蛋白电泳与转膜
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
wb转膜条件公式
wb转膜条件公式一、引言WB转膜是生物实验中常用的技术，它将蛋白质从凝胶转移到膜上，以便进行后续的免疫反应。
为了获得良好的转膜效果，了解转膜条件公式及其实际操作步骤至关重要。
本文将详细介绍WB转膜条件的公式、实际操作步骤以及转膜条件对实验结果的影响。
二、WB转膜条件的公式介绍1.转膜公式WB转膜条件的公式可以表示为：转膜速率= （转膜电压× 转膜时间）/ 转膜距离其中，转膜电压（V）、转膜时间（s）和转膜距离（cm）是影响转膜速率的关键因素。
2.转膜条件的确定在实验过程中，需根据目的蛋白的大小、实验要求以及设备性能来确定合适的转膜条件。
通常情况下，较高的转膜电压和较长的转膜时间有利于大分子蛋白质的转膜。
3.转膜条件的应用根据实验需求，可以灵活调整转膜条件以达到最佳转膜效果。
例如，在研究低丰度蛋白质时，可以降低转膜电压和缩短转膜时间，以提高转膜效率。
三、WB转膜条件的实际操作步骤1.准备试剂和器材：磷酸缓冲液、转膜缓冲液、滤纸、膜、转移装置、电泳仪等。
2.蛋白质电泳：将待检测蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3.转膜：将电泳后的凝胶与转膜膜贴合，放入转移装置，按照预先设定的转膜条件进行转膜。
4.封闭：将转膜后的膜用封闭液封闭，以减少非特异性结合。
5.抗体孵育：将封闭后的膜放入特异性抗体溶液中，进行孵育，以检测目标蛋白质。
6.显色：加入显色剂，观察膜上目标蛋白质的显色情况。
四、转膜条件对实验结果的影响1.转膜效果的评判转膜效果可以通过目的蛋白的清晰度、信号强度和背景噪声等指标来评判。
合适的转膜条件可以提高蛋白质的转膜效率，减少非特异性结合，获得清晰的免疫印迹。
2.转膜条件与实验结果的关系转膜条件直接影响蛋白质的转膜效果，从而影响实验结果的准确性。
因此，在实验过程中，需要根据目的蛋白的特性和实验要求来调整转膜条件，以获得理想的实验结果。
五、总结与展望WB转膜条件公式为实验人员提供了理论依据，有助于优化转膜条件，提高转膜效果。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
westen blot原理
westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。
Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。
Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。
Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。
Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。
其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。
Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。
尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。
Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。
2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。
3. 可定量检测蛋白质。
4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。
Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。
下面我们就将分别介绍这些步骤。
1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。
样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。
在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。
样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。
免疫蛋白实验转膜方法
免疫蛋白实验转膜方法一、转膜方法的步骤1. 准备工作：将电泳仪中的凝胶取出，将其放入转膜缓冲液中浸泡10分钟，使凝胶中的蛋白质充分溶解。
2. 制备转膜装置：将转膜装置中的海绵与滤纸浸泡在转膜缓冲液中，然后将其放置在转膜仪器的阳极和阴极之间。
3. 转膜：将凝胶放在转膜装置的海绵上，确保凝胶与膜之间无气泡，然后将膜放在凝胶上。
接下来，将转膜装置放入转膜仪器中，调整电压和转膜时间，开始转膜过程。
4. 转膜结束：转膜结束后，将膜从凝胶上取下，可以进行后续的实验步骤，如免疫染色或探针杂交等。
二、转膜方法的注意事项1. 转膜缓冲液的选择：根据实验的需要选择合适的转膜缓冲液，常用的有常规转膜缓冲液和含有甲醇的转膜缓冲液。
前者适用于大多数常规实验，后者适用于转膜效果较差的蛋白质。
2. 转膜装置的选择：根据凝胶和膜的尺寸选择合适的转膜装置，确保凝胶和膜的接触面积尽可能大，并且没有气泡存在。
3. 转膜条件的调整：根据实验需要调整转膜条件，包括电压、转膜时间和转膜温度等。
过高的电压会引发蛋白质的破坏，过长的转膜时间会导致转膜效果不佳，过高的转膜温度会引起蛋白质的变性。
4. 转膜后的处理：转膜结束后，及时将膜从凝胶上取下，避免长时间接触凝胶导致膜上的蛋白质扩散。
此外，为避免膜的损伤，在处理膜时要轻拿轻放。
5. 转膜效果的评估：转膜结束后，可通过染色或探针杂交等方法来评估转膜效果。
染色方法包括Ponceau S染色和Coomassie Brilliant Blue染色等，探针杂交方法用于检测特定的核酸序列。
总结：免疫蛋白实验转膜方法是将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到固体膜上的重要步骤。
通过合适的转膜缓冲液、转膜装置和调整转膜条件，可以实现高效、准确的转膜过程。
在转膜后，及时处理膜并评估转膜效果是保证实验结果准确性的关键。
希望本文对免疫蛋白实验转膜方法有所帮助，为科研工作者提供参考。
蛋白转膜流程
蛋白转膜流程1.首先将含有目的蛋白的样品加入到转膜装置上。
Firstly, add the sample containing the target proteininto the transfer apparatus.2.然后准备两块含有孔的膜，通常使用聚丙烯膜或硝酸纤维膜。
Then prepare two membranes with pores, typically polypropylene or nitrocellulose membranes.3.将蛋白转膜装置放入含有适当电解液的转膜槽中。
Place the protein transfer apparatus into a transfer tank containing the appropriate electrolyte.4.连接正极和负极电极，开始电泳转膜过程。
Connect the positive and negative electrodes and start the electrophoretic transfer process.5.蛋白通过电泳迁移，向膜上移动。
