细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经 过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮 液。 悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但 分散性好。
2.2 从愈伤组织分离单细胞
将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细 胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残 渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 为了增强分散效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果 胶粘连在一起的细胞分开。
3.3 微室培养法
程 序： 1 借助于微型移液管从 细胞悬浮液中提取适量单 细胞悬浮液 ，置于一张无 菌载片上。在这滴培养液 四周与之隔一定距离加上 一圈石蜡油，构成微室的 ”围墙”，在围墙左右两 侧再各加一滴石蜡油，每 滴之上置一张盖片作为微 室的“支柱”。
3.3 微室培养法
程 序： 2 将第三张盖片架在两个“支 柱”之间，构成微室的“屋 顶” 3 单细胞悬浮液在微室中
3.1 平板培养法
程 序： 2 单细胞悬浮液的密度调整
要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍 调整方法：①如果密度过大，加入液体培养基进行 稀释； ②如果密度小，通过低速离心使细胞沉 降后，再加入适量液体培养基。
3.1 平板培养法
程 序： 3 固体培养基的配制
当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和 在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合 成培养基 当细胞植板密度过小，细胞对培养基的要求 就变得越加复杂 注意：要选择适合单细胞培养的培养基
程 序： 6 继代培养
选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可 以获得由单细胞形成的细胞系。
初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响
用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率 来表示 。
植板效率=每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总 数×100%
如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的 初始密度为1 ×104或1 ×105个/ml，植板后由相邻细 胞形成的细胞群落常混在一起。 如果降低植板密度或完全孤立地培养单细胞，则 可避免这个问题。但是当低于临界密度时，细胞就不 能分裂。
植物单细胞培养技术
周口师范学院生命科学系
1 植物单细胞培养的意义
1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁 殖情况； 1.2 有利于获得纯细胞系； 1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代 谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。
2 植物单细胞的分离技术
3.1 平板培养法
程 序： 4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合
①当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很 薄一层(1mm)培养基中 ②在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。
3.1 平板培养法
程 序： 5 暗培养
注意： 培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生 长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。
3.1 平板培养法
小 结：
通过这一节课 的学习，我们要掌握的知识点： 1 植物单细胞的获得方法 2 植物单细胞的培养技术
思考：
1 简述植物单细胞平板培养操 作过程 2 在进行植物单细胞培养时， 细胞密度过大或过小会对 培养结果产生什么影响？
3.3 微室培养法（1960年，Jones）
3.1 平板培养法
程 序：
1 单细胞悬浮液的制备 2 单细胞悬浮液的密度调整
4 单细胞悬浮液与固体 培养基等量混合
3 固体培养基的配制
5 暗培养
6 继代培养
3.1 平板培养法
程 序： 1 单细胞悬浮液的制备 单细胞来源： 外植体(叶肉细胞) 愈伤组织 原生质体
4 当细胞团长到一定大小时揭 掉盖片，把细胞团转移到 新鲜培养基上培养
微室培养图示：
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养 液
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
平视图
置培养皿中26～28 ℃ 恒温培养
微室培养的优点： ①有利于对细胞特性的研 究 ②有利于对单个细胞的生 长、分裂、分化等情况进行 全程跟踪研究。