染色体制备实验
染色体 实验报告
染色体标本的制备及组型实验生命科学学院张瀛【实验目的】1．掌握染色体标本的制作方法。
2．认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图。
【实验用品】小白鼠，秋水仙素，生理盐水，0.3%KCl液，固定液，铜网，酒精灯，离心机，注射器，剪刀，镊子，载玻片，滴管，显微镜等。
【实验原理】染色体标本制作的原理细胞分裂中期染色体形状较为清楚，故使用中期细胞，并以每条染色体相对独立存在为染色体标本制作的四大要点1）PHA：促细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞。
2）秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。
（相同作用：秋水仙胺、长春碱、鬼臼素）3）低渗作用：水进入细胞内，使细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体分散开。
4）空气干燥：使细胞和染色体展开。
5）固定：用camoy`s solution（甲醇：冰醋酸=3:1）作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白来说，变形后硬度增加，保持了染色体的“即时形态”，对细胞膜蛋白来说，变形使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。
染色体标本制作的意义根据染色体的特征（数目、形态、大小等）制作染色体组型图。
染色体标本制作的应用1） 生物学方面：根据染色体特征鉴别生物及种类。
染色体数目：兔-44条，猫-38条，狗-78条，马-64条，人-46条，小鼠-40条（18对端着丝粒染色体，第17、18对为亚端着丝粒染色体），大鼠-42条，鸡-78条。
2） 临床医学方面：主要用于遗传性疾病的诊断及研究。
因此，染色体组型实验广泛应用于胎儿遗传性疾病早期诊断中（抽取羊水）。
染色体组型把真核生物的一个体细胞中的各个染色体按其长度、形状和着丝粒的位置排列成一定顺序的过程，即为染色体组型。
染色体核型染色体组型是染色体核型的模式表达。
染色体组型及分群依据主要根据染色体的相对长度，着丝粒的位置，其次是臂的长短，以及次级缢痕或随体的有无等方面。
人类外周血染色体标本制备
14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）
四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度 链霉素终浓度
10、再固定： 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰3），固定 20分钟。
11、再离心
1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留沉淀。
12、再固定 加入固定液（甲醇︰冰醋酸 = 1︰1）打匀，固定 20分钟。
13、制片
固定后， 1000rpm离心10分钟，留下 0.2ml 沉淀物，吸取细胞 悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯 焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（dir drying）。
5、 甲醇 （ methanol ）
6、 冰醋酸 （acetic glacid）
二者以不同比例配合使用
新鲜配制
７、吉姆沙染液（Giemsa）
吉姆沙由天青、伊红和甲基蓝组成 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘油，在研钵 中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再加入33毫升甲醇，滤纸 过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要提前半年配制。原液中按比例加入 磷酸缓冲液即可染染色体标本。
1份Giemsa原液＋ 9份磷酸缓冲液
８、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸馏水中。 溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升蒸馏水中。 100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。
骨髓染色体r显带制备实验流程
骨髓染色体r显带制备实验流程
一、实验目的
通过骨髓细胞染色体G显带的制备,观察染色体形态,掌握骨髓细胞染色体G显带制备的基本方法。
二、主要仪器和试剂
1.细胞培养箱、倒置显微镜、低温高速离心机、水浴、恒温培养箱、微量吸液器等仪器设备。
