核酸类药物

（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点：
①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株；
②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌；
已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：
①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸 腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸 苷。
② 从 鸟 苷 （ 300mmol ／ L ） 与 胸 腺 嘧 啶 （ 300mmol ／L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷 酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷， 然后经化学法合成胸苷。
1979年用 从E．Coli中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶 和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷 转化为阿糖腺苷。
（二）生产工艺
1、酶-化学合成法
最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用 尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应，生成 氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后 利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。
（一）结构与性质
AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药 。 AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮2′-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧 啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的 DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。
（二）生产工艺
此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从 DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复 杂，成本很高。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内 释放出来。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
（二）生产工艺
酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和 TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷
采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用 嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。
四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosine arabinoside， Arabinosyl Cytosine，Aracytidine）
③它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧， 在某一特定的范围内累积大量核苷。
1．发酵法生产肌苷 (枯草杆菌)
2、发酵法生产鸟苷和黄苷 (肌苷产生菌 )
3、发酵法生产腺苷 (产氨短杆菌 )
第二节 核酸类药物
核酸类药物可分两大类。一类为具有天然结构的 核酸类物质，这些品种都是生物体合成的原料，或 是蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代谢 的辅酶。缺乏这类物质会使生物体代谢造成障碍， 发生病态。提供这一类药物，有助于改善机体的物 质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺 氧组织恢复正常生理机能。
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产
一、RNA与DNA的提取与制备
（一）RNA的提取与制备
1、工业用RNA的提取
（1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。
（一）结构与性质
阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是 阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶 于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。
阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制
DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑 制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。 只能注射。
（二）生产工艺 1．以5＇－CMP为原料的合成法 （1）工艺路线：
三、三氮唑核苷
（一）结构与性质
三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病 毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174～176℃， 易溶于水。
这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、 鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸， 抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制 病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多， 不易使病毒产生抗药性。
（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很 好 的 资 源 。 取 100g 压 榨 啤 酒 酵 母 （ 含 水 份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）。
（1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：
5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取 RNA 配 成 3 ％ ～ 3.5% 的 水 溶 液 ， 加 氢 氧 化 钠 达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。
（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA 沉 淀 出 来 。 上 法 的 缺 点 是 制 得 的 RNA Mr 较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。
第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类 似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗 病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、 免疫抑制的临床药物。
第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物 质进行半合成为结构改造物，近年来发展为化学-酶 合成法。大大提高收率，降低成本。
一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）
2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分 钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后 离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣 碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十 二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离 心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可 得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 ％ 十 二 烷 基 磺 酸 钠 达 1 ／ 10 体积 ， 搅 拌 1 小 时 ， 经 5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L， 再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗 涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制 备需在0～3℃操作）。
2、工艺过程：
①水解：并加入处理好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体 积为7.5L，升温至90℃，在不断搅拌下，于pH9下进 行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶 液，离心分离，取上清液5至10μl，pH9.2电泳分析， 检查水解程度。
②氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm （pH2）
例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温 度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L， 反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。
三、核苷的制备 本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 （－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
（－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程（图14·8）
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 产（I十G）工艺 。
4．菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是 产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生 尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶 （Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从 阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可 制成固定化细胞进行连续生产。
2、以5`-AMP为原料的化学合成
（三）作用与用途
阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制 剂，对单纯疱疹Ⅰ为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。
阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷， 是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以 dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺 三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同 一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有 较高选择性。
二、阿糖腺苷Adenine arabinoside
（一）结构与性质
阿糖腺苷的化学名称为9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤， 或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。
早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美 国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972 年日本用Strepto－myces hebacecus 4334菌株发酵法分 别制备了阿糖腺苷。