PCR_荧光探针法快速检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌
三种检测方法诊断分枝杆菌感染的效果分析
结核病是由结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒ⁃
杆菌（ｎｏｎｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，ＮＴＭ） 引起的疾病
最多的单一病原体所致的传染病，也是全球十大死因
果不能及时准确鉴定极易造成误诊［２］ ，并且大多数
ｃｕｌｏｓｉｓ，ＭＴＢ）引起的一种慢性疾病，是全球死亡人数
素（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＦＡＭ） 和六氯荧光素（ ｈｅｘａｃｈｌｏ⁃
ｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＨＥＸ）通道，荧光采集点选择 ６０ ℃ ３０ ｓ。
样本扩增曲线呈 Ｓ 型，且循环阈值（ Ｃｔ 值） ＜ ４０ 判定
为阳性，扩增曲线不呈 Ｓ 型或 Ｃｔ 值≥４０（或无任何数
值）判定为阴性。 ＦＡＭ 通道阳性，ＨＥＸ 通道阳性或阴
ＰＢＳ） 至约 ５０ ｍｌ，盖紧盖子，混合后以 ３ ０００ ｇ 离心
１５ ｍｉｎ，去上清液，加 １ ～ ３ ｍｌ ＰＢＳ 悬浮沉淀，加 ０ ５ ｍｌ
悬浮液至提前加入 ０ ８ ｍｌ 分枝杆菌培养添加剂的分
枝杆菌培养管中，使用 ＢＡＣＴＥＣ ＴＭ ＭＧＩＴ ＴＭ ９６０ 全自
动分枝杆菌培养监测仪进行检测。 仪器报阳后用萋
１ ４ ２ ＰＣＲ⁃荧光探针法 严格按照试剂说明书进
行操作，首先在无菌杯内加入等量的 ４％ ＮａＯＨ 溶
ｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ １０４ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ
ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅ， ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＢＤ９６０ ｌｉｑｕｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ
荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药情况的研究
结核与肺部疾病杂志2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020. Vol. 1，No. 3• 245 ••论著•荧光P C R探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌 对利福平和异烟肼耐药情况的研究【摘要】目的评价荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction.PC R)探针熔解曲线法（简称“培解曲线法”)检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药的情况。
方法对832例涂阳肺结核患者的痰标本进行BACTEC M GIT 960(简称“M GIT 960”)液体培养,结果显示污染35例.培养阴性52例，培养阳性745例，对培养阳性的745 份培养物进行菌种鉴定(基因芯片法），其中混合感染7例，非结核分枝杆菌60例，结核分枝杆菌复合群678例;对 鉴定为结核分枝杆菌复合群的678例患者标本采用M GIT 960液体培养药物敏感性试验(简称“M G1T 960药敏试 验”)和熔解曲线法进行利福平和异烟肼耐药基因检测。
熔解曲线法检测对利福平是否耐药的结果无效(无法判断是否耐药)31例，检测对异烟肼是否耐药的结果无效34例，剩余639例利福平和异烟肼同时检测结果有效。
以MGIT 960液体药敏试验为参考标准，分析熔解曲线法检测耐药基因的效果。
结果以M GIT 960液体药敏试验结果为参考标准,639例患者的样本进行利福平和异烟肼熔解曲线法耐药性检测，对利福平耐药性检测的符合率为96.2%(615/639)，敏感度和特异度分别为93.3%(126/135)和97.0%(489/504),阳性预测值和阴性预测值分别为89. 4%(126/141)和98.2%(489/498)，尺<2沙2值为0.89;对异烟肼耐药性检测的符合率为93. 6%(598/639)，敏感度和特异度分别为83. 1%(157/189)和98.0%(441/450),阳性预测值和阴性预测值分别为94.6%(157/166)和93.2%(«1A丨73). 值为0.84。
T细胞检测和荧光PCR检测在结核分枝杆菌检测中的比较
T细胞检测和荧光PCR检测在结核分枝杆菌检测中的比较杨玉前【摘要】Objective To compare the sensitivity and specificity between T cell assay and fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis, and the application prospect in grassroot work of tuberculosis control and prevention. Methods Fluorescent PCR assay was used to detect the Mycobacterium tuberculosis in 194 fasting sputum specimens of suspected or con-firmed active tuberculosis collected from October the first 2013 to October the