2.RPMI 1640培养基、胎牛血清、秋水仙素、KCl、固定液、 Giemsa 染色液等。
三、实验步骤
1.取患者骨髓液,加入RPMI 1640培养基,接种细胞,孵育72小时。
2.加入秋水仙素进行细胞周期同步,继续培养4-5小时。
3.收集细胞,低速离心,弃上清。
加入0.075M KCl hypotonic solution,37°C水浴20分钟。
4.1000r/min离心5分钟,弃上清,加入新配制固定液,混匀。
5.4°C固定过夜。
6.将固定后的细胞涂片,自然风干。
7.苏木精-伊红染色液染色,显微镜下观察染色体形态。
四、实验结果
成功制备出骨髓细胞染色体G显带,在显微镜下可清晰观察到染色体形态。
染色体制备的实验原理
染色体制备的实验原理
染色体制备是一种从细胞中提取染色体的方法，通常用于研究染色体的结构和功能。
以下是染色体制备的基本原理：
1. 细胞收集：选择需要研究的细胞类型并进行培养，使其增殖到足够数量。
2. 处理细胞：细胞在特定条件下被处理，以使染色体膨胀并保持其形态和结构。
3. 染色：染色体被染色以提高其可视性。
不同的染料和处理方法可用于不同类型的研究。
4. 制备幻灯片：染色体被放置在玻璃幻灯片上，并用显微镜观察。
通过染色体制备，可以观察染色体的形态、大小、数量、分布等特征，并进一步研究其在遗传学和细胞生物学中的作用。
染色体的制备方法
染色体的制备方法
染色体的制备方法主要有以下几种：
1. 细胞培养法：通过细胞培养的方法，从活体或死体组织中获得细胞，然后使用染色体解链剂和有机溶剂处理细胞，使其逐渐膨胀、变形和破裂，最终释放出染色体。
2. 细胞分离法：通过细胞分离的方法，从组织或器官中获得单个细胞，然后使用低渗透压溶液处理细胞，使其逐渐肿胀、破裂，最终释放出染色体。
3. 放射线照射法：通过将细胞暴露在放射线（通常是X射线或γ射线）下，使染色体发生断裂和破裂，然后使用染色体解链剂溶解细胞核膜和蛋白质，最终得到染色体。
4. 高压法：通过将细胞置于高压环境中，如用注射器将细胞悬浮液喷射到高压室中，或使用高压装置将细胞悬浮液注入对高压有抵抗能力的微孔滤纸上，然后用染色体解链剂处理细胞，最终释放出染色体。
5. 集落法：将细菌或酵母等微生物的细胞培养在富含染色体的培养基上，然后使用染色体解链剂处理细胞，最终从细胞中释放出染色体。
这些方法各有优点和局限性，选择合适的染色体制备方法要根据研究目的和样本
的特点来确定。
实验一 植物染色体制备和观察
实验一植物染色体制备和观察
一、实验目的
1．学习植物染色体制片技术；
2．通过观察染色体在有丝分裂过程中，了解染色体的动态变化；
二、实验准备
（按每实验小组2人准备）
1．仪器
显微镜1台、水浴锅（大组合用一）、冰箱1、培养箱1、干燥箱1
2．器械（均放在小磁盘内）
镊子2、解剖针2、剪子2、50ml烧杯1、吸管1、玻片架1
3．药品（4人一套）
醋酸洋红、1mol HCl、二甲苯（通用）[均分装在60ml滴瓶]、蒸馏水10L（通用）4．耗材
载玻片4、盖玻片6、滤纸2、擦镜纸1本（通用）、
5．材料
洋葱或大蒜根尖（预先生根、固定、低温保存）
三、实验原理
温盐酸处理根尖的作用：
1．可破坏植物细胞间的连接物质，使细胞分散；
2．可破坏细胞壁，使根尖细胞软化，有利于压片；
3．使DNA潜在的醛基得以暴露，能被碱性染料染色，使整条染色体能均匀着色。
四、实验步骤
大蒜生根1cm→9:00固定→第二天9:00保存于75%酒精4℃→取根尖→水洗→1mol HCl 60℃处理8min→水洗→取一根尖置于干净载玻片上→取分生区→夹碎→滴染液1d染色→8min（搅拌至碎）→盖盖玻片→轻敲分散→覆盖滤纸→带液速压→吸去多余染液→观察→高倍镜下绘图
五、作业
1．温盐酸处理根尖的作用是什么？
2．绘图：间期、前期、中期、后期、末期实景图。
实验九小鼠骨髓细胞染色体标本制备
四、实验步骤
1、预处理：实验 。作用：
2、处死动物：断颈处死小白鼠， 解剖小鼠内生殖器官，鉴别雌雄性别
3、取股骨：剥取股骨，剔去肌肉 组织，剪去两端的股骨头。
11、滴片：用吸管吸取细胞悬液， 滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰 上微微加热，室温晾干。预冷载玻片 的作用：
12、染色：10% Giemsa染液染色30分 钟。
13、镜检：低倍———高倍 。
五、作业
1、选择染色体清晰，分散好的 中期分裂相，计数染色体，显微摄影、 并打印出照片。
2、分析成功或失败的原因。
4、取骨髓：注射器吸取0.6ml生 理盐水, 针头插入股骨一端,反复冲 洗骨髓到10ml的离心管中。
5、低渗：加入4.4ml的 0.075MKCl溶液,在37oC水浴中低渗40 分钟，中间（约20分钟时）用吸轻轻 管吹打，使细胞充分低渗。低渗作用
6、离心：离心之前加1ml固定液 并用吸管轻轻吹匀，进行预固定；
