6 蛋白质空间结构研究方法

扫描隧道显微技术（ （五） 扫描隧道显微技术（STM， ， scanning tunneling microscope）： ）：
• 原理：量子理论中的隧道效应。 原理：量子理论中的隧道效应。 将原子线度的探针和被测物质表面作为两个电极， 将原子线度的探针和被测物质表面作为两个电极， 当两者距离小于1nm时，电子在外加电场的作用下将 当两者距离小于 时 穿过其间的势垒到达另一极—— 隧道效应。 隧道效应。 穿过其间的势垒到达另一极 • 隧道电流强度对两极间距敏感 距离 隧道电流强度对两极间距敏感,距离 减小0.1nm，电流增加一个数量级 减小 ， • 测定方式：恒电流模式；恒高度模式 测定方式：恒电流模式；
பைடு நூலகம்
• CD谱一般在两个区域： 谱一般在两个区域： 谱一般在两个区域 远紫外区： ① 远紫外区： 190 ~225nm附近为肽基 附近为肽基 的吸收，因此远紫外区 谱 的吸收，因此远紫外区CD谱 呈现的是肽骨架的构象。 呈现的是肽骨架的构象。 肽骨架的构象 ② 近紫外区： 近紫外区 侧链的构象有关。 与aa侧链的构象有关。 侧链的构象有关 在不同情况下，-S-S-，Trp ， 在不同情况下， ， Tyr，Phe等会出现不同的峰形， ， 等会出现不同的峰形， 等会出现不同的峰形 可灵敏的反映出蛋白质的细微 构象变化。 构象变化。 0 [θ] α-helix coil
A
• 紫外差光谱 (differential spectrum): 不同条件下（ 不同条件下（发色 基团微环境变化），两个 基团微环境变化），两个 ）， 光谱之差。 光谱之差。
β-sheet coil
α -helix
λ（nm） ）
（二） 荧光光谱法 （fluorescence spectrum):
一 溶液中蛋白质分子构象 的研究方法: 的研究方法:
• 利用各种光谱学方法测定不同条件下蛋白质溶液光谱性质的差 来确定其构象， 异，来确定其构象，以及与功能的关系 用不同波长光照射蛋白，检测透光强度， （一）吸收光谱：用不同波长光照射蛋白，检测透光强度， 以吸光度A 波长λ作图 常温， 作图。 以吸光度 ~ 波长 作图。常温，低温 • 蛋白质吸收来自两个部分： 蛋白质吸收来自两个部分： 可见光区(400-770nm)：来自配基，如Cytc ：来自配基， 可见光区 Trp = 280nm 紫外区(200-400nm) ：蛋白本身 Tyr = 275nm 紫外区 Phe = 257nm •可见光吸收谱，紫外吸收光谱 可见光吸收谱， 可见光吸收谱 肽基团=190~225nm 肽基团
• NMR类型： 类型： 类型 1H-NMR；13C-NMR等 ； 等 一维谱: 吸收峰强度对一个频率变量作图 一维谱 多维谱（二维、三维） 多维谱（二维、三维） • NMR技术在测定生物大分子结构方面的优点 技术在测定生物大分子结构方面的优点: 技术在测定生物大分子结构方面的优点 ① 不破坏生物分子的结构 能在溶液环境下测定大分子空间结构，测定结构更 ② 能在溶液环境下测定大分子空间结构，测定结构更 接近生物分子的天然状态 ③ 能研究大分子内部的构象动力学 分辨率较高， ④ 分辨率较高，是测定溶液中大分子构象的最佳的方 法，与X-光晶体衍射法互为补充 光晶体衍射法互为补充
(2) NMR谱与分子结构的关系： 谱与分子结构的关系： 谱与分子结构的关系
• 化学位移 : 电子云 → 感生磁场 →对核形成屏蔽 对核形成屏蔽 由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用， 由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用，引起共振时 外加磁场强度的移动。 外加磁场强度的移动。 化学位移大小反映出原子核所处的化学环境、 化学位移大小反映出原子核所处的化学环境、在分子 中的排布， 中的排布，从而确定基团的性质 • 自旋耦合： 自旋耦合： 自旋核的磁距通过成键电子影响邻近的核， 自旋核的磁距通过成键电子影响邻近的核，引起 后者共振谱线分裂而增多，这种相互作用——自旋耦合 自旋耦合 后者共振谱线分裂而增多，这种相互作用 • 产生核磁共振的方法： 产生核磁共振的方法： 扫描频率：固定外加磁场， 扫描频率：固定外加磁场，改变射频电磁波频率 磁场扫描：固定射频电磁波频率， 磁场扫描：固定射频电磁波频率，改变外加磁场强度