first 2014, and the results were compared with those of blood T cell assay. Results The positive rate of fluorescent PCR assay and T cell assay for the detection of Mycobacterium tu-berculosis was 12.9% and 7.7%, respectively, the diagnosis rate was 56% and 93.3%, respectively. Conclusion The specificity of T cell assay is higher while the sensitivity is poorer compared to the fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tu-berculosis. As there are various interfering factors existing in the clinical practice, combinative application of the two methods can improve the early diagnosis rate of tuberculosis.%目的：比较T细胞检测和荧光PCR检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性，及在基层结核病防治工作中的应用前景。
微生物学检验知识点第一部分
【微生物学检验】知识点整理（第一部分）简述致病菌引起全身感染后，常见的几种类型？答：①毒血症②菌血症③败血症④内毒素血症⑤脓毒血症试述构成细菌侵袭力的物质基础。
答：①荚膜②黏附素③侵袭性物质简述病原菌感染机体后，机体如何发挥抗菌免疫功能？答：首先遇到机体的非特异性免疫包括皮肤与粘膜构成的屏障结构，血脑屏障，胎盘屏障及吞噬细胞对细菌的非特异性的吞噬和体液中杀菌抑菌物质对细菌的攻击。
7-10天后，机体产生特异的细胞免疫和体液免疫与非特异性免疫一起杀灭病原菌简述细菌耐药性产生的主要机制。
答：①钝化酶的产生②药物作用靶位发生改变③胞壁通透性的改变和主动外排机制④抗菌药物的不合理使用形成了抗菌药物的选择压力，在这种压力的作用下，原来只占很少比例的耐药菌株被保留下来，并不断扩大。
举例说明细菌命名的原则。
答：细菌的命名一般采用国际上通用的拉丁文双命名法。
一个细菌种的学名由两个拉丁字组成，属名在前，用名词，首字母大写；种名在后，用形容词，首字母小写；两者均用斜体字。
中文译名种名在前，属名在后。
如Mycobaterium tuberculosis （结核分枝杆菌）。
属名亦可不将全文写出，只用第一个大写字母代表，如M. tuberculosis 如何确定从标本中分离的细菌为葡萄球菌？并确定其有无致病性。
答：①直接镜检，经革兰染色后镜检发现革兰染色阳性呈葡萄状排列的球菌，可初步报告疑为葡萄球菌，需进一步分离培养鉴定。
②分离培养：血培养需经增菌后转种血平板进一步鉴定，若无细菌生长，需连续观察7天，并以血平板确定有无细菌的生长。
脓液、尿道分泌物、脑脊液沉淀物可直接接种血平板，37℃过夜，可形成直径约2-3mm、产生不同色素的菌落。
金葡菌菌落周围有透明溶血环。
③试验鉴定：血浆凝固酶试验，甘露醇发酵试验，耐热核酸酶试验，肠毒素测定，SPA检测。
致病性葡萄球菌菌落周围有透明溶血环，血浆凝固酶试验阳性，甘露醇发酵试验阳性，耐热核酸酶试验阳性，SPA检测有A蛋白的存在。
浙江医学初级继教（传染病）
浙江医学初级继教（传染病）浙江医学初级继教(传染病）1、医务⼈员的防护要点不包括哪项？AA、接诊发热筛查患者的医务⼈员要着⼆级防护B、防护⼝罩可持续应⽤4-6⼩时，污染或潮湿及时更换C、医护⼈员应避免疲劳⼯作，以免抵抗⼒降低，成为易感⼈群D、隔离⾐或防护服被患者⾎液、体液污染时应更换2、哪些内容不是⼆级防护的要求？BA、穿防护服B、全⾯型呼吸防护器C、穿防⽔隔离⾐D、穿鞋套3、哪些不属于特别重⼤的突发公共卫⽣事件？DA、肺⿏疫、肺炭疽在⼤、中城市发⽣并有扩散趋势，或肺⿏疫、肺炭疽疫情波及2个以上的省份，并有进⼀步扩散趋势B、发⽣传染性⾮典型肺炎、⼈感染⾼致病性禽流感病例，并有扩散趋势C、发⽣烈性病菌株、毒株、致病因⼦等丢失事件D、发⽣重⼤医源性感染事件4、哪些不是新发突发传染病的特点？DA、来势凶B、传播快C、范围⼴D、不易造成巨⼤的经济损失和社会影响5、下列哪种疾病不属于新发突发及输⼊性传染病？DA、甲型H1N1流感B、H7N9禽流感1、艾滋病个案管理的初次评估包括：DA、审核、签署知情同意书B、建病例C、初次评估了解患者⽣理、⼼理、社会情况D、以上均是2、我国艾滋病个案管理内容包括：DA、收案基本信息登记表B、治疗前咨询记录表C、在治随访登记表D、以上均是3、台湾艾滋病个案管理包括DA、危险⾏为评估和初步诊断B、追踪HIV疾病治疗状况及降低危害的计划C、整合资源、服务与后续追踪D、以上均是4、结案评估包括：DA、服药依从性判断B、cd4恢复情况、病毒载量C、是否感染性病和治疗恢复情况D、以上均是5、关于艾滋病个案管理师，需要具备哪些条件？