同时秋水仙素作用能使染色体缩短、 变粗。
三、实验材料、器具和药品：
1、材料： 小白鼠 2、器具：
注射器（1ml,5ml）、5号针头、 解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、 10ml刻度的离心管、离心机、载玻片 盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉 花、量筒、天平、恒温水浴锅等。
3、药品： 0.01%秋水仙素、0.075MKCl、
一、实验目的
1、掌握哺乳动物（小白鼠）骨 髓细胞染色体制片技术。
2、并对动物染色体进行观察。
二、实验原理
1、小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造 血干细胞是生成各种血细胞的原始 细胞，具有高度的分裂增殖能力。
实验五 人类染色体标本制备
实验五人类染色体标本制备【目的要求】1．熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2．初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。
3．了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。
人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞(主要是小淋巴细胞)具有潜在的细胞分裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素(PHA)可使处于G0期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/L KCl对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】(一) 材料：人外周静脉血。
(二) 器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。
(三)试剂1. RPMI1640培养液(1) RPMI1640：RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。
(2) RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg、青霉素(终浓度100 U/ml)、链霉素10000 μg (终浓度100 μg /ml)，15磅、20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7.2～7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
(3) 配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2 d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
动物骨髓细胞染色体标本的制备实验报告
动物骨髓细胞染色体标本的制备实验报告实验目的：本次实验的目的是通过制备动物骨髓细胞染色体标本，加深对细胞遗传学和染色体结构的理解，同时掌握常规细胞检测技术。
实验原理：细胞核持有着生物体的遗传信息，而染色质可以分为染色体和非染色体两种，其中染色体是由DNA及其辅助蛋白组成的。
通过细胞分裂过程中，染色体会缩短、厚度增加、染色带可清晰分辨等特点来进行分类和编号。
利用这些特点可以制备出动物骨髓细胞染色体标本。
实验步骤：1. 首先准备动物骨髓细胞样品，可通过小鼠骨髓涂片或静脉血（受试者需要同意），将样品转移到已经预处理好的无菌平板上。
2. 在离心管中加入10ug/ml的柱前荧光素-ethidium bromide(PI)，再将细胞样品加入离心管中，轻轻摇晃片刻，稍微放置几分钟。
3. 用宽口的滴管取少许制片液，滴在已经处理好的载玻片上，尽量保证滴管斜着滴落制片液，避免气泡出现，将载玻片浸泡于制片液中。
4. 轻轻捞取离心管中的细胞样品，均匀地滴在制片液的中心处，然后放置在湿度大于80%，温度为37°C的恒温箱内1-2h。
5. 制片完成后，对载玻片进行显微镜检查，选择细胞密度适当、染色较清晰的染色体标本进行下一步操作。
6. 将载玻片放置在冷却的媒体溶液（0.075mol/L KCl及0.9%NaCl）中，冷冻10-20min。
7. 取出载玻片，使用正差相干显微镜观察着染色体的分布和形态，并进行拍照记录。
8. 得到的染色体标本可用于常规染色体学诊断。
实验结果：通过本次实验制备得到的动物骨髓细胞染色体标本，可以进行常规染色体学分析，观察细胞核中的染色体数目、形态和结构等特征，并可以用于细胞遗传学研究和临床诊断。
实验结论：本次实验通过制备动物骨髓细胞染色体标本，加深了对细胞遗传学和染色体结构的理解，同时掌握了常规细胞检测技术。
