新型巯基化合物近红外BODIPY类荧光试剂的合成与应用研究

新型巯基化合物近红外BODIPY类荧光试剂的合成与应用研究谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)等小分子巯基化合物(RSH)广泛分布于生物体中,在新陈代谢活动中起着关键作用。作为主要的还原物质,RSH可清除活性氧和自由基,维持机体的氧化还原平衡；RSH还可与一氧化氮(NO)反应生成S-亚硝基硫醇(RSNO),作为NO的“储存池”,从而间接参与信号转导。

当RSH含量出现异常时,会导致肝损伤、阿尔茨海默病、癌症、艾滋病等疾病。鉴于巯基化合物在生物体内独特的生理病理功能,检测其在生物体内的含量、含量变化及其动态分布意义重大。

荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、直观、可视化等优势,在化学、生命科学、医学和环境科学等领域应用广泛。近红外(NIRF,>600nm)荧光由于背景干扰少、组织穿透力强、对生物损伤小等优点逐渐成为人们关注的焦点,而性能优异的有机小分子荧光试剂在近红外荧光中的应用最多。

然而,理想的有机小分子荧光试剂仍然较少。二氟化硼-二吡咯甲烷(Boron dipyrromethene, BODIPY)荧光团的摩尔吸光系数大、荧光量子产率高,荧光不受溶剂、pH值及光照影响。

因此,本论文通过在其3-、5-位引入苯乙烯基扩大共轭体系的方式,设计合成了新型的近红外荧光试剂1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(2’-马来酰亚胺基)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-o-M)和1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基

-8-苯基-(4’-碘乙酰胺基)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-I)。结合荧光光度计、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、荧光显微镜等分析手段,利用新合成的近红外荧光试剂,建立了多种测定血液、细胞、组织等动植物样品中巯基化合物及含量变化的新方法,包括可视化同时监测RSH和NO的荧光成像法。

具体研究工作包括以下几个方面：(1)用苯乙烯基扩大BODIPY的共轭体系,并以其为母体荧光团、以马来酰亚胺基或碘乙酰胺基为巯基化合物的识别基团,设计合成了新型的近红外荧光生成试剂DMDSPAB-o-M和近红外荧光标记试剂DMDSPAB-I,并对其进行结构表征,详细考察了试剂及其巯基衍生产物的荧光分析性能。DMDSPAB-o-M荧光量子产率仅为0.005,与巯基化合物快速反应后,荧光增强43倍(Φ=0.215)。

DMDSPAB-o-M及衍生产物的激发/发射波长均为632/645 nm；两者的荧光经激光照射120 min或在pH 2.0-11.0范围内,强度基本不变。DMDSPAB-I本身具有强荧光(Φ=0.557),其衍生产物的荧光量子产率也高达0.560。

DMDSPAB-I及衍生产物的激发/发射波长均为620/630 nm,具有与DMDSPAB-o-M及衍生产物相同的光稳定性,且pH适用范围更宽。(2)基于

"turn-on"型近红外荧光试剂DMDSPAB-o-M,建立了直接测定GSH的荧光光度法。

在pH 9.0 PBS缓冲溶液中,37℃衍生5 min。方法的线性范围为6-200 nM,检出限(S/N=3)为0.44 nM。

半胱氨酸(Cys)与GSH的摩尔比小于1/2时不干扰,可直接测定多数样品中的GSH。小鼠全血和肝脏分析的加标回收率在95.2%-102.6%之间。

该方法无需分离,灵敏度高,选择性好,简便快速。(3) DMDSPAB-o-M为"turn-on"型荧光试剂,脂溶性好,易透膜,易穿透组织,因此将其用于人脐静脉内皮细胞(ECV-304)和小鼠肝脏组织中巯基化合物的荧光成像。

在优化的条件下,DMDSPAB-o-M与细胞孵育5min即可生成明亮的红色荧光；将其注入小鼠体内30 min,肝脏组织即可观察到较强荧光。对肝损伤小鼠肝脏组织成像发现荧光明显减弱,表明其中巯基化物含量降低。

该荧光成像法生物毒性低、无背景荧光干扰,荧光强度与巯基化合物水平呈正相关,可快速灵敏地反映细胞或组织中巯基化合物的含量变化及空间分布,在与巯基化合物含量变化相关的生理、病理可视化研究及生物医学诊治中具有重要的应用价值。(4)RSH和NO是生物体内关系密切、相互作用复杂的两类生物活性分子,利用双标记法实现了细胞及组织样品中这两类分子的同时双色荧光成像。

以DMDSPAB-o-M标记RSH、1,3,5,7-四甲基-8-(3’,4’-二氨基苯基)-二氟化硼-二毗咯甲烷(DAMBO)标记NO,两试剂与小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw 264.7)、人宫颈癌细胞(HeLa)或洋葱组织共同孵育,以590、475 nm波长分别激发,同时双色荧光成像。结果表明,与RSH或NO的单标记成像相比,该方法能同时反映同一样本中RSH、 NO的实时分布及彼此之间的含量变化关系,更符合实际状况,为更准确、深入研究RSH、 NO的生理功能及相互作用提供了直观有效的新技术平台。

(5)DMDSPAB-I及其巯基衍生产物具有强荧光且受溶剂和pH的影响较小,非常适合柱前衍生、高效液相色谱分析。以GSH,、Cys、高半胱氨酸(Hcy)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)及青霉胺(PA)六种小分子巯基化合物为对象进行研究,发现最佳衍生条件为pH 11.0 Na2B4O7-NaOH缓冲溶液、

45 ℃、25min。

在C18柱上,以甲醇/四氢呋喃/水/pH2.0 H3Cit-NaOH缓冲溶液(77:6:12:5, v/v/v/v)为流动相,25 min基线分离。S/N=3时,最低检出限为0.24 nM。

将建立的方法用于小鼠血样中巯基化合物的测定,加标回收率在

94.7%-104.3%之间,相对标准偏差(RSDs)小于4.8%。与已有柱前衍生HPLC法相比,近红外荧光衍生试剂的应用使色谱基线更平滑、样品干扰峰更少、检出限更

低。

(6) DMDSPAB-I及其巯基衍生产物的激发波长为620/630 nm,与635 nm半导体激光器的激发波长相匹配。以DMDSPAB-I为衍生试剂,建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光(CE-LIF)检测GSH、 Cys、 Hcy、γ-谷氨酰半胱氨酸(y-GluCys)、CysGly和NAC六种小分子巯基化合物的分析方法。

在含有16 mMpH 7.0柠檬酸钠缓冲溶液和60%(v/v)乙腈的背景电解质中,14 min可实现分离,检出限(S/N=3)可达0.11-0.31 nM。将建立的LIF-CE新方法用于黄瓜、西红柿及拟南芥植物样品中痕量巯基化合物的测定,加标回收率为

96.5%-104.3%, RSDs小于4.4%。

作为首次应用于RSH分离检测的NIR LIF-CE,该方法具有分离快、干扰少、检出限低等优点。