DB、熟练的咨询技巧C、更新艾滋病治疗及医学知识D、以上均是1、HCV/HIV共感染治疗的最佳选择是：DA、NVPB、替诺福韦C、⽀持对症治疗D、⽆⼲扰素治疗⽅案2、HIV与HBV或HCV共感染的特点是：EA、传播途径相同B、共感染率⾼C、疾病进展加快D、抗病毒治疗有效E、以上都是3、母婴传播率最⾼的是：BA、HIVB、HBVC、HCVD、HDV4、HIV感染者死亡的重要原因是：DA、咯⾎B、病毒感染C、全⾝中毒症状D、HBV及HCV造成的慢性肝病5、下列有关抗病毒药物的说法错误的是DA、缩短病程、减少病毒排放D、改变复发频率与特点1、全球每年的黄热病病例中，有90%以上发⽣在（）CA、越南B、巴基斯坦C、⾮洲D、印度尼西亚2、关于黄病毒的抵抗⼒，下列哪种说法是错误的：BA、寨卡病毒不耐酸B、寨卡病毒耐热C、寨卡病毒对常⽤消毒剂敏感D、寨卡病毒不耐紫外线3、下列哪个靶器官不是黄热病毒感染的靶器官：DA、肝脏B、肾脏C、⼼肌D、⾻关节4、黄病毒感染的哪个期最有迷惑性：BA、感染期B、缓解期C、中毒期D、恢复期5、黄热病是由埃及伊蚊传播引起的急性传染病，（）以上病例发⽣在⾮洲CB、80%C、90%D、100%1、埃博拉出⾎热最主要的传播途径为：CA、性传播B、空⽓传播C、接触传播2、下列哪种⽅式是埃博拉病毒的主要传播⽅式：CA、呼吸道B、消化道C、直接接触D、蚊媒传播3、下列哪个靶器官不是黄热病毒感染的靶器官：DA、肝脏B、肾上腺C、淋巴结D、⼼脏4、回顾性分析2014年西⾮埃博拉暴发疫情的粗死亡率是：CA、0.8B、0.6C、0.4D、0.25、使⽤R0指数来评价埃博拉的传播⼒，下列哪项是正确的：BD、431981、传染病信息报告中规定的甲、⼄、丙类及重点监测的传染病报告时限分别是（C）A、2⼩时、6⼩时、24⼩时。
结核_非结核分枝杆菌核酸快速检测方法临床应用价值_康丽军
Key words :Mycobacteri u m t ubercul osis ;my co bacterum ;nucleic acids ;polym erase chain reacti on Correspondence to :H o ng Feng (hongfeng @bjhb .go v .cn)
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2011 年 5 月 第 33 卷 第 5 期
结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的疾病 ; 而非结核分枝杆菌则引起 N T M 病 。由于结核病和 NT M 病两者在发病 、临床表现 、影像学 、涂 片和培 养 、结核菌素试验 、病理学检查等方面均十分相似 , 临床上很难进行区分诊断 , 只能从标本中分离出分 枝杆菌 , 作菌种鉴定 , 才能确诊 。而菌种鉴定往往需 要 1 ～ 2 个月的时间 , 由于两种病的治疗方案不同 , 这样会延误对病人的诊断和治疗 , 同时也造成不必 要的经济损失 。 随着分子生物学技术的引进 , 一些 快速 、简单准确的方法 已应用于实验 室 , 如常 用的 H P LC 是通过分析分枝杆菌细胞壁的特异性成分结 核菌脂酸(mycolic acid)和 β-羟基-α脂肪酸 的不同 鉴定分枝杆菌 , 核酸的直接测序方法等国内外都有 相关报道 , 并使分枝杆菌感染流行病方面长期存在 的问题迎刃而解 , 但未见在 1 支管内同时能够检测 结核/ 非结核分枝杆菌核酸的方法 。我们采用实时 荧光 PC R[ 1 -3] 技术对本院收集的临 床标本 , 在每 1 支管内同时检测结核/ 非结核分枝杆菌核酸 , 并对其 应用价值进行评价 。
三种检测技术鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的效能评价
•240 •结核与肺部疾病杂志 2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020, Vol. 1，No. 3•论著.三种检测技术鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的效能评价易俊莉杨新宇张洁田丽丽丁北川武文清【摘要1目的评价对硝基苯甲酸/噻吩-2-竣酸肼（PNB/T C H)生长试验法、结核分枝杆菌抗原（MPB64)检 测法、PCR-荧光探针法在结核分枝杆菌复合群(MTBC)与非结核分枝杆菌(N TM)鉴别中的应用价值。
方法11株 标准菌株包括M T B标准株H37R v及10株N T M标准菌株均来源于国家结核病参比实验室。
238株临床分离株为北京结核病控制研究所2019年1一 12月门诊患者培养阳性冻存菌株，经涂片抗酸染色均为阳性。
应用 PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探针法及微阵列基因芯片法对11株标准菌株及238株临床分离 株进行鉴定;以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，评价PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PCR-荧光探 针法鉴别M T B C与N T M的效能。
结果以微阵列基因芯片法菌种鉴定结果为参照，PNB/T C H生长试验法、MPB64检测法、PGR-荧光探针法检测M T B C的敏感度分别为100_ 0%(206/206)、98. 5%(203/206)、100. 0% (206/206);特异度分别为 96. 9%(31/32)、100. 0%(32/32)、100. 0%(32/32);符合率分别为 99. 6%(237/238)、98. 7%(235/238)、100. 0%(238/238); K冲/« 值分别为 0• 98、0. 95、1.00。
PN B/TC H生长试验法、MPB64 检测法、PCR-荧光探针法检测周期分别为28 d、0. 5 h、0. 5 d，检测平均成本分别为20、40、60元。
荧光定量PCR法用于诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA的临床价值
荧光定量PCR法用于诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA的临床价值1. 引言1.1 研究背景肺结核是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，在全球范围内具有较高的发病率和死亡率。
目前，肺结核的诊断主要依靠痰液培养和酸杆菌染色等传统方法，但这些方法存在着一定的局限性，例如需要较长的检测时间、易受外界因素干扰等。