通过观察和分析染色体标本的形态和结构，可以进行细胞遗传学的研究与临床诊断。
实验七果蝇唾液腺染色体的制备
03
实验步骤
果蝇的培养和选择
培养基的制备
选择适当的培养基，如玉米粉、琼脂、 酵母粉和水等，按照一定比例混合， 制备培养基。
接种果蝇
选择果蝇
选择健康、繁殖力强的果蝇进行实验， 确保实验结果准确可靠。
将果蝇接种在培养基上，控制温度和 湿度，让果蝇在恒定的条件下生长。
唾液腺的摘取和固定
摘取唾液腺
使用显微操作器或镊子小心摘取果蝇的唾液腺。
染色体结构
染色体结构致密，表面光滑，没有明 显的突起或凹陷。染色体的染色深浅 不一，呈现出不同的带型特征。
染色体数目的统计和分析
染色体数目统计
通过显微镜观察和拍照，我们统计了不同果蝇唾液腺细胞中的染色体数目。结果显示，果蝇唾液腺细胞中的染色 体数目为8，与正常体细胞中的染色体数目一致。
染色体数目分析
本实验的局限性和改进方向
局限性
本实验主要依赖于人工操作和识别染色体， 因此，实验结果可能受到操作者主观因素的 影响。此外，实验样本数量有限，可能影响 结果的普遍性。
改进方向
为了提高实验的准确性和可靠性，可以引入 更加客观的染色体识别和计数方法，如使用 计算机辅助分析软件。同时，增加样本数量 和重复实验次数也是必要的改进措施。
体。
形态
染色体呈线状或棒状，具有特定的 形态和结构。
功能
染色体在细胞分裂和遗传过程中起 着关键作用，负责基因的复制和传 递。
染色体的制备原理
染色体的提取
通过特定的方法将细胞核 中的染色体提取出来。
染色体的染色
使用特定的染料将染色体 染色，以便在显微镜下观 察。
制备过程
经过一系列的洗涤、消化、 离心等步骤，最终获得纯 净的染色体样品。
实验动物染色体标本的制备与观察
注射器 解剖器 移液管 载玻片 盖玻片 光学显微镜
四、实验内容
1、注射秋水仙素（按4μg/g的剂量） 2、取骨髓细胞：股骨，剪掉两端，2%柠檬酸钠冲 洗，离心管收集，取下针头，反复吸打 3、低渗： 0.4%Kcl，8~10ml，37±0.5℃， 10min； 1000rpm，8min 4、固定：固定液5ml，注意不要冲动细胞团块 （？），轻轻吸打细胞，静置20min。固定2~3次。 5、滴片：干净、冷、湿的载玻片上，2~3滴，文 火烘干。 6、染色:Giemsa染液,10min。 7、镜检。（绘图） 疑问：有的染成蓝色，有的染成紫红色，为什么？
3、小白鼠染色体的特点：呈“U”型，全部 为端着丝粒染色体； 40条（19对常+1对性）
一些常见动物的染色体数目： 家兔：44 野兔：48 猪：38 黄牛：60 马：64 驴子：62 骡子：63 猩猩：48 金丝猴：44 猫：38 狗：78
三、实验材料与仪器
1、材料：小白鼠 2、试剂：
2%柠檬酸钠、0.1%秋水仙素（现用现 配）、Giemsa染液（pH6.8） 0.4%Kcl溶液
颈椎脱臼法
股骨
取骨髓细胞
滴片
图: 小白鼠染色体
拓展实验
1、实验前不给小白鼠腹腔注射秋水仙素 （每组2只）
2、注射秋水仙素后2h、 4h、 6h、 8h 后再进行试验
五、作业及思考题
1、制备的小白鼠染色体标本，分裂相是否 多，染色体分散程度如何？有什么不足处， 原因何在？
2、如果在实验前不给小白鼠腹腔注射秋水 仙素，所制备的染色体制片会出现怎样的情 况？
染色体的标本制作实验
实验六染色体的标本制作及其组型实验在真核生物中染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。
染色体作为遗传物质-DNA 的载体对生物的遗传、变异、进化和个体发生以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。
每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。
将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置以至带型有序地排列起来此模式图象排列即为核型karyotype或染色体组型。
核型分析均是以中期染色体为标准对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象并将其剪裁排列即成。
华裔学者庄有兴Joe Hin Tjio腿鸬溲д逜.Levan合作利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条而不是前人所主张的48条这为后来的人类核型研究奠定了基础。
1.实验目的 1.1 初步掌握动物骨髓染色体标本制备基本过程了解操作步骤的原理。
1.2了解常用实验动物染色体的数目及特点。
通过组型实验掌握染色体组型的基本方法2.实验原理凡细胞处于活跃增殖状态或者经过各种处理后细胞就可进入分裂的任何动物组织均可用于染色体分析。
