生物素对谷氨酸发酵的影响及控制

生物素对谷氨酸发酵的影响及控制摘要：
阐述生物素对谷氨酸在发酵过程中的影响和控制生物素的用量来提高谷氨酸的产量，以及生物素测定方法的介绍。

关键词：生物素谷氨酸影响测定方法发酵
1生物素对谷氨酸生产的影响
1.1谷氨酸的生物合成途径
谷氨酸生物合成的主要途径：葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和磷酸戊糖途径（HMP途径）生成丙酮酸，再被氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及NH4+的存在条件下，经还原氨基化反应生成谷氨酸。

1.2 生物素对谷氨酸生物合成途径的影响
生物素对谷氨酸生物合成途径有下列几方面的影响[1]：
（1）生物素对糖酵解速度的影响
生物素在糖酵解过程中，主要影响糖酵解速度，而不是EMP途径与HMP途径的比率。

在生物素充足条件下，糖降解速度远远超过丙酮酸的氧化速度，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸，引起了乳酸的溢出。

只有在生物素限量的情况下，糖降解速度与丙酮酸氧化速度才趋于平衡。

（2）生物素对NAD及NADH2含量的影响
在生物素缺乏菌中，葡萄糖氧化能力降低，特别是醋酸、琥珀酸的氧化能力显著减弱。

在生物素缺乏菌中，NAD及NADH2含量减少到l/2-1/4。

（3）生物素对乙醛酸循环的影响
乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，该酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。

葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，在生物素亚适量条件下，异柠檬酸裂解酶几乎没有活性。

原因在于丙酮酸氧化能力下降，醋酸生成速度减慢，为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶很少。

再者，由于该酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶活性，并阻遏该酶的生成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向沿异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。

（4）生物素对氮代谢的影响
生物素限量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时由于完全氧化降低的结果，使ATP的形成减少，蛋白质合成活动停滞。

在铵离子适量条件下，生成积累谷氨酸，且生成的谷氨酸也不会通过转氨作用生成其他氨基酸。

在生物素充足条件下，异柠檬酸裂解酶、琥珀酸氧化力、丙酮酸氧化力、蛋白质合成、乙醛酸循环比例、草酰乙酸和苹果酸脱羧反应都不断加大，导致谷氨酸量减少，通过转氨作用生
成的其他氨基酸量增加。

（5）生物素对谷氨酸生物合成途径调节机制的影响
在生物素丰富的情况下，谷氨酸菌的细胞膜合成完整，谷氨酸不能从膜内渗透到膜外，胞内的谷氨酸积累到一定程度，对谷氨酸脱氢酶进行反馈控制，从而停止谷氨酸的生物合成。

在生物素限量的情况下，由于细胞膜合成不完整，谷氨酸能够从胞内渗透到胞外，使胞内谷氨酸的含量降低，谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈控制失调，谷氨酸不断地被优先合成。

1.3 生物素对谷氨酸生产菌细胞膜通透性的影响
生物素对谷氨酸生物合成途径有重要的影响，但生物素更本质的作用是影响细胞膜的渗透性。

生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的生物合成，并影响磷脂的合成。

当生物素控制在亚适量时，脂肪酸合成不完全，导致磷脂合成也不完全。

由于细胞膜是磷脂双分子层组成的，当磷脂含量减少到正常量的一半时，细胞发生变形，谷氨酸就从胞内渗出，积累于发酵液中。

当生物素过量时，由于细胞内有大量的磷脂质，使细胞壁、细胞膜增厚，不利于谷氨酸的分泌，造成产酸率下降，影响发酵生产的经济效益[2]
2生物素分析方法
生物素的测定方法很多，早在二十世纪四十年代国外就报道了微生物法。

现在文献报道生物素测定方法主要有：滴定分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法[3]、荧光法、分光光度法、薄层色谱法，其中微生物法、高效液相色谱法和荧光法测定方法简单，应用广泛[4]，简单将这三种检测方法介绍一下。

