核酸类药物

二、阿糖腺苷Adenine arabinoside
（一）结构与性质
阿糖腺苷的化学名称为9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤， 或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。
早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美 国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972 年日本用Strepto－myces hebacecus 4334菌株发酵法分 别制备了阿糖腺苷。
（二）发酵法生产核苷酸 1．发酵法生产肌苷酸（IMP） 2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸
（三）半合成法制备核苷酸
由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸 三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷， 进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。
例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温 度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L， 反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。
（二）生产工艺
酶合成法 使用产气肠杆菌，以（尿苷）肌苷和 TCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷
采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用 嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶。
四、阿糖胞苷（Cytarabine，Cytosine arabinoside， Arabinosyl Cytosine，Aracytidine）
（二）发酵法生产核苷
发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果， 产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种 核苷的菌株有着许多共同特点：
①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小 芽抱杆菌为诱变出发菌株；
②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性 状上具有特定标记的诱变菌；
（2）高RNA含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛选 到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法 提高酵母菌的RNA含量。
稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变 性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然 后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使 RNA 沉 淀 出 来 。 上 法 的 缺 点 是 制 得 的 RNA Mr 较 低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90 ℃保持 3~4h破坏酶)。
已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：
①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸 腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸 苷。
② 从 鸟 苷 （ 300mmol ／ L ） 与 胸 腺 嘧 啶 （ 300mmol ／L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷 酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷， 然后经化学法合成胸苷。
（1）菌体自溶法生产核莆酸工艺流程：
5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸
RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定， 很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更 不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。 取 RNA 配 成 3 ％ ～ 3.5% 的 水 溶 液 ， 加 氢 氧 化 钠 达 0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用 6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸 制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特 异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和 放疗后的升白血球均有较好疗效。
例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温 度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L， 反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。
三、核苷的制备 本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。 （－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷
（－）RNA化学水解法制备核苷 1．核苷生产工艺流程（图14·8）
2、工艺过程：
①水解：并加入处理好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体 积为7.5L，升温至90℃，在不断搅拌下，于pH9下进 行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶 液，离心分离，取上清液5至10μl，pH9.2电泳分析， 检查水解程度。
②氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm （pH2）
酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程
3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）
呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠， 商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得 GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生 wenku.baidu.com（I十G）工艺 。
4．菌体自溶法生产核苷酸
磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA 可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法 生产5‘-核苷酸。
（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的 很 好 的 资 源 。 取 100g 压 榨 啤 酒 酵 母 （ 含 水 份 70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20℃以下缓 慢搅拌30分钟。用6mol／L HCl调至pH7，搅拌15 分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol ／L HCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g （纯度80％）。
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 （一）酶解法及碱水解法制备核苷酸 1、酶解法制备脱氧核苷酸
桔青霉产生5`-磷酸二脂酶 红酵母产生3`-磷酸二脂酶
2、酶解法制备戊糖核苷酸
我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产 单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸） 3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。
第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类 似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗 病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、 免疫抑制的临床药物。
第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物 质进行半合成为结构改造物，近年来发展为化学-酶 合成法。大大提高收率，降低成本。
一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）
三、三氮唑核苷
（一）结构与性质
三氮唑核苷商品名病毒唑，对DNA病毒，RNA病 毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174～176℃， 易溶于水。
这个化合物经X线解析，它的立体结构与腺苷、 鸟苷非常类似，在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸， 抑制肌苷酸脱氢酶阻断鸟苷酸的生物合成，从而抑制 病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多， 不易使病毒产生抗药性。
1979年用 从E．Coli中分离得到的尿嘧啶磷酸化酶 和嘌呤核苷磷酸化酶，以固相酶的方法将阿糖脲苷 转化为阿糖腺苷。
（二）生产工艺
1、酶-化学合成法
最新的阿糖腺苷的合成法是酶-化学合成法：用 尿苷为原料经氧氯化磷和二甲基甲酰胺反应，生成 氧桥化合物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后 利用阿糖尿苷中的阿拉伯糖经酶法转化成阿糖腺苷。
第十四章 核酸类药物
第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产
一、RNA与DNA的提取与制备
（一）RNA的提取与制备
1、工业用RNA的提取
（1）RNA及其工业来源 从微生物中提取RNA是工 业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰 富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝 体——青霉素，制霉菌素等菌体。
2、具有生物活性DNA的制备
动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水 经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分 钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后 离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣 碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十 二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离 心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可 得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温 干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 ％ 十 二 烷 基 磺 酸 钠 达 1 ／ 10 体积 ， 搅 拌 1 小 时 ， 经 5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L， 再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗 涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制 备需在0～3℃操作）。
通 常 在 细 菌 中 RNA 占 5 ％ ～ 25 ％ ， 在 酵 母 中 占 2.7 ％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。
在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中 关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率 高，易于提取RNA。
很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高， 其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。
浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同 时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内 释放出来。
要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯 酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水 溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。
脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于 0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。
（二）DNA的提取与制备
1．工业用DNA的提取
取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状， 加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌， 升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃， 离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA 的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解 生 产 脱 氧 核 苷 酸 。 如 要 制 成 固 体 状 DNA ， 在 热 变 性 DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤 维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得 DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。
（一）结构与性质
AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药 。 AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮2′-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧 啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的 DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。
（二）生产工艺
此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从 DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复 杂，成本很高。
（三）作用与用途
阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱DNA病毒抑制 剂，对单纯疱疹Ⅰ、Ⅱ型，带状疱疹，巨细，牛痘 等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用。目前认 为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。
阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿糖腺三磷， 是脱氧腺三磷（dATP）的拮抗物，从而阻抑了以 dATP为底物的病毒DNA聚合酶的活力。而且阿糖腺 三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同 一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有 较高选择性。
经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是 产气肠杆菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生 尿苷磷酸化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶 （Pynpase），用这个菌株的休止细胞作为酶源，从 阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可 制成固定化细胞进行连续生产。
2、以5`-AMP为原料的化学合成
（一）结构与性质
阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是 阿拉伯糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶 于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。
阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制
DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷从而抑 制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。 只能注射。
（二）生产工艺 1．以5＇－CMP为原料的合成法 （1）工艺路线：
③它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧， 在某一特定的范围内累积大量核苷。
1．发酵法生产肌苷 (枯草杆菌)
2、发酵法生产鸟苷和黄苷 (肌苷产生菌 )
3、发酵法生产腺苷 (产氨短杆菌 )
第二节 核酸类药物
核酸类药物可分两大类。一类为具有天然结构的 核酸类物质，这些品种都是生物体合成的原料，或 是蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代谢 的辅酶。缺乏这类物质会使生物体代谢造成障碍， 发生病态。提供这一类药物，有助于改善机体的物 质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺 氧组织恢复正常生理机能。