在正常动物体内精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织。
给动物注射一定剂量的秋水仙碱即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期然后采用常规空气干燥法制备染色体即可得到大量可分析的染色体标本。
本方法简便、可靠不需要经体外培养和无菌操作易于推广。
骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。
但在取材方面精巢又比骨髓要简易一些故本实验也选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成使细胞分裂停滞在中期使中期染色体停留在赤道面处2. 用低渗法使将细胞膨胀以至于在滴片时细胞被胀破使细胞的染色体铺展到载玻片上3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
染色体标本的制备及组型观察 实验报告
细胞生物学实验报告染色体标本的制备及组型观察1.实验目的：掌握染色体标本制作的基本方法；认识不同生物的染色体的状态，学会做染色体组型图。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯（1）实验药品：蒸馏水、0.9% NaCl溶液、0.3% KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、秋水仙素（2）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）制作染色体标本的意义：了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。
染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。
（2）染色体组型图的应用①鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64条②遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X或Y染色体）等因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。
（3）染色体标本的制作①观察：由于分裂期中期的染色体染色体凝集程度最高，因而我们应尽量使细胞停留在分裂期中期以便观察。
②细胞：为尽量看到多的染色体，我们应当选取具有旺盛分裂能力的细胞，这样的细胞可以来自:胸腺、骨髓、睾丸、小肠等。
我们在此实验中使用的是小鼠的精巢细胞。
在做人的染色体标本时，我们使用的是血液里的淋巴细胞。
③药物：PHA（植物细胞凝集素）：PHA具有促进细胞凝集和分裂的作用。
PHA可以使血液中的淋巴细胞还原至淋巴母细胞（只存在于骨髓中）秋水仙素：秋水仙素可以破坏微管的组装，纺锤体不能形成，细胞分裂停在中期。
与秋水仙素作用相同的药物还有长春花碱、鬼臼素、苯环己烯等。
可以促进胃管组装的药物有紫杉酚、重水等。
④空气干燥：使细胞与染色体易于分离⑤低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体距离变大，易于分离、展平。
实验五人类染色体标本制备
实验五人类染色体标本制备【目的要求】1 •熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理。
2.初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。
3•了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法。
【实验原理】人类间期细胞核中的遗传物质染色质，在细胞进入分裂期时，经逐级螺旋形成染色体。
在分裂期的中期，染色体达到最大程度的凝集，表现为短而粗的典型结构。
人外周血的有形成分中，只有白细胞有核，而白细胞中只有淋巴细胞（主要是小淋巴细胞）具有潜在的细胞分裂能力。
培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素（PHA）可使处于G期、具有潜在分裂能力的淋巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞，并进入旺盛的有丝分裂周期；加入纺锤体抑制剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期，在收获细胞时，用低渗剂0.075mol/L KCI对细胞进行低渗处理，可使胞膜胀破，染色体均匀分散；经离心、固定、制片等过程，最终可获得便于观察分析的染色体标本。
制备的染色体标本片，不经特殊处理，直接染色，在显微镜下观察识别，并进行核型分析的过程称为染色体非显带核型分析。
【实验用品】（一）材料：人外周静脉血。