恒高度 恒电流
S
• 缺点 ① 有时分辨率低 对蛋白表面 缺点: 有时分辨率低(对蛋白表面 沟槽探测不清) 沟槽探测不清 要求样品要有电导率； ② 要求样品要有电导率；否则 需要覆盖导电层 • STM技术优点： 技术优点： 技术优点 能在高分辨率下（原子级） ① 能在高分辨率下（原子级）观察样品的实三维结构 可适用于不同的探测环境： ② STM可适用于不同的探测环境： 可适用于不同的探测环境 固体或液体；低温或常温； 固体或液体；低温或常温；常压 可以大幅度改变视野范围， ③ 可以大幅度改变视野范围，研究不同层次的生命结构 • STM技术研究进展 技术研究进展: 技术研究进展 原子力显微镜（ ）；扫描离子电导显微镜 原子力显微镜（AFM）；扫描离子电导显微镜（SICM） ）；扫描离子电导显微镜（ ） 摩擦力显微镜（ ）；光子扫描隧道显微镜 摩擦力显微镜（LFM）；光子扫描隧道显微镜（PSTM） ）；光子扫描隧道显微镜（ ）
长轴
• 圆二色谱 圆二色谱(CD) ： 摩尔椭圆度[θ] ∆ε ~λ 或 摩尔椭圆度 ~ λ 作图 λ • 光源→ 自然光 光源→
单色器
单色光
起偏振器
平面偏光
电光调制器
左、右园偏振光
→照射样品→记录 照射样品→ • CD谱应用：游离aa 无圆二色性，所以 谱应用：游离 无圆二色性， 谱应用 CD谱只与构象有关。 谱只与构象有关。 谱只与构象有关
215 209 222 λ(nm)
β-sheet
多聚Lys的远紫外 谱 的远紫外CD谱 多聚 的远紫外
（四） 核磁共振 (NMR， nuclear ， magnetic resonance ) ：
(1) 原理 原理: 自旋量子数I≠0的原子核可旋转并带电，因此而产 的原子核可旋转并带电， 自旋量子数 的原子核可旋转并带电 生磁矩 (µ)，在外加电场作用下沿磁场方向取向，同时 µ ，在外加电场作用下沿磁场方向取向， 发生能级分裂（占有能级数为 ），相邻能级能量 发生能级分裂（占有能级数为2I+1），相邻能级能量 ）， 差都是△ 当能量为△ 差都是△E 。 当能量为△E=hν电磁波通过时，低能核 ν电磁波通过时， 可吸收电磁波而产生跃迁—— 核磁共振 可吸收电磁波而产生跃迁
最大发射波长
λmax λ(nm)
旋光色散谱(ORD)及圆二色谱 及圆二色谱(CD) （三） 旋光色散谱 及圆二色谱
(1 ) 原理 原理: • 偏振面：电场矢量的平面。 偏振面：电场矢量的平面。 • 平面偏振光（ plane polarized light )： 平面偏振光（ ： 仅在固定方向上有振动的光。 仅在固定方向上有振动的光。 • 圆偏振光：两个电场矢量互相垂直、位相相差1/4的平面偏 圆偏振光：两个电场矢量互相垂直、位相相差 的平面偏 振光加成的光，电场矢量的尖端沿螺旋线前进， 振光加成的光，电场矢量的尖端沿螺旋线前进，从光的传 播方向看好似做圆周运动——circularly polarized light 播方向看好似做圆周运动 • 右圆偏振光：面对光源 右圆偏振光： 电场矢量顺时针转动 左圆偏振光： 左圆偏振光：面对光源 电场矢量逆时针转动
第二节 蛋白质空间结构 研究方法
• 生物系统复杂的层次： 生物系统复杂的层次：
分子→细胞→组织→器官→ 分子→细胞→组织→器官→系统 →个体→种群→群落→生态系统→生物圈 个体→种群→群落→生态系统→ • 结构生物学： 结构生物学： 针对生物系统的不同层次进行研究 • 结构分子生物学： 结构分子生物学： 研究生物大分子的三维结构与功能。 研究生物大分子的三维结构与功能。以生物大分子结 构及其运动的测定为基础，阐明生物分子的功能， 构及其运动的测定为基础，阐明生物分子的功能，并进 而解释生命现象的科学 • 蛋白质构象测定思路： 蛋白质构象测定思路： 通过探索蛋白质在结构变化过程中的各种光学、物 通过探索蛋白质在结构变化过程中的各种光学、 理学等特征的变化， 理学等特征的变化，了解结构信息
