第3章(2) 蛋白质变性与复性

包涵体的溶解
包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间
的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作
用等，使多肽链伸展。
包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、盐酸
胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷基三 甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠等； 对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如 巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、
如以Ni2+为亲合配体，可与末端标记有组 氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种 作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白 质的复性。
亲合色谱复性
脂质体亲合色谱复性
脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理是： 局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与 具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质 分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质 双层作用，以帮助蛋白质进行复性。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。
最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理：
• 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， • 降低错误折叠蛋白质的稳定性， • 增加折叠复性中间体的溶解度， • 增加非折叠蛋白质的溶解度， • 减少复性中间体接触发生聚集反应。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力
• 盐键
多肽链上的众多带正负电荷的侧链基团之间或与环境
中的正负离子之间的静电作用对蛋白质的稳定性有较 大影响，在蛋白质构象形成过程中也起到重要作用。 • 二硫键 是侧链基团之间唯一的共价键，对蛋白质天然构
象及折叠过程中形成的中间体具有很强的稳定作用，
在蛋白质折叠过程中起到关键作用。
变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。
• 在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，
层析（色谱）复性的一般操作
洗涤液 洗脱液
色谱法复性过程的示意图
凝胶过滤复性
凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学 体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱 柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总 体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检 出，灵敏度高。能够把握间隔进料的时间，进 行色谱柱的连续使用，提高使用效率。 蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子 小，最后流出色谱柱。达到复性目的。
• ②机械破碎——膜分离除可溶性蛋白——变 性剂溶解包含体——除变性剂复性；
• 路线②应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶 性蛋白质，但细胞碎片和包含体一起被膜挡 住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常 常导致可溶性蛋白质的滞留。优点：封闭式 操作，不污染环境也不受环境污染，能量消 耗也比离心法少。
③化学破碎(加变性剂)——离心除细胞碎 片——除变性剂复性。 • 路线③是用化学法破菌，所采用的试剂 既可以破菌又可以溶解包含体，将两道 工序合为一道，节省了设备和时间。缺 点：所有的可溶性杂质都没有被除去， 混杂在产物中间，给后分离带来困难。
亲合色谱复性
原理：是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲 合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与 变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。 依使用的配体，用于复性的亲合色谱有： 抗体亲合色谱、金属亲合色谱(IMAC)、 脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。
亲合色谱复性
以金属离子为配体的亲合色谱复性法
• 破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；
• 离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；
• 洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80% 左右， 含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、 盐酸胍、Triton X-100反复洗涤，黏度高时可用溶菌 酶、稀NaOH溶液洗涤，获得较纯的包涵体。
• 目标产物的复原
聚集反应抑制剂的种类：
• 可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍 或尿素。在非变性浓度下，是有效的促进剂。 • Zn2+ 和Cu2+可稳定折叠中间体。
• PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形 成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的 聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再 与PEG结合。
各种色谱复性方法的比较
• 亲合色谱(AFC)复性法：因蛋白质与介质有特 异的相互作用，变性蛋白质分子间聚集反应少， 使原不可逆折叠的蛋白质变成可逆。但使用范 围窄，分子伴侣昂贵，时间长。 色谱复性方法的问题：
• 在复性过程中不可避免地会产生聚集形成沉淀， 使色谱柱的阻塞，柱压很快升高，报废。 • 放大困难。
变性与复性
变性过程伴随着蛋白质的物理、化学、生物学 性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度 增加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。
蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间 结构，称为肽链的伸展或去折叠。 许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自 发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称 为变性蛋白质的再折叠或复性。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
• 表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。
如 Triton X-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜 菜碱等对蛋白质复性有促进作用。 • 多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性， 且有稳定蛋白质天然构型的作用。
• 短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
作用，可有效降低低聚体的形成。
稀释法复性的缺点与改进的方案
稀释法的缺点： 浓度低（ng/ml) 改进的方案： 膜透析复性
体积大（增大20－40倍） 反胶束复性
复性率低（常常<20％)
固相辅助复性
透析复性法