（二）器材：吸管、刻度离心管、量筒、5ml注射器、6号针头、台式离心机、试管架、冷藏载玻片（一端磨砂）、铅笔、酒精灯、超净工作台、恒温水浴箱、载玻片、止血带、酒精棉球、显微镜、废液缸。
（三）试剂1. RPMI1640 培养液（1） RPMI1640 : RPMI1640固体培养基10.4 g,溶于1000 ml双蒸水中，抽滤除菌。
（2） RPMI1640培养液：每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml、灭活的小牛血清20 ml、PHA 50 mg 青霉素（终浓度100 U/ml）、链霉素10000卩g （终浓度100卩g /ml）, 15磅、20min高压灭菌的NaHCO调pH至7.2〜7.4，分装20小瓶，每瓶5 ml。
（3）配制方法配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净，烘干，放入清洁液中浸泡2d，取出后用自来水冲洗15次，蒸馏水冲洗3次，双蒸水冲洗1次，烤干后包装，15磅20 min高压灭菌。
骨髓染色体制备流程
①前处理:在实验前24~36小时,按0.5ml/25g体重的剂量往小鼠腹腔内注射预温至37℃的10℅的酵母葡萄糖溶液。
②注射酵母液24~36小时后,往小白鼠的腹腔内注射秋水仙素(注射量按8.4ug/1g体重计算),注射后10~12小时取材。
③取股骨:用颈椎脱臼法处死小鼠,立即用剪刀剪掉大腿上的皮肤和肌肉,暴露股骨及其两端相连的关节和膝关节。
然后从肌骨两端关节头处剪下股骨,用卫生纸擦净股骨上残余的肌肉和血液。
④收集骨髓细胞:剪掉股骨两端膨大的关节头,暴露出骨髓腔,用吸有适量生理盐水的注射器从股骨一端插入注射针头,将骨髓冲入10ml刻度离心管内,可反复冲洗数次,直至股骨变白为止。
此时离心管中的细胞悬液可达6~8ml,将离心管平衡后放入离心机以1000rpm/min离心8分钟。
⑤低渗处理:吸去上清夜,留沉淀物,加入6~ 8ml0.075mol/L氯化钾低渗液(低渗液需先置37℃水浴箱内预温),用吸管将细胞团吹打均匀,置37℃水浴箱内低渗处理15分钟。
⑥预固定:低渗处理完成后,立即加入1ml新配制的固定液,混匀后以1000rpm/min离心8分钟。
⑦固定:吸去上清夜,加入固定液6~8ml(甲醇∶冰乙酸=3∶1),用吸管吹打混匀静置15分钟。
然后以1000rpm/min离心8分钟,吸去上清夜。
⑧重复第7步骤。
⑨制备细胞悬液:吸弃上清夜后,视离心管底细胞沉淀量的多少而加入3~8滴固定液,用吸管轻轻吹打成细胞悬液。
⑩滴片:吸取细胞悬液滴到预冷的载波片上,每片滴2~3滴,然后立即对准玻片吹一口气,使细胞悬液散开,并迅速将玻片在酒精灯火焰上来回过几次以助染色体分散。
细胞生物学实验7-染色体制备技术
实验7 染色体制备技术〔实验目的〕1、学习染色体标本的制备技术2、掌握滴片法制备染色体标本的一般步骤〔实验原理〕每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体，在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。
〔试剂材料〕1、试剂（1）0.1%秋水仙素溶液（生理盐水配置）（2）1mol/L盐酸（3）1%柠檬酸钠溶液（4）0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）Na2HPO4﹒12H2O 11.81g(Na2HPO4﹒2H2O 5.92g)KH2PO4 4.5g蒸馏水至1L（5）Giemsa原液（pH6.8）（pH6.8）Giemsa染粉1g，甘油33ml, 甲醇45ml 染粉在乳钵中滴加少许甘油研磨至无颗粒，再将全部甘油加入，放入60-65℃保温2小时后加入甲醇混匀。
棕色瓶中保存。
用时和磷酸缓冲液1：10混合（6）低渗液：0.4%KCl2、材料（1）洋葱根尖（2）女性口腔上皮（3）蟾蜍〔内容方法〕X染色体标本制片与观察1、取材：女性漱口后取口腔上皮细胞，涂在干净的载玻片上2、固定：95%乙醇固定10分钟，空气干燥3、水解：1mol/L盐酸室温水解10分钟，然后用新鲜蒸馏水冲洗4次，晾干4、染色：Giemsa染色10分钟，蒸馏水冲后90%乙醇分色1分钟，酒精灯过火脱水。
也可用0.2%甲苯安蓝染色5-15分钟，冲洗后干燥，观察注意事项：1、女性口腔、牙签和载波片要干净，避免杂质干扰。
2、口腔内第一次获取的上皮细胞要弃去，然后在相同部位再获取新鲜的上皮细胞。
3、上皮细胞涂片时尽量使细胞分散开，重叠的细胞影响观察。
4、人的X小体紧贴细胞核膜内侧，但是一般上皮细胞中只有30%-50%的细胞可以观察到X小体。
小鼠骨髓染色体制备1、小鼠按照4μg/g体重经腹腔注射秋水仙素，3-4小时后杀死动物，取后肢股骨和胫骨，纱布剥离所有肌肉，生理盐水洗净后剪去骨两端。
实验七-动物骨髓细胞染色体的制备与观察.
