2015_《中国药典》无菌检查法修订
2015版中国药典微生物检验
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
新修订的《中国药典》对药品微生物检
2015版《中国药典》即将公布，新修订的《中国药典》对药品微生物检验和检定方法发生了重大变化，本次修订是对《中国药典》多年来固有的微生物检查系统进行根本性的调整，着重解决药品微生物相关检查方法及微生物限度标准与欧美等药典的协调统一问题。
宏观变化一：全面与国际接轨以无菌检查法为例从上述无菌检查法的比较中我们不难看出，新药典参考EP7.0、USP35、JPXV 标准，修订中国药典的微生物标准；参考欧美日药典标准修订菌数标准表达方式；以需氧菌总数替代细菌数、耐胆盐的格兰阴性菌替代大肠菌群等等，并增加新的概念：如含菌量较低的供试品细菌总数测定使用最大可能数法、分散均匀并非一定要溶解等等，同时新药典引入的偏差调查概念和内容更具体等等方面说明，微生物检验技术与国际标准要求接轨已成定势。
微观变化二：实验环境的修订2015年版药典中对无菌检查环境洁净度规定：无菌检查应在B 级背景下的A 级单向流洁净区域或D级背景下的隔离器中进行。
限度检查要求在受控洁净环境下的局部不低于B级单向流空气区域进行。
环境的提升，除了对药品检测设备硬件的要求提高，还有验证和维持环境要求的提高。
洁净或无菌室应配备独立的空气机组或空气净化系统，以满足相应的检验要求，包括温度和湿度的控制，压力、照度和噪声等都应符合工作要求。
空气过滤系统应定期维护和更换, 并保存相关记录。
微生物实验室应划分成相应的洁净区域和活菌操作区域，同时应根据实验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的实验活动，将交叉污染的风险降低到最低。
活菌操作区应该配备生物安全柜，以避免危害性的生物因子对实验人员和实验环境造成的危害。
实验室环境监测要求提高，增加人员进出表面微生物的监测，以降低人员操作时带来的风险。
对微生物室使用的消毒剂和清洁剂进行验证，从而有效控制微生物，保证无菌环境达到要求。
微生物实验室需要加强人员在环境监测时的操作规范，保证环境监测数据的准确性。
而且实验人员应经过实验室生物安全方面的培训，保证自身安全，防止微生物在实验室内部污染。
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论_潘友文
中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典的差异分析与讨论潘友文（罗氏/基因泰克，美国南旧金山，94080）2016年07月29日摘要目的：分析中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的之间的差异性，为评价不同药典中无菌检查法的等效性提供参考。
方法：对无菌检查法的主要实验步骤和参数进行一对一比较，对有差异的步骤和参数进行科学论证和评价。
结果：中国药典2015版无菌检查法与美、欧、日药典无菌检查法的主要参数和步骤是一致的，但中国药典无菌检查法还需要做阳性对照和厌氧需氧菌的额外培养。
并且，中国药典用大肠埃希菌代替美、欧、日药典中的铜绿假单胞菌参与无菌检查法的适用性试验。
结论：各药典的无菌检查法是等效的。
在不影响方法等效性的前提下，中国药典2015版无菌检查法在阳性对照和培养方法上还可以进一步简化。
关键词:无菌检查法；中国药典；美国药典；欧洲药典；日本药典Gap Assessment and Discussion on Sterility Tests in Chinese Pharmacopoeia 2015, United States Pharmacopoeia, European Pharmacopoeia, and Japanese PharmacopoeiaYouwen Pan (Genentech, a Member of Roche, South San Francisco, USA 94080)Abstract Objective：Gap assessment and discussion on the sterility test methods in Chinese Pharmacopoeia 2015 edition (CP2015), United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), and Japanese Pharmacopoeia (JP). Method：The test procedures and key parameters in the sterility test methods in different pharmacopoeia were compared step by step and the differences were identified. The identified differences are scientifically evaluated for their impact to the equivalence of the methods. Result：The sterility test method in CP2015 is largely harmonized