腺相关病毒细胞感染手册

腺相关病毒（AAV）感染目的细胞

腺相关病毒（AAV）感染目的细胞

一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介

腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图1.AA V基因结构

二、腺相关病毒的优点

1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；

2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；

3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；

4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；

5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；

三、重组腺相关病毒载体不同血清型

研究发现AA V具有多种血清型，各种不同血清型的AA V载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。

四、AAV感染目的细胞

不同的AAV血清型对不同的细胞有相对的亲和力，因此，对于AAV来说，不同类型的细胞的侵染实验，首先需要确定合适的AAV 血清型，在此基础上进行最适MOI的摸索。

（一）关于最适血清型摸索

下图以AAV-2为标准侵染分数（100分），给出了不同的AAV 血清型对于不同细胞的侵染能力，比如Huh-7，DJ型为500，意味着DJ对与Huh-7的侵染能力是AAV-2的5倍，部分细胞的侵染血清型确定可根据下表来确定，但我们仍建议在进行正式实验之前，进行最适血清型的预实验摸索。大部分细胞来说，AAV-DJ是AAV血清型里侵染细胞能力最强的一组血清型。

（二）关于最适MOI摸索

MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI越高，AAV病毒感染后宿主细胞内保留的腺病毒基因组数量以及目的蛋白的表达量越高。

AAV对离体细胞的感染能力比较有限，所需病毒MOI大于104，

通过选择合适的血清型并使用合适的病毒感染MOI仍然可以达到一定的感染效果。

AAV病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。每种细胞对应每种类型的病毒都应该进行最适MOI摸索实验，设置MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。AAV细胞感染的MOI一般以104：105：106进行梯度摸索。

（三）感染步骤：

1.细胞培养：

将状态良好的目的细胞接种到细胞培养皿中，尽量使用小孔培养皿（24孔板或者48孔板），接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。

2.MOI对应病毒体积的换算

转染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数=病毒个数/病毒滴度。

例子：转染细胞数为105个，MOI为105，则需要病毒的个数为1010个，病毒如果滴度为1012v.g/ml，则需要加入的病毒体积为1010/（1012v.g/ml）=10-2ml=10ul。

3.AAV感染目的细胞

感染实验分为两组，分别添加相应目的的AAV和等滴度同体积的对照AAV，1/2体积培养液感染（详见下表格）。加入的病毒量范围推荐MOI为=104；105；106内。1/2体积感染2小时后，不换液，追

加1/2新鲜培液，继续37度感染过夜。感染12-24小时候换新鲜培液。

病毒小培养体积感染表

培养皿类型表面积

/cm2

对应细胞培养液体积病毒感染对应细胞培

养液体积

96-well0.3cm2100ul50ul

24-well2cm2500ul250ul

12-well4cm21ml500ul

6-well10cm22ml1ml

60mm20cm24ml2ml

100mm60cm210ml5ml

腺病毒感染4小时后补足至培养体积，感染24小时后换液，腺病毒感染2小时后

直接换液

5、观察感染情况

感染72-96小时后，可以开始观察到GFP/RFP表达（只对于有GFP/RFP独立表达框的AAV），过表达和干扰的感染时间以96小时以上实验为最佳，也有细胞需要延长至1-2周左右观察。

（四）关于提高AAV感染效率的方法

1.Polybrene

Polybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高腺相关病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高部分细胞感染效率2～10倍。

对于polybrene适用的细胞，1/2体积感染的培液中，polybrene

浓度为固定值（5～8ug/ml,我们建议5ug/ml即可）；如2小时后停

止感染置换新鲜培液，则无需再加入polybrene（针对上述增殖能力

弱的细胞）；如2小时1/2体积感染后继续追加培液感染过夜，则补

充的新鲜培液中要含有等终浓度的polybrene。

2.腺病毒助染