[实验目的]1. 通过青蛙或小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。
2. 熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。
[实验原理]骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。
由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。
这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。
秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。
其次是要能够清楚的观察染色体的形态。
为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。
固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。
染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。
制备优良的标本可获得满意的观察效果。
利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。
一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。
[实验用品]1. 动物：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。
2. 试剂：﹪秋水仙素、l氯化钾 (kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液、香柏油或液体石蜡、二甲苯。
3. 器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（2ml、5ml各一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒（10ml、50ml、100ml各一支），恒温水浴箱，盘架天平（配备等大的小烧杯两个）、电吹风、显微镜、吸水纸、擦镜纸、酒精灯、火柴。
[实验内容与方法]一、试剂配制1. ﹪秋水仙素溶液：秋水仙素2mg，灭活生理盐水（蛙类﹪、哺乳类﹪的nacl）10ml溶解，避光保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
——染色体制备
覃钦博 博士 湖南师范大学生命科学学院 鱼类ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ育生物学实验室
2
1.刺激淋巴细胞的有丝分裂 刺激淋巴细胞的有丝分裂
对实验鱼注射PHA 3次，每次剂量为 体重， 对实验鱼注射 次 每次剂量为8-10 µg/g体重，每一针 体重 PHA的效应时间分别为 的效应时间分别为12h、4h和2h; 的效应时间分别为 、 和 原理：植物血球凝集素（ 原理：植物血球凝集素（PHA）能刺激 淋巴细胞有丝分裂 ）能刺激B淋巴细胞有丝分裂 ，但是过量使用PHA能导致血液凝聚。 但是过量使用 能导致血液凝聚。 能导致血液凝聚
4
3.取材 取材
将实验鱼剪鳃放血，从泄殖腔沿腹部剖开实验鱼， 将实验鱼剪鳃放血，从泄殖腔沿腹部剖开实验鱼，从相应 部位取出肾脏组织（包括前肾和中肾脏）；放入盛有0.8%的生 部位取出肾脏组织（包括前肾和中肾脏）；放入盛有 前肾和中肾脏）；放入盛有 的生 成糊状） 理盐水的培养皿中清洗，用剪刀充分剪碎（ 理盐水的培养皿中清洗，用剪刀充分剪碎（约3min成糊状）材 充分剪碎 成糊状 料后移于离心管中，充分吹打（ 料后移于离心管中，充分吹打（3min)；将离心管中的生理盐水 ； 加至10ml后，静置5-8min。 加至 后 静置 。
5
4.低渗 4.低渗
将样品1000 rpm离心 离心5min，弃上清液；收集的细胞沉淀 将样品 离心 ，弃上清液； 在低渗液（ ），充分吹打使沉淀均匀分散 在低渗液（0.075 M Kcl），充分吹打使沉淀均匀分散，加低 ），充分吹打使沉淀均匀分散， 渗液至10ml，低渗30-40 min；低渗过程中每隔 分钟轻轻吹 ，低渗 分钟轻轻吹 渗液至 ；低渗过程中每隔5分钟 打溶液，使其充分低渗。 打溶液，使其充分低渗。
7
此时细胞体积膨大，处于一个极其容易破裂的状态。 此时细胞体积膨大，处于一个极其容易破裂的状态。 破裂的状态
6
5.固定 固定
低渗后将样品1000 rpm离心 离心5min，收集沉淀；加入甲醇和 低渗后将样品 离心 ，收集沉淀； 冰醋酸(3:1)混合液，轻轻吹打样品沉淀，使其充分散开； 冰醋酸(3:1)混合液，轻轻吹打样品沉淀，使其充分散开；加 (3:1)混合液 样品沉淀 充分散开 入固定液至5ml，并静置15分钟 ，使其充分固定；样品再离心、 使其充分固定；样品再离心、 入固定液至5ml，并静置15分钟 5ml 15 再固定，重复1次后，样品可长期保存（4℃）。 再固定，重复1次后，样品可长期保存（4℃）。 可长期保存
3
2.抑制淋巴细胞有丝分裂 2.抑制淋巴细胞有丝分裂
注射秋水仙素， 体重。 在解剖取材前的2h注射秋水仙素 剂量为2-4 µg/g体重。 体重 在解剖取材前的 注射秋水仙素，剂量为
原理：秋水仙碱能破坏纺锤体，是分裂的细胞处于有丝分裂中期。 原理：秋水仙碱能破坏纺锤体，是分裂的细胞处于有丝分裂中期。 纺锤体 有丝分裂中期