• 有些物质吸收入射光后经过一段很短时间 有些物质吸收入射光后经过一段很短时间, （10 - 9 ~10 - 8 s）又发射出波长比原来长的光 ）又发射出波长比原来长的光——荧光 荧光 • 激发能的耗散：①热运动 激发能的耗散： ② 传递给相邻分子 ③发荧光形式 • 蛋白自身的荧光 λTrp = 348nm； λPhe = 282nm； 蛋白自身的荧光: ； ； λTyr = 303nm 配基的荧光: 如叶绿素， 配基的荧光 如叶绿素，FAD、藻胆素等 、 结合人工荧光探针的荧光 Trp = 280nm • 量子产率（量）： Q = 发射的荧光光子数 量子产率（
入
E
H
传播方向
(2) ORD谱： 谱 • 一束光通过物质时可产生两种效应： 一束光通过物质时可产生两种效应： 折射——光转播速度降低 ①折射 光转播速度降低 吸收——振幅降低 ②吸收 振幅降低 • 旋光性 一束平面偏振光透过旋光物质时 旋光性: 若对左、右圆偏振光折射不同， 若对左、右圆偏振光折射不同，偏振面旋转 旋光率：一束平面偏振光透过1dm(d)厚，浓度 旋光率：一束平面偏振光透过 厚 浓度1g/ml(C)的 的 溶液时，偏振面旋转的角度。 溶液时，偏振面旋转的角度。α = [αλ] · d ·C • 旋光色散（ORD，optical rotatory dispersion）： 旋光色散（ ， ）： 旋光率随平面偏振光的波长不同而变化的光学现象 随平面偏振光的波长不同而变化的光学现象。 旋光率随平面偏振光的波长不同而变化的光学现象。 • 旋光色散谱（ORD谱）： [αλ] ~ λ图 旋光色散谱（ 谱 • ORD谱应用：构成蛋白质的aa是左旋的，肽链形成α-helix 谱应用：构成蛋白质的 是左旋的 肽链形成α 是左旋的， 则产生右旋， 多肽链的旋光率 则产生右旋，在500~700nm多肽链的旋光率随波长不同而 多肽链的旋光率随波长不同而 变化，根据产生的ORD谱可计算α-helix所占的比例 谱可计算α 变化，根据产生的 谱可计算 所占的比例
（3） 圆二色谱 ） 圆二色谱(CD) • 圆二色性（ CD， circular dichroism） 圆二色性（ ， ） 旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同， 旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同， 导致振幅变化， 导致振幅变化，从而产生 EL 椭圆偏振光的现象 的现象。 椭圆偏振光的现象。
ER
• CD有两种表示方法： 有两种表示方法： 有两种表示方法 若以消光系数表示 表示： ①若以消光系数表示： △ ε > 0，正圆二色性 ， △ε=εL －εR △ ε < 0，负圆二色性 ， 若以椭圆度表示： ② 若以椭圆度表示： 椭圆度θ=arctg 短轴 椭圆度
• •
λmax：最大吸收峰对应的波长 ε：摩尔消光系数 经验规律: 经验规律 从极性环境→ ① Trp, Tyr, Phe, His, 从极性环境→ 溶剂微扰差光谱 非极性环境， 紫外区ε 非极性环境， 紫外区ε和λmax都增大 都增大 咪唑基， ② Tyr-OH，Cys-SH，His-咪唑基，因PH变化而带上 ， ， 咪唑基 变化而带上 PH差光谱 PH差光谱 电荷后， 电荷后， ε 和λmax 都增大 ③ 蛋白的结构状态影响吸收峰形： 变性差光谱 蛋白的结构状态影响吸收峰形：
吸收的光子数
Tyr = 275nm Phe= 257nm
• 蛋白自身荧光测定经验规律： 蛋白自身荧光测定经验规律： ①除非蛋白自身带有配基或荧光探针 否则蛋白荧光都来自Trp、Phe、Tyr 否则蛋白荧光都来自 、 、 蛋白所处的溶液环境发生变化，如极性→ ② 蛋白所处的溶液环境发生变化，如极性→非极性 λmax 变短，荧光强度增强 变短， ③ Trp，Tyr可被某些熄灭剂 (I¯，硝酸盐 ) 熄灭 ， 可被某些熄灭剂 ， 处于极性环境下： ④ Trp，Tyr 处于极性环境下：温度降低 ， Q(量子产率 降低，非极性环境下不受影响 量子产率) 量子产率 降低， 最大吸收波长 • 荧光谱类型： 荧光谱类型： 相 对 ① 荧光发射光谱 : 以特定波长的激发光来 应 照射荧光物质，测不同波长下荧光强度。 照射荧光物质，测不同波长下荧光强度。 光 荧光激发光谱： ② 荧光激发光谱：不同波长的光照射荧光 强 度 物质， 物质，在特定波长下检测荧光强度