with that in USP, EP and JP except for a few differences. Positive control and extra incubation bacteria are required in CP2015 only, and Escherichia coli is used in method suitability test in CP2015 while Pseudomonas aeruginosa is used in USP/EP/JP. Conclusion：The Sterility Test Methods in CP2015, USP, EP, and JP are equivalent. The method in CP2015 could be simplified more without compromising the validity, accuracy and reliability of the method.Key words：sterility test；Chinese Pharmacopoeia 2015；United States Pharmacopoeia；European Pharmacopoeia； Japanese Pharmacopoeia无菌检查法是用于检查药典规定的无菌物品是否被微生物污染的检测方法。
2015年版《中国药典》无菌检查法解读
2015年版《中国药典》无菌检查法解读杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【摘要】目的解读2015年版《中国药典》无菌检查法的主要增修订情况.方法对比2015年版《中国药典》无菌检查法与2010年版《中国药典》无菌检查法的主要差异.结果 2015年版《中国药典》无菌检查法在检查内容、检查方法、培养体系及质量控制理念等方面都作了较大修订.结论 2015年版《中国药典》将无菌检查法完善成为更加科学并与国际接轨的检查方法.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2015(024)024【总页数】5页(P7-11)【关键词】无菌检查法;2015年版《中国药典》;无菌药品;培养体系;质量控制【作者】杨晓莉;李辉;绳金房;钱维清;胡昌勤【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;陕西省食品药品检验所,陕西西安 710065;上海市食品药品检验所,上海 201203;中国食品药品检定研究院,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R954;R921.2无菌检查法是指用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的方法［1］，是药品微生物检查体系的重要组成部分，药品微生物是关系药品安全性的关键指标之一。
无菌药品的微生物污染是影响药品生产质量和引发临床不良事件的主要因素，近年来发生的“欣弗事件及刺五加事件”等严重药害事件都是无菌药品的微生物污染导致［2］。
目前，美国、欧盟、日本等国家或组织无菌检查法已协调一致［3］。
2010年版《中国药典》及之前版本收录的无菌检查法与国际通用的标准在检查理念、培养体系、方法要求等诸多方面有显著差异。
在国家药品安全规划与标准提高的目标下，2015年版《中国药典》借鉴国外药典先进技术经验，以新的控制理念为指导，结合我国国情对无菌检查法的检测范围及环境要求、培养体系、方法适用性、检查方法、偏差调查与过程控制等方面都做了较大修订，进一步完善了无菌检查法，修订后的无菌检查法正逐步与国际通用标准一致。
关于修订《中国药典》无菌检查法表述的建议
关于修订《中国药典》无菌检查法表述的建议经过多年的发展，我国医药事业已经取得了显著的成就，极大地改善了我国人民的健康水平。
为此，我国一直在努力提高药品的质量，并不断完善相关法规制度。
《中国药典》是世界上最重要的药典之一，它反映了中国药品质量的水平和发展趋势。
然而，药品生产技术的不断发展和客观情况的变化，使得《中国药典》中有关无菌检查法的表述有必要进行完善和改进。
《中国药典》是由中国药典委员会编写的，是中国药品质量的重要参照文件。
其中的无菌检查法对于药品的质量至关重要。
如果药品不符合无菌检查法的要求，那么其质量将无法得到有效的保证。
因此，无菌检查法在《中国药典》中应当有一个完整而详细的表述，以准确反映无菌检查要求，并为药品生产和检验提供科学的依据。
首先，《中国药典》应当完善对无菌检查的定义和条件表述。
其次，应该提供更新的无菌检测标准，保证无菌检查方法的准确性。
另外，应该强调不同药品的无菌检查方法的差异性，以便适用于不同药品的不同要求。
此外，应该提出明确的职责分配，以确保药品质量的统一性。
另外，应该给出明确的无菌检查技术要求，以保证合格的无菌检查结果。
同时，也应该充分考虑无菌检查所必需的设备，特别是最新的设备，以保证检测的准确性和效率。
此外，要强调控制无菌检查环境的重要性，可以设置一定的标准，以便对检测环境进行有效的控制。
最后，应当充分考虑无菌检查过程中所产生的噪声、污染及其它干扰因素，以确保检查结果的准确性。
同时，为了使无菌检查更加有效，还可以考虑采用更先进的技术，如数据化技术、信息交换技术等。