Proteins migrate by electrophoresis and move onto the membrane.6.蛋白在膜上形成一定的带状图案。
Proteins form distinct bands on the membrane.7.停止电泳过程，取出转膜装置。
Stop the electrophoresis process and remove the transfer apparatus.8.准备用于检测的特异抗体或染色剂。
Prepare specific antibodies or stains for detection.9.将膜与特异抗体或染色剂接触，进行标记。
Incubate the membrane with specific antibodies or stains for labeling.10.观察蛋白带的形成和位置。
蛋白电泳与转膜
湿转膜
总结词
转移效率高、操作简便、适合大 量样本
详细描述
湿转膜通过优化电场分布和电流 密度，提高蛋白质的转移效率。 该方法操作简便，适用于大量样 本的检测。
特殊类型的转膜
总结词
特定用途、满足特殊需求
详细描述
特殊类型的转膜包括无痕转膜、亲和转膜等，适用于特定蛋白质的检测和分离。这些方法能够满足科研和临床等 领域的特殊需求。
生物标志物检测
蛋白电泳与转膜技术可以用于检测疾病相关的生物标志物， 如肿瘤标志物、炎症标志物等，有助于疾病的早期诊断和预 后评估。
药物疗效监测
通过蛋白电泳与转膜技术可以监测药物治疗后蛋白质表达的 变化，从而评估药物的疗效和作用机制。
在药物研发中的应用
药物靶点筛选
利用蛋白电泳与转膜技术可以分离和 鉴定与药物作用相关的蛋白质，为药 物靶点的筛选提供依据。
转膜参数设置
根据不同的蛋白特性和实验需求，合理设置转膜参数，如电流、时 间等，以确保蛋白能够成功转移至膜上。
常见问题与解决方法
条带模糊或拖尾
这可能是由于电泳缓冲液不新鲜或电泳条件设置不当所致பைடு நூலகம்。可以尝试更换新的电泳缓冲液或调整电泳参数。
转膜效率低
可能是由于转膜液不新鲜或转膜参数设置不当所致。可以 尝试更换新的转膜液或调整转膜参数。
药物作用机制研究
通过蛋白电泳与转膜技术可以研究药 物对蛋白质表达的影响，从而深入了 解药物的作用机制和不良反应。
06
蛋白电泳与转膜的注意事项与常见问
题
注意事项
电泳缓冲液的配制
确保使用新鲜的电泳缓冲液，以获得最佳的电泳效果。避免使用 过期或污染的缓冲液。
样品处理
确保蛋白样品在电泳前已经充分溶解和混匀。对于一些难溶的蛋白， 可能需要使用变性剂进行处理。
电泳和转膜条件
电泳和转膜条件
电泳和转膜是生物实验中常用的技术，用于分离和检测不同分子量的物质。
以下是电泳和转膜的一般条件：
●电泳条件：
1.电源：电泳一般使用恒压或恒流的电源，电压根据分离胶的厚度和电泳槽
的体积而定，通常设置为60~100V。
2.温度：电泳过程应保持恒温，温度过高可能导致凝胶溶化，电泳速率降低；
温度过低则可能导致电泳时间延长，对电泳效果产生影响。
3.缓冲液：使用适当的电泳缓冲液，以保证电泳的稳定性和分离效果。
4.凝胶浓度：凝胶浓度是影响电泳分离效果的重要因素，不同分子量的物质
需要不同的凝胶浓度来达到最佳分离效果。
●转膜条件：
1.转膜缓冲液：转膜需要使用适当的缓冲液，以提供稳定的电流和保护膜上
的蛋白质不被氧化。
2.转膜时间：转膜时间根据分子量和所需的转移效率而定，通常在30~60分
钟之间。
3.转膜电压：转膜电压是影响转膜效率的重要因素，过高或过低的电压都会
降低转膜效率。
一般选择20~30V的恒压或50~75V的脉冲电压。
4.温度：转膜过程需要在低温下进行，以避免蛋白质的变性。
通常选择4~10℃
的低温环境。
5.膜的预处理：为了提高转膜效率，需要对膜进行预处理，如用甲醇或乙醇
浸泡、UV照射等。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤
蛋白印迹实验，又被称为Western blot，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过这种实验方法，研究人员可以确定样品中是否含有特定蛋白质，以及其相对浓度。
这一方法在生物医学研究中被广泛应用，对于研究蛋白质结构、功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍蛋白印迹实验的原理和步骤，希望能够帮助读者对这一实验方法有更深入的了解。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验的原理基于蛋白质的分子量及电荷特性。
当蛋白质被电泳分离后，可以通过膜转移和特异性抗体结合的方式来检测目标蛋白。
其基本步骤包括蛋白电泳分离、膜转移、抗体结合和信号检测。
1. 蛋白电泳分离蛋白印迹实验首先需要对样品中的蛋白进行电泳分离。
这一步骤通过SDS-PAGE或其他电泳方法进行，将蛋白质按照分子量大小进行分离。
分离过程中，蛋白质会在凝胶中形成不同的泳动带，便于后续的检测和分析。
2. 膜转移分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这一步骤通常通过湿式膜转移或半干式膜转移进行，目的是将蛋白质牢固地转移到膜上，并保持其原有的位置关系和相对分子量大小。
3. 抗体结合蛋白转移至膜上后，需要与特异性抗体结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白的，并且标记有辅酶或发光物质，便于检测和定量分析。
抗体结合过程需要严格控制条件，确保特异性和灵敏度。
4. 信号检测最后一步是通过染色、荧光或化学发光的方式来检测抗体和蛋白的结合情况。
根据信号的强度和位置，可以确定目标蛋白的存在与否以及其相对浓度。
以上就是蛋白印迹实验的基本原理，下面将介绍蛋白印迹实验的具体步骤。
二、蛋白印迹实验的步骤1. 样品处理首先需要将研究样品进行处理，常见的处理方法包括蛋白溶解、沉淀和浓缩。
处理完毕后，样品中的蛋白质将变得易于电泳分离和检测。
2. 蛋白电泳将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶上，进行蛋白电泳分离。
这一过程需要严格控制电场强度和时间，以确保蛋白质能够按照分子量大小进行有效分离。
3. 膜转移电泳分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白转移到膜上。
蛋白质印迹技术原理与操作流程Western blot
概念
蛋白质印迹是一种综合性的免疫学检测技术。 ①电泳：它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质 分子按分子量大小在凝胶上分离开 ②转膜：然后利用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上 ③抗体孵育：以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应抗 体结合 ④显影：经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白质。
电泳前准备-放入电泳槽
放入电泳槽中
电泳前准备-加电泳液
向内槽中加电泳液，如果不漏，再向外槽中加电泳液；如果漏液，则要重新把 玻板插好，使内外不交通。电泳液至少要漫过内侧的小玻璃板，继续加把气泡 冲走。
