试验动物与细胞系

尾加压素II在2型糖尿病小鼠骨骼肌组织

中的表达情况

作者:张思凡

单位:北京市陈经纶中学

辅导老师: 黄臣田超

指导专家:王学江

目录

摘要 (2)

前言 (3)

实验目的 (3)

材料与方法 (4)

实验结果 ........................................... 错误！未定义书签。讨论 . (9)

结论 (11)

参考文献 ........................................... 错误！未定义书签。附录 ............................................... 错误！未定义书签。致谢 ............................................... 错误！未定义书签。

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摘要

目的探讨T2DM时小鼠骨骼肌组织UII/UT系统的表达变化情况。

方法采用免疫组化、RT-PCR实验观察骨骼肌组织中UII/UT系统的表达；采用血糖测定仪检测2型糖尿病的特征。

结果 1. 在遗传性2型糖尿病小鼠模型上，证实2型糖尿病小鼠骨骼肌组织中UII/UT系统高表达。用放免法测定到2型糖尿病小鼠血浆UII含量明显高于对照小鼠；骨骼肌组织UII含量和释放到孵育液中的UII含量分别较对照动物高；免疫组化染色发现T2DM小鼠骨骼肌组织中UII的含量较对照组增高。

结论 1. 2型糖尿病小鼠骨骼肌UII/UT系统上调。

2. UII抑制胰岛素刺激的骨骼肌的糖摄入，提示骨骼肌UII可能以旁/自分泌方式作用于骨骼肌参与了胰岛素抵抗的发病

关键词尾加压素II；2型糖尿病；胰岛素抵抗

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前言

胰岛素抵抗指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要表现之一，主要是肝脏、肌肉和脂肪组织对胰岛素的敏感性和反应性降低。胰岛素抵抗发病机制目前并不完全清楚，不仅与遗传因素高度相关，而且与胰岛素信号传导缺陷、多种脂肪源性细胞因子表达异常、物质代谢异常、炎症介质和氧化应激等诸多因素有关。越来越多的研究提示血管活性因子、尤其是缩血管因子的调节紊乱参与胰岛素抵抗及糖尿病的发病，如血管紧张素II、内皮素等。尾加压素II也是体内重要的血管活性肽，具有与内皮素相似或更强的收缩血管和促进血管平滑肌细胞增殖效应。

尾加压素II最早是从鱼的脊髓尾部下垂体中分离出的生长抑素样环肽，后证实从软体动物到哺乳动物的神经系统均存在UII，并且目前已经从人体中克隆出来。UII的特异性受体是人体内一种孤立的G蛋白耦联受体，又称为UT。UII与UT结合后引起一系列生物学效应，参与多种疾病的发生。例如，在中枢神经系统中，可以引起交感神经兴奋，释放肾上腺素和促肾上腺皮质激素，对心率、呼吸和血压也具有一定的调节作用。在心血管系统，UII可以引起冠状动脉收缩和反射性心动过速。在外周血管中，UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，可引起内皮炎症，导致内皮损伤。在肾脏，UII可以减少肾脏血流，使上皮细胞增殖。近来研究发现，UII对胰腺也具有一定的作用，可以减少胰岛素的分泌。

由于UII是迄今为止发现的最强的缩血管物质，因此人们对它的研究最初主要集中在心血管方面。在心血管系统中，UII参与了心力衰竭和心肌肥大，冠心病和冠状动脉粥样硬化，肾功能衰竭等这些疾病。近年大量实验资料显示UII还参与糖代谢的调节、在糖尿病及其并发症的发病中具有重要作用，尤其是2型糖尿病。2型糖尿病占糖尿病总数的90%以上，它的发生主要与胰岛素抵抗有关。

目前有大量数据表明炎症因子是骨骼肌胰岛素抵抗的一个病因，而它与骨骼肌中UII/UT系统有何关系并不清楚。本工作旨在观察T2DM时骨骼肌组织中UII/UT系统内源性表达的变化及其意义，及影响这种表达的因素。

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实验材料与方法

一、实验动物与细胞系

KK小鼠是日本学者培育的一种轻度肥胖型T2DM动物，KK小鼠有明显的多食，从5周龄起，血糖、血胰岛素水平逐步升高，1岁龄时，多食、高血糖、高胰岛素血症、肥胖及肝脏对胰岛素的敏感性可自发恢复正常，但其生命明显缩短。对照组小鼠（C57BL/6J）体重20-30g，12周龄。所有小鼠实验当日清晨空腹自尾静脉采血测定其空腹血糖，随后自由饮食，1-2小时后测其随机血糖。分离双下肢的比目鱼肌，用中性福尔马林固定用于免疫组化。

肌原细胞C2C12细胞株购自中国医学科学院基础研究所。

二、主要试剂和仪器（表1、表2）

表1 主要试剂

Table 1 Main regents

试剂生产厂家

DMEM高糖培养基美国Hyclone公司

特级胎牛血清美国Gibco公司

青霉素-链霉素溶液美国Gibco公司

胰蛋白酶(trypsin) 美国Gibco公司

二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司

UII放免试剂盒UII多克隆一抗UII多肽Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals Honenix Pharmaceuticals

山羊抗兔IgG 北京中杉金桥生物技术有限公司DAB染色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司

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表2 主要仪器

Table 2 Main instruments

仪器

生产厂家 电子天平

德国Sartorius 公司 超速低温离心机

美国Sigma 公司 紫外可见分光光度计

Unico 公司 二氧化碳培养箱

美国Revco 公司 PB-600 型恒温水浴箱

BOEKELScientific 倒置显微镜

日本Olympus 公司 石蜡切片机

北京东方仪器厂 制冰机

日本三洋公司 pH 计

德国Sartorius 公司 超纯水制备装置

美国Millipore 公司 微量移液器

德国Eppendorf 公司 超净工作台

硝酸纤维素膜 天津泰斯特公司 Waters 公司

二、实验方法

1．C2C12细胞的培养及传代

该细胞系用含15%胎牛血清，青霉素100 U/ml ，链霉素100 U/ml 的高糖

DMEM