总之，《中国药典》对无菌检查法的表述有必要进行修订。
在修订的过程中，应该充分考虑这些客观情况，为药品生产和检验提供科学的依据，以保证药品质量。
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照
2015版中国药典微生物检查方法及培养基变更参照1.无菌检查法1.1变更内容1.1.1无菌检查方面，使用胰酪胨大豆肉汤（胰酪胨大豆液体培养基/大豆酪蛋白肉汤培养基）取代改良马丁培养基与硫乙醇酸盐流体培养基配合进行细菌和真菌的全面微生物检测。
1.1.2菌液制备环节，使用胰酪胨大豆肉汤、胰酪胨大豆琼脂取代营养肉汤、营养琼脂进行金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的菌液制备。
1.1.3菌液制备环节，使用沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基取代改良马丁培养基、改良马丁琼脂进行白色念珠菌和黑曲霉菌液的制备，同时对沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂的配方进行了变更。
1.1.4适用性试验中，胰酪胨大豆肉汤使用枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉进行灵敏度检查；硫乙醇酸盐流体培养基使用金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、生孢梭菌、铜绿假单胞菌进行灵敏度检查。
1.2培养基信息2010版2015版无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——改良马丁培养基菌液制备——改良马丁琼脂培养基菌液制备——营养肉汤菌液制备——营养琼脂无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基无菌检查/菌液制备——硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查/菌液制备——胰酪胨大豆肉汤菌液制备——胰酪胨大豆琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖琼脂菌液制备——沙氏葡萄糖肉汤无菌检查——0.5%葡萄糖肉汤培养基供试品制备——0.1%蛋白胨水培养基供试品制备——pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液1.3参考文件（国家药典委员会—中国药典2015版附录征求意见稿—1101无菌检查法）http://w w /cms/new scenter/new s/000603.html2.非无菌产品微生物限度检查2.1变更内容2.1.1供试品制备环节，除了pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液、pH6.8磷酸盐缓冲液、pH7.6磷酸盐缓冲液外，添加了pH7.2磷酸盐缓冲液和胰酪胨大豆肉汤。
中国药典(2015年版)无菌检查法
中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。
薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
2015年版药典 无菌检查法
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验(直接接种法)
*********公司*********产品无菌检查方法适用性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨培养基中或胰酪大豆胨脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养24～48小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.4接种黑曲霉菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌孢子悬液。
6、无菌检查直接接种法方法适用性试验6.1供试品制备：描述供试品制备过程（主要为每个样品的取样部位及用量）。
6.2试验组：取装量为 ml硫乙醇酸盐流体培养基，接种规定的供试品量（同6.1），并接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉按照上述步骤操作，其中大肠埃希菌、生孢梭菌加入硫乙醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基。
6.3对照组：取装量为 ml硫乙醇酸盐流体培养基3管，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌；取相同装量的胰酪大豆胨培养基3管，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。
无菌检查法-2015版中国药典
无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