寻求一种更加准确、灵敏和快速的诊断方法对于减少肺结核的传播和提高患者的治疗效果至关重要。
本研究旨在通过荧光定量PCR法对肺结核患者的痰液样本进行分析，探讨该技术在肺结核诊断中的应用及其临床意义，并为未来临床应用提供重要的借鉴。
1.2 研究目的研究目的旨在探究荧光定量PCR法在诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA方面的临床应用价值。
具体地，通过比较荧光定量PCR 法与传统方法在检测肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA的效果，分析荧光定量PCR法的优势和不足之处。
考察痰液中结核分枝杆菌DNA 的检测结果对肺结核患者疾病状况的影响，以及对肺结核的早期诊断和治疗的指导作用。
通过研究，旨在为临床医生提供更准确、快速、可靠的诊断手段，提高肺结核患者的治疗效果和预后，为肺结核的防控工作提供科学依据，促进公共卫生健康事业的发展。
1.3 研究意义肺结核是一种严重的传染病，严重威胁着全球人类的健康。
目前，肺结核的诊断主要基于临床症状、痰液检测和影像学检查，然而这些方法存在着一定的局限性，包括诊断灵敏度不高、操作复杂、耗时长等问题。
需要开发新的快速准确的诊断方法来提高肺结核的诊断率，降低传染性病例的传播风险。
荧光定量PCR法在诊断肺结核患者痰液中结核分枝杆菌DNA方面具有重要的临床应用价值。
通过本研究的深入探讨，我们可以更好地认识其在肺结核诊断中的作用，为临床提供更准确、更快速的诊断方法，促进肺结核的早期发现和及时治疗。
2. 正文2.1 荧光定量PCR法的原理荧光定量PCR法的原理是基于聚合酶链式反应（PCR）技术的基础上，通过引入荧光探针来实现DNA的定量检测。
如何用PCR技术检测结核杆菌
如何用PCR技术检测结核杆菌结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR 方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.一、结核杆菌DNA的提取在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.二、引物的设计根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.(一)编码结核杆菌抗原的基因序列1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.(二)结核杆菌基因组重复序列1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.(三)人型结核杆菌特异序列mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.(四)分枝杆菌dnaJ基因该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.(五)rRNA序列用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.三、PCR产物的检测方法通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR 产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR 产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH 溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性(一)PCR的特异性PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.五.PCR在结核病临床诊断中的应用PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.六、PCR在检测TB中的注意事项PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.。
结核杆菌的三种实验方法的应用评估
结核杆菌的三种实验方法的应用评估目的比较痰涂片法、荧光定量PCR法和结核抗体检测法对结核病的诊断意义。
方法选取2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、荧光（PCR）检测和采集血样进行结核抗体检测。
结果172例检样中，抗酸染色痰液标本阳性例只有20例阳性率为11.6%。
荧光PCR法阳性率55例，阳性率31.2%，结核抗体阳性例为87例；阳性率为50.6%。
结论三种方法中，以结核抗体阳性率最高，荧光PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低，如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。
标签：结核杆菌；检测方法结核杆菌又称分枝杆菌，是引发结核病的病原菌，可能对全身的各大器官造成侵害，临床中以肺结核最为常见。
结核杆菌细胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。
结核病至今仍为重要的传染病，近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病呈上升趋势。
鉴定结核杆菌的方法有很多[1]。
本研究应用痰涂片染色法、PCR-荧光法、结核分枝杆菌抗体检测，对172例标本同时进行比较和评价。
1资料与方法1.1一般资料收集自2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊的患者标本172例。
所有患者均通过痰涂片抗酸结核杆菌检验、胸部X线片、临床表现以及结核菌素试验等诊断为肺结核。