2.1 微生物法
在生物素的测定方法中，微生物法是最为灵敏和应用最为广泛的，主要用于生物素的微量检测[5]。

其原理是在一定条件下，生物素的浓度与菌体的生长量呈线性关系，生物素浓度与菌体的生长量及生长速度成正比。

微生物法可灵敏地检测出具有生物活性的生物素，这是微生物法区别于其他方法的最大特点。

但由于其他营养物质能影响微生物的生长，进而影响分析结果，所以该法并非都能达到高准确性。

2.2 高压液相色谱法[6]
生物素很难用普通HPLC 技术分析，因为它没有UV 发色团，它必须用紫外检测器在低UV波长下测定。

HPLC 分离原理是根据被分离组分在流动相和固定相之间的各种微观作用的差异。

当混合物中的各组分随流动相移动时，在流动相和固定相之间进行反复多次分配，这样就使结构或性质不同的组分在移动速度上产生了差异，从而得到了分离。

HPLC 法测定生物素，简便、快速、灵敏度高、重复性好、适应性好，但对某些成分复杂、色素较多、杂质干扰大的样品，不宜用该法检测。

2.3 荧光法
荧光法测定生物素的原理是生物素与异硫氰酸荧光素抗生物素蛋白反应，引起荧光强度
增加，
生物素浓度与荧光强度增加有一定的定量关系，用标准曲线法可求得试样中生物素的浓度，可用于微量分析。

该法灵敏度大大高于分光光度法，选择性也比分光光度法好，但是它的应用不如分光光度法广泛，原因为并不是所有的物质都产生荧光。

荧光法分析生物素是基于与生物素关联密切的、很灵敏的色氨酸荧光，但如果色氨酸含量高，测定结果则会受到影响，所以该方法不适合于生物性材料的生物素检测。

荧光分光光度法测定生物素灵敏度高，方法简便、快速，但对供分析用试样要求甚高，试液应无色、无浑浊。

3生物素用量在发酵中的控制[7]
谷氨酸产生菌是营养缺陷型, 所以生物素对谷氨酸产生菌的生长繁殖很重要, 对其代谢产物的影响也非常明显。

当生物素过量时酵解途径中的丙酮酸转变为乳酸, 同时也使异柠檬酸转变为琥珀酸,菌体生长繁殖快,同时生物素又促进菌体细胞膜通透性障碍物的生物合成, 生物素控制直接影响生产菌细胞的生长、繁殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性和产酸率, 控制好生物素的用量是谷氨酸发酵的关键。

目前发酵生产大都采用生物素缺陷型的菌种, 在生长繁殖期对生物素的依赖性很大,生物素低了生长繁殖很慢,对糖的酵解慢,细胞内作为辅酶的生物素存量少,影响进入合成期后对糖的代谢和谷氨酸的合成；但是生物素过量,菌体生长、繁殖时间长,菌体量大、镜检菌体呈短小头圆、八字型的多,进入合成期后对糖的氧化消耗占比例大,谷氨酸合成量少，菌体细胞膜的渗透性不好, 使菌体不能及时将细胞内的谷氨酸排出，谷氨酸合成途径受阻,发酵液中由菌种细胞排出的谷氨酸仅能占氨基酸总量的12%；生物素亚适量时,菌体代谢失调,细胞膜通透性增强,细胞内的谷氨酸能及时排出, 有利于谷氨酸的积累,发酵液内由菌体细胞排除谷氨酸能达总氨基酸的92%左右。

生物素用量要根据使用菌种的特性, 发酵的接种量、大罐增殖细胞的湿菌体量、及培养基成分的种类、供氧能力的大小而确定。

随着谷氨酸发酵控制技术和经验的提高积累、供氧能力的改善,采用生物素适量的发酵工艺，已成为提高产酸的重要途径。

在生物素用量的控制中不但要考虑到培养基中原料:玉米浆、糖蜜、纯生物素的生物素总量,同时要考虑到糖液因玉米淀粉和生产工艺的变化造成的营养素(生物素和维生素)的变化,适时的根据发酵耗糖、产酸、及发酵的容氧情况调整培养基中生物素配比, 控制生物素用量, 充分满足生长、耗糖、合成谷氨酸的需要,又不要出现负面的影响。

参考文献：
[1] 陈宁主编. 氨基酸工艺学[M]. 北京：中国轻工业出版社，2013.1
[2] 张立德. 谈谈谷氨酸发酵-生物素“亚适量”与“超亚适量”的控制[J]. 发酵科技
通讯, 2000, 29(3): 14-16
[3]徐幼平,陈正贤,吴建祥,等.微生物发酵液中生物素含量的ELISA测定[J].微生物学通报,2000,27(1):47-50
[4]刁立兰,李秀珍,王燕,等.生物素测定方法的分析[J].食品与发酵工
业,2007,33(6):104-107。

[5]祖荫光，周利.谷氨酸发酵中生物素含量的测定[J].发酵科技通讯，2003，32（2）：18-19
[6]余林梁,黄晓兰,吴惠勤.饲料中生物素的高效液相色谱测定[J].分析测试学报,2003,22(5):102-104
[7]蔡云苓,张恒忠,张兵等.谷氨酸发酵主要影响因素及其控制[J].发酵科技通讯,2007,36(3):11-13。