2015版《中国药典》无菌、洁净室测定
方法适用性试验中 的修订
——两种培养基接 入试验菌的调整
22
2010年版
2015年版
1.硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 （4种菌）→（9支） 2.改良马丁培养基 ——白色念珠菌、黑曲霉 （2种菌）→（5支）
1.硫乙醇酸盐流体培养基 ——金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、生孢梭菌 （3种菌）→（7支） 2.胰酪大豆胨液体培养基 ——枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉 （3种菌）→（7支）
6
逐版发展提高的主要部分：
实验环境、设施的无菌保证 培养基品种及适用性检查要求 检验数量、检验量的增加 检验方法和仪器发展 验证试验要求 培养时间保证受损微生物的生长 结果判断规定 取消复试、及重试的规定
发展宗旨：加强检验的过程控制、提高方法的检出率、 保证检验结果的可靠性。
局限性
微生物污染可以发生在生 产、储存、运输、货架、 使用等环节 任何时段， 产品中微生物的污染可以 是不均匀的。
8
比较项目
实验环境要求
2010
总体1000级、局部100级
USP35
应在无菌条件下进行
EP7.0
应在无菌条件下进行
人员要求
培养基、培养 条件与时间
具备微生物专业知识，并经过 无菌技术培训
1
2
无菌检查的起源 无菌检查的发展历史 无菌检查法的发展宗旨
3
与静脉输液的起源和应用有关
——1665年，欧洲勃兰登堡候国御医约翰▪西吉斯 蒙德▪埃尔斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方 法》 ——1831年，西欧霍乱肆虐，为了拯救在死亡线 上挣扎的病人，苏格兰医生赖特大胆启用静脉输 液疗法，他将大量煮沸过的食盐水静脉输注给霍 乱病人使大部分病人得救。 ——赖特在实践中观察到了输液产生的“注射热” ——随着显微镜的发明和微生物的发现，人们开始 了输液无菌检查的研究。
《中国药典》2015年版微生物测定修订情况
常州药检
一、微生物计数法
分别接种不大于100cfu的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌、枯草芽孢杆菌菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平 板，每一试验菌株平行制备2个平皿，30～35℃培养 不超过3天。同时，用相应的对照培养基代替被检培 养基进行上述试验。 分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉菌液至 胰酪大豆胨琼脂培养基平板，每一试验菌株平行制备 2个平皿，30～35℃培养不超过5天。同时，用相应 的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。
常州药检
一、微生物计数法 计数培养基适用性检查
菌种：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，不得超过5代。
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
常州药检
一、微生物计数法
取其新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉制 备时在缓冲液或氯化钠溶液中加入0.05%（v/v）聚山 梨酯80。 菌液在室温下2小时内使用，2～8℃时可在24h内使用， 黑曲霉孢子悬液可2～8℃保存，在验证过的贮存期内 使用。
MPN法
常州药检
一、微生物计数法
平皿法：包括倾注法和涂布法。每株菌每种培养基 至少制备2个平皿，以算术平均值计算。使用涂布 法应采用适宜的方法使培养基表面干燥，且每个 平皿接种的供试液不少于0.1ml。
常州药检
一、微生物计数法
薄膜过滤法：一般取相当于1g（ml、10cm2）的供试 品，（若供试品中所含的菌数较多时，供试液可 酌情减量）加至适量稀释液中，混匀，过滤。用 适量冲洗液冲洗。 每株菌每种培养基至少制备一张滤膜。 同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
常州药检
讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况
讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况第一篇：讲义五：2015年版版中国药典四部增修订情况2015 年版《中国药典》四部增修订概况2015年版《中国药典》已于2015年6月5日由国家食品药品监督管理总局正式颁布。
2015年版《中国药典》最大的变动之一是将原药典各部附录整合，并与药用辅料标准单立成卷，首次作为《中国药典》第四部，解决了长期以来药典各部共性检测方法重复收录、彼此之间方法不协调、不统一、不规范，给药品检验实际操作带来不便的问题。
2015年版《中国药典》四部内容包括凡例、通则和药用辅料，药典通则涵盖了通用性要求、检验方法、指导原则以及试剂和标准物质等药品标准的共性要求，是药典标准的基础，不但反映了我国药品质量控制整体状况和药品检验技术水平;同时也对规范药品研究、生产、检验、加强药品监管发挥重要作用。