电泳前准备-上样
从-20℃冰箱取出蛋白样品（加入5×上样缓冲液和5min沸水处理后），室温融化，上 样前涡旋均匀，通过计算好的蛋白上样量进行上样（提取蛋白时测浓度，计算上样体 积），上样体积一般不超过15ul（上样不能太快，否则样品会冲出加样孔），每加一 次样更换一次枪头。 Marker每孔加2-5ul
电泳前准备-上样
电泳
恒压： 浓缩胶电泳：80V 30min 分离胶电泳：120V 70min
电泳
转膜前准备-配转膜液
配制转膜液，先不加甲醇，待转膜接电源前加入（甲醇易挥发） 将转膜液倒入一部分于搪瓷盘中，准备切胶（保持胶湿润）
转膜前准备-剪膜
PVDF膜：蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物，分子量大于20000的蛋白选 用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。使用前需用甲醇 浸润片刻，目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白 结合。
作用（易挥发，强神经毒性）
H20 Tris·HCL Glycine(甘氨酸) SDS
电泳液
400ml 1.2g 5.8g 0.4g
PVDF转膜实验步骤及注意事项
蛋白质转膜实验注意事项（用于 N 端测序）转膜实验操作要点1、SDS- PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统：用于>=20KD蛋白；Tris —Tricine 系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）；2、甲醇浓度：CAPSt印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20 % （甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）；3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。
（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。
如果膜变干，须重复本步骤的操作）；4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。
（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0 时，可省略本步骤）；5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中；6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2 小时。
（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。
例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）；7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色；8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1 %考马斯亮蓝R-250 溶于40%甲醇/1 %乙酸中）30-50 秒（切勿超过1 分钟），50%甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可；转膜实验注意事项1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量；2）预电泳处理：低电流跑空胶2〜2.5小时，防止胶内杂质污染；3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液;4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜;5）染料选择：不能使用考马斯亮蓝G250,推荐使用丽春红，或者考马斯亮蓝R250;6）转印效果：避免条带拖尾，用于测序的PVDF膜上条带应狭窄清晰；7）脱色过程：乙醇可增加到40－6 0％，背景颜色很快脱掉后，纯净水漂洗，滤纸上晾干; 8）膜保存：膜请夹在滤纸间装于自封袋中，冰箱内可以放置3〜6个月；9）10X CAPS（ 100mmol/L）缓冲液配制，方法如下：CAPS 22.13g ;加去离子水至900ml ;用2mol/L NaOH （约20ml ）将pH值调至11.0，然后定容至1L,贮存于4o CoCAPS电印迹缓冲液（含10%甲醇的1X CAPS配制，方法如下：10X CAPS 200ml;加入甲醇200ml;加入去离子水1600ml即可。
[原创] Western blot转膜整个过程
![[原创] Western blot转膜整个过程](https://img.taocdn.com/s3/m/f0c9964cc850ad02de80416a.png)
转膜（Trarsmembran）1 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
2 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。
大于20 kD的蛋白可用0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白就要用0.2 μm的膜了，如用0.45 μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。
尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。
但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失；NC韧性较差，易损坏。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
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5.1 电泳技术分类
5.1.1 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动的现象。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基 团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分 子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
5.2.1 背景介绍：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳于1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一 步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后，蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
