第五章亲和层析
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第五章 亲和层析分离技术
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋 白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离 纯化的根据。
第五章亲和层析
固相化 (Immobilise)
配 体 Ligand: 亲 和 层 析 中 能 被 某 一 生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体):亲和层析中与配体 共价结合,使其固相化的物质。
第五章亲和层析
吸附 (Adsorption)
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
第五章亲和层析
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
第五章亲和层析
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋 白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使 得亲和层析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第五章亲和层析
优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和
缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分 离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的 实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
• 例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析 (AALA)。染料配体，例如三嗪或三苯甲烷化合物， 能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
第五章亲和层析
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
分离过程
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范 德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上） ， 从而留在固定相上 • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并 随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生 物分子。 • 通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离 子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
• 免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体 之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。
• 例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从 血清中分离其对应的抗体。
• 例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓 度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难 于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方 法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备 抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂， 就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
第五章亲和层析
第二节 亲和层析基本原理及理论基础 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
第五章亲和层析
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次 成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二 乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如 Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合， 不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从 而将蛋白质分离。
Affinity Chromatography
第五章亲和层析
第一节 亲和层析概述
亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而 进行分离的一种层析技术
第五章亲和层析
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及 半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量的这些基团的蛋白质 可以通过金属离子亲和层析得到分离。
第五章亲和层析
第五章亲和层析
拟生物亲和层析
• 定义：是利用部分分子相互作用，模拟生物分子 结构或某特定部位。以人工合成的配体ion )
第五章亲和层析
一、亲和层析基本原理
基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定 在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和 可逆性，对另一个分第子五章进亲和行层析分离纯化。
混合蛋白样品
平衡液
带有配体的树脂 珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的蛋白 第五章亲和层析
收集目的蛋白
第五章亲和层析
三、亲和层析的类型
• 生物亲和层析 • 免疫亲和层析 • 固定化金属离子亲和层析 • 拟生物亲和层析
第五章亲和层析
生物亲和层析
• 利用自然界中存在的生物特异性相互作用 物质对的亲和层析。
• 通常具有高的选择性。 • 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素
-受体等。
第五章亲和层析
免疫亲和层析
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合 基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金 属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选 择性的吸附蛋白质 。
目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪 唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋 白质与固定化金属离子结合，这是IMAC用于蛋白质分离 纯化的根据。
第五章亲和层析
固相化 (Immobilise)
配 体 Ligand: 亲 和 层 析 中 能 被 某 一 生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。即被固定在基质上的分子称为配体。
基质Matrix(载体):亲和层析中与配体 共价结合,使其固相化的物质。
第五章亲和层析
吸附 (Adsorption)
• 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以 这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物 质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需 要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离 物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。
• 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学 性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具 有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高， 是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
第五章亲和层析
二、亲和层析的特点
• 分辨率很高 • 分离速度快 • 操作简便 • 对设备要求不高 • 亲和吸附剂通用性较差 • 洗脱条件较苛刻
第五章亲和层析
与其他层析技术比较
• 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是 利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸 附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分 离。
• 20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋 白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使 得亲和层析技术得到了快速的发展。
• 生物大分子的分离
第五章亲和层析
优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和
缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分 离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的 实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
• 例如染料亲和层析（DAFC）和氨基酸亲和层析 (AALA)。染料配体，例如三嗪或三苯甲烷化合物， 能通过共价键牢固地结合到亲和载体上。
• 染料配体与很多蛋白以及酶的活性位点相互作用， 以模仿这些生物分子的底物、辅助因子或结合剂 的形式进行。
第五章亲和层析
四、亲和层析载体
载体在亲和层析中的作用：使配体固定化、 提供结合的空间环境
分离过程
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范 德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上） ， 从而留在固定相上 • 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并 随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生 物分子。 • 通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离 子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来， 就得到了纯化的待分离物质
• 免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体 之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。
• 例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从 血清中分离其对应的抗体。
• 例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓 度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难 于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方 法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备 抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂， 就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
第五章亲和层析
第二节 亲和层析基本原理及理论基础 • 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固
定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的 特异性和可逆性，对另一个分子进行分离 纯化。
第五章亲和层析
亲和力
• 生物分子间存在很多特异性的相互作用， 如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑 制剂、激素－受体等等，它们之间都能够 专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲 和力。
第五章亲和层析
固定化金属离子亲和层析
• 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯 合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次 成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二 乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如 Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合， 不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从 而将蛋白质分离。