原理：变性剂均为小分子物质，在透析或 超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液 的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，使 变性蛋白质折叠复性。 包括借助超滤实现复性的透滤复性法。
蛋白质结构
蛋白质的结构层次
促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力
作用力可分为四种主要类型：
• 疏水相互作用
多肽链处于水环境时，其非极性侧链基团为避开
极性分子而形成疏水核心，是“疏水折叠”。
• 氢键
蛋白质内有非常多的氢键，不同氢键对蛋白质构
象的影响大小也不同，至少在二级结构，如α-螺旋 和β-折叠的形成与维系起重要作用。
其他——反胶束萃取复性法
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
提高复性率的策略
1、二硫键的形成 拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程， 要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫 键的形成。 2、小分子添加物
降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙 酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。 最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐 酸胍以及去污剂（SDS）。
亲合色谱复性
分子伴侣亲合色谱，又称为“折叠色谱”。 为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当 变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消 除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在 疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环 过程，直到恢复其天然的构象状态。
离子交换色谱复性
原理：变性蛋白质、变性剂及变性液中的其 他组分与离子交换介质间的电荷作用，使它 们吸附在离子交换固定相表面，由于这些组 分与离子交换介质的吸附能力的差别，在洗 脱过程中进行不断地吸附-解吸-再吸附的过程， 使变性蛋白质与变性剂逐渐分离，并在吸附解吸的过程中进行复性过程。
谷胱甘肽等使S- S键断裂。
包涵体的溶解
温度一般25℃~30℃，以促进溶解。
在细胞质内形成的包涵体，可采用原位溶 解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂 和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解 （增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来）， 再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体 溶解液。
蛋白质的复性
复性：就是脱除变性剂使溶解的包涵体蛋 白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。 • 在复性过程中，处于伸展状态的肽链，因暴 露在外面的疏水侧链基团之间的相互作用而 使这些分子很容易发生聚集反应，形成沉淀， 这是大多数蛋白质复性率低的主要原因。
蛋白质的复性
蛋白质的折叠复性过程及聚集体的产生
图3-15 大肠杆菌胞质中 蛋白复性的一般过程
各种色谱复性方法的比较
• 凝胶过滤色谱(SEC)复性法：复性分离过程中， 变性蛋白质分子逐渐变小，柱负荷小，产物 浓度低，复性分离时间长，效率较低。
• 离子交换色谱(IEC)复性法：柱负荷大，分离 效果尚好，最常用的变性剂盐酸胍在柱保留， 影响柱容量，且往往与蛋白质一起洗脱，使 盐酸胍的使用受到限制。
第二节 蛋白质变性与 复性
Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。 若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、 尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白 质变性。 弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保 持一定构型；强变性条件下，蛋白质完全变性 肽链伸展成无序随机状态。
缺点：过程缓慢，耗时间长，效率低。
对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。
色谱复性法
在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。优点是：
• 色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除 提高复性质量和活性收率。
达到复性与纯化同时进行的目的。 • 便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。 方法：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、 亲合色谱(AFC).
操作方式：
1、一次性稀释：
2、分段稀释：一般采用两步法，先将变性 剂浓度降低到一中间浓度，最后再完全除去。 3、连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液 按一定比例连续混合，复性。 分段和连续稀释法复性回收率高于一次性 稀释
稀释复性法
稀释复性应用于大规模生产的问题： • 复性缓冲液量大，体积大，设备利用率低； • 蛋白质浓度低，产物回收困难； 稀释复性法是其他复性法的基础。 对一个新的包涵体蛋白质复性时，首选的方 法是稀释复性法。
稀释复性法
•
伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多 个分子之间的反应，属于二级以上动力学反应， 而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装 过程，属于一级动力学反应。 聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在低浓 度进行复性有利于控制聚集反应。
•
• 通常，复性的蛋白质浓度为10~50μg/mL。
稀释复性法
源自文库
• 抗剪切和较高温度，对破碎细胞方法和条件要求低；
• 包涵体密度大，易分离；
• 包涵体的蛋白质纯度较高；
• 后续蛋白质分离纯化较容易。 不利方面： • 需变性复性； • 活性蛋白质收率低。
包涵体的分离
• 要分离具有活性的蛋白质，要经历下列步骤： • 破碎细胞——分离出包含体——溶解包含体——目
标产物的构型复原。
亲合色谱复性
蛋白质的复性
一个有效、理想的折叠复性方法具备的特点： • 活性蛋白质回收率高； • 正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离； • 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品； • 折叠复性方法易放大； • 复性过程耗时少。 • 要求折叠复性过程快速、低成本、高效。
稀释复性法
从细胞破碎到蛋白质复性不同的工艺路线： ①机械破碎(高压匀浆，高速珠磨)——离心法提 取包含体——加变性剂溶解——除变性剂复性； 路线①利用包含体与细胞碎片的密度差，用离 心将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，使 分离纯化简单。缺点：经过几次离心才能除去大 部分细胞碎片，加工时间较长。
• 缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的 折叠酶，脯氨酰基顺/反异构酶，二硫键异构酶，及增 强折叠或阻止聚集的分子伴侣等。
• 超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折 叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致 这些蛋白质的聚集和错误折叠。
包涵体对分离纯化的影响
有利方面： • 蛋白质表达量高；
(a)直接表达产物： １，细胞裂解，包含体 分离； ２，变性；３，再折叠。 图中代表具有二硫键的 情形，Ｒ代表—H或SO3-；(b)融合蛋白：１， ２同(a)，３，释放重 组肽链；４，再折叠。
蛋白质的复性
目前发展的复性方法：
• 稀释复性
• 透析、透滤复性
• 色谱法复性：
凝胶过滤色谱复性、
离子交换色谱复性 、