（3）上样缓冲液作用：蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩 的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加 入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度 的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般 加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
-•
积层胶
Pro1- Pro2 Gly- Cl-
分离胶
+
凝胶分离范围
• SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和 交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液， 而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白 质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺～丙烯酰胺 ” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺 凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小 相差只有3% 的蛋白质。
（1）SDS作用：SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合 物，再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量，SDS带有大量负电 荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同 种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量的差异将各 种蛋白质分开。 （2）电泳缓冲液中甘氨酸作用：样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而甘氨酸分子 则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的 蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子 穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成 一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
• 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰 胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝 胶的线性分离范围如下表：
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29
丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）
15
12～43
10
16～68
7.5
36～94
5.0
57～212
5.2.3 体系中各成分的作用：
浓缩胶
• 电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区 ，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白 和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界 面附近，浓缩成一中间层。
•
Gly-径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.当样品进入 分离胶,pH,凝胶孔径改变,使慢离子的泳动率变大,超过蛋白,高强度电厂 消失.因此蛋白在均一的pH,和电场强度下通过分离胶.如果蛋白质分子 量不同,通过分离胶受到的阻力不同，泳动率也不同,因此能够根据蛋白 的分子量不同而分开.
5.1.3 电泳技术的分类： 自由界面电泳：是不含支持物的电泳。溶质在自由溶液中泳动，故也称自由电 泳，适用于高分子的检测，但不易完全分离。 区带电泳：是含有支持物的电泳，支持物上混合样品被置于狭小的区带中泳动， 分离出彼此分离的区带。支持物有很多种，由此又衍生出区带电泳的不同分支。
在生物技术研究中区带电泳应用最为广泛！ 区带电泳的分类： （1）按支持物的物理性状不同分为： 纸电泳：支持物为滤纸; 粉末电泳：如纤维素粉，淀粉，玻璃粉电泳； 凝胶电泳：淀粉胶，琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶电泳； 缘线电泳：如尼龙丝，人造丝电泳 （2）按支持物的装置形式不同分为： 水平板电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。
5.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：
（1）阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的 构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。 （2）结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭 圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒 定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 （3）这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率 便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而 主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就 可以将各蛋白组分按分子量大小分开。
5.1.2 电泳技术：1936年瑞典学者蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了 马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。电泳技术就是利用在电场的作用下， 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带 电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定的技术。在生命科学研究 中电泳技术主要用于蛋白质、核酸、同工酶、氨基酸、多肽等物质的分离和对分离 物质的纯度与分子量的测定。
凝胶电泳（以蛋白分离为例）：
（1）单向电泳：在聚丙烯酰胺凝胶上分离，适于分离种类较少的蛋白。 （2）双向电泳：第一向使用预制胶条进行蛋白质的等电聚焦分离，第二向将胶 条中经过第一向分离的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质的分子量 大小与第一向相垂直分离。用于蛋白质的分离，可将提取的蛋白质混合物中数 千种蛋白质同时分离开。