涂片法和荧光PCR为痰标本。
嘱患者留取晨痰2～5ml（结核患者需停抗结核药3d）。
结核抗体检测则采静脉血2ml。
1.2方法1.2.1涂片染色镜检是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已外理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。
染色步骤：①石碳酸复红溶液染色20min；②5%盐酸酒精脱色3min；③亚甲基蓝溶液染色30S。
结核分枝杆菌荧光定量pcr检测方法的建立及应用
结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用目的建立结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法,探讨荧光PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。
方法根据结核分枝杆菌基因保守序列设计引物和探针，并构建标准品。
对102例培养涂阳的结核痰液标本和45例非结核感染者的痰标本，应用荧光定量PCR法、痰涂片抗酸染色法检测结核分枝杆菌。
结果荧光定量PCR、抗酸染色法检测结核分枝杆菌的特异性分别为100%、30%。
结论荧光定量PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有重要的应用价值。
【关键词】结核;分枝杆菌;抗酸染色;荧光定量PCREstablishment and application of fluorescence quantitative PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis.ZHU Yu-lan, WANG Dian-peng, GAO Zhao-xian, et al.International Travel Agency Health Care Center, Shenzhen Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen 518033, Guangdong, P. R. ChinaAbstract：Objective To constitute a method for detection of Mycobacterium tuberculosis by fluorescence quantitative PCR and evaluate the application value of fluorescence quantitative PCR in detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum. Methods The primers and probe were designed and constitute a standards. The suptum samples from 102 tuberculosis patients and 45 non-tuberculosis patients were detected by fluorescence quantitative PCR and acid-fast stain. Results The positive rates and specificity of fluorescence quantitative PCR, acid-fast stain,were100% and 30% respectively. Conclusion Fluorescence quantitative PCR is a rapid method for diagnosis of tuberculosis, which shows a high specificity and sensitivity. It is a useful tool for diagnosis of tuberculosis in the future.Key words：Tuberculosis; Mycobacterium tuberculosis; Acid-fast stain; Fluorescence quantitative PCR结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2 000万，每年新增结核病人约800～1 000万，每年约有300万人死于结核病［1～3］。
荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用
354Chin J Lab Diagn,March.2021 ,Vol 25«No.3文章编号：1007 — 4287(2021)03 — 0354 —03荧光PCR熔解曲线法在检测临床标本结核分枝杆菌及其耐药性中的应用张汇征\李桓2,张珍'李俊刚、王静1，廖传玉1，周刚、陈耀凯1,严晓峰罗明^ (重庆市公共卫生医疗救治中心1.中心实验室；2.感染科；3.药剂科；4.结核科，重庆400036)摘要：目的评价荧光Pt’R熔解曲线法检测临床标本结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼敏感性的性能。
方法 收集重庆市公共卫生医疗救治中心2016年7月至2018年7月进行过荧光P C R熔解曲线法结核检测的病例，分别 与结核菌培养和Gen e x p e r t比较检测结核菌的灵敏度，与比例法药敏比较药敏结果。
结果在结核菌检测上，荧光P C R熔解曲线法阳性率与结核菌培养相近，低于Genexpert:与比例法药敏相比，检测利福平药敏的灵敏度为93.2%,特异度为80. 2%,符合率为84. 3%;检测异烟肼药敏的灵敏度为92. 6%,特异度为86. 3%,符合率为88. 6%。
结论 荧光P C R熔解曲线法可以高灵敏地直接对临床样本快速检测结核菌及其耐药性。
关键词：焚光P C K熔解曲线法；结核分枝杆菌；耐药性；临床样丰中图分类号：R378.91 文献标识码：AApplication of fluorescence PCR melting curve assay to detect mycobacterium tuberculosis and its drug-resistance in clinical specimens Z H A N G H u i-z h e n g^L l H uan Z H A N G Zhen n et a l. (.Central Lab ^ Chongqing Public H ealth M edical Center •Chongqing A00036 ,Chi?iu)Abstract ：Objective To evaluate the ability of fluorescence PC'R melting curve assay in detection of mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Methods The cases tested fluorescence quantitative PCR melting curve assay in C'hongqing public health medical center during Jul. 2016 to Jul. 2018 were collected. The sensitivities of fluorescence PCR melting curve assay were compared with MTB culture and Genexpert respectively. The results of rifampin and iso- niazid drug susceptibility of fluorescence PCR melting curve assay were compared with that of standard proportion method. Results The positive detection rate of MTB of fluorescence cjuantitative PCR melting curve assay was close to MTB culture，but lower than that of Genexpert; Compared with the proportion method, the sensitivity, specificity and concordance rates of rifampicin were 93. 2% ,80. 2%and 84. 3% respectively ； The sensitivity * specificity and concordance rates of isoniazid were 92. 6% ,86. 3%and 88. 6% respectively. Conclusion Fluorescence cjuantitative PCR melting curve assay can be u.sed to detect MTB and its drug-resistance directly in clinical samples with high sensitivity.Key words：fluorescence quantitative PCR melting curve assay；mycobacterium tuberculosis；drug-resistance；clinical specimen(Chiti J Lab,2021,25 ：0354)结核病（TB)是由结核分枝杆菌（MTB)引起的 慢性传染病。
PCR（FQ-PCR）检查在肺结核诊断中的临床价值
PCR（FQ-PCR）检查在肺结核诊断中的临床价值韦毅;支成斌;孙桂兰;匡中国【摘要】目的：了解实时动态荧光定量PCR(FQ-PCR)监测在肺结核诊断中的临床价值。
方法采用前瞻性的方法用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对继发性肺结核患者的痰和结核性胸膜炎患者的胸水作DNA(TB-DNA)定量监测,同时对非肺结核患者的痰作DNA(TB-DNA)定量监测。
结果继发型肺结核147例,痰涂片阳性率为21.09%,痰TB-DNA阳性例次率为36.73%﹔痰涂片抗酸染色阳性例次率为15.04%﹔在痰涂片TB阳性34例次中,痰菌TB-DNA阳性例次率为23.53%。
在痰涂TB阴性的192例次中,TB-DNA阳性例次率为39.06%。
结核性膜炎胸水检查TB-DNA108例次,阳性例次率为12.03%﹔非肺结核患者112例。
假阴性率为70.21%,假阳性率为9.60%,灵敏度为29.8%,特异度为90.3%。
结论荧光定量PCR(FQ-PCR)TB-DNA监测结果与国内报到不一致,其假阴性高,假阳性亦高,灵敏度低,特异度亦不高,且痰涂片抗酸杆菌阳性病人的痰TB-DNA阳性例次率亦低,对临床诊断帮助不大,不作为疑似肺结核病人的常规检查。
【期刊名称】《中国卫生产业》【年(卷),期】2014(000)028【总页数】2页(P156-157)【关键词】时动态荧光定量;肺结核;灵敏度;特异度【作者】韦毅;支成斌;孙桂兰;匡中国【作者单位】贵州省兴义市人民医院感染性疾病科，贵州兴义 562400;贵州省兴义市人民医院感染性疾病科，贵州兴义 562400;贵州省兴义市人民医院感染性疾病科，贵州兴义 562400;贵州省兴义市人民医院感染性疾病科，贵州兴义 562400【正文语种】中文【中图分类】R521肺结核发病率呈逐年递增趋势，由于抗菌药物的不合理使用及不规则治疗，使结核杆菌产生耐药菌株而致多重耐药或耐多药结核菌产生，给临床治愈肺结核带来了极大困难。