现就2015年版《中国药典》四部整体情况简要介绍如下。
1.2015 年版《中国药典》四部增修订整体情况2015 年版《中国药典》四部收载通则总数317个;将药典一部、二部、三部制剂整合后共计38个;检测方法附录287个，其中新增通则28个(检定方法通则27个、制剂通则1个)，整合通则63个，修订通则67 个;新增生物制品总论3个;指导原则共计30个，其中新增15个，修订10个。
辅料收载总数约270个品种，其中新增137 个，修订97个，不收载2个。
2.2015 年版《中国药典》四部主要特点2.1 整体提升质控水平《中国药典》凡例、通则、总论是药典的重要组成部分，对药品标准的检测方法和限度进行总体规定，对药典以外的其他药品国家标准具同等效力。
通过对2010年版《中国药典》相关内容的全面增修订，全面完善了药典标准基本共性规定(表2)，从整体上提升对药品质量控制的要求，形成了以凡例为统领，通则为同类药品基本准则、各论作为基本要求的药典标准体例。
药品标准控制更加全面化、系统化、规范化。
2.2 药典标准体系更加完善 2015年版《中国药典》四部首次纳入“国家药品标准物质通则”以及“国家药品标准物质制备指导原则”、“药包材通用要求”和“药用玻璃材料和容器”等指导原则，进一步完善了药用辅料和药包材通用性要求，从影响药品质量的等各方面，包括原料药及其制剂、药品标准物质、药用辅料和药包材的制定控制要求，形成了全面、完善的药典标准体系。
2015版药典
一、《中国药典》2015年版附录（总论）制修订概况
主要增修内容
安全性 在凡例和附录中加强安全性检查总体要求 制剂通则：同一剂型，统一安全性检查要求
附录中增修订相关的安全性项目检查法。如：二氧化硫残留量检查法、黄曲霉素一
法、微生物限度、无菌、热原、细菌内毒素检查法等 提高中药注射剂品种的安全性控制技术要求
颗粒剂
修订：
中药颗粒剂水分：2010版的限度为6%，调整为8%。
三、《中国药典》2015年版制剂通则检查方法增修订概况
（一）重（装）量差异检查
凡单剂量包装的制剂均规定检查重量差异或装量差异——控制剂量准确
共有17个剂型规定。如片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服溶液剂
凡多剂量包装的制剂均规定检查装量——控制装量准确。23个剂型规定检查装量 ：如注射剂、颗粒剂、散剂、合剂、口服溶液剂 1、平均装量和装量的有效位数变化 2010版一部，有效位数为1位，二部为2位。2015版进行了统一，有效位数增至2 位。
2010版二部，分别精密称定每袋（瓶）内容物的重量
2015版将一部与二部统一，“称定”改为“精密称定”。
三、《中国药典》2015年版制剂通则检查方法增修订概况
5、与平均重量比较落后还是以标示重量比较
2010版一部，每片重量与标示片重相比较（无标示片重的片剂，与平均片 重比较） 2010版二部，每片重量与平均片重相比较（无含量测定的片剂，与平均片 重比较）
本形成
国家药品标准约计1.7万个 《中国药典》是我国政府为保证药品质量、保 障人民群众用药安全、有效、质量可控而制定 的技术法典，是药品研究、生产、经营、使用 和监管的法定依据 作为我国药品标准体系的核心，药典的修订，
无菌检查法 版药典
除 葡 萄 糖 外 ，取 上 述 成 分 ，混 合 ，微 温 溶 解 ，滤 过 ， 调 节 p H 使 灭 菌 后 在 2 5 C 的 p H 值 为 7.3±0.2，加人葡萄
糖 ，分 装 ，灭 菌 。 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 置 20〜25eC 培 养 。 3. 中和或灭活用培养基
培养基
硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 主 要 用 于 厌 氧 菌 的 培 养 ，也可用
于 需 氧 菌 培 养 ；胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 用 于 真 菌 和 需 氧 菌 的
培养。
培养基的制备及培养条件
培 养 基 可 按 以 下 处 方 制 备 ，亦可使用按该处方生产的
符 合 规 定 的 脱 水 培 养 基 或 成 品 培 养 基 。配制后应采用验证 合 格 的 灭 菌 程 序 灭 菌 。制 备 好 的 培 养 基 应 保 存 在 2 〜
蛋 白 质 ）。
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
供 试 品 羟 胺 残 留 量 — 供 试 品 的 残 留 羟 胺 浓 度 （nmol/ml) (nmol/mg蛋 白 质 ） 供 试 品 的 蛋 白 质 含 量 （mg/ml)
微生物检查法
1 1 0 1 无菌检查法
无 菌检 查法 系 用 于 检 查 药典 要 求 无 菌的 药 品 、生物制 品 、医 疗 器 具 、原 料 、辅 料及其他品种是否无菌的一种 方 法 。若 供 试 品 符 合 无 菌 检查 法的 规 定 ，仅表明了供试品在 该检验条件下未发现微生物污染。
结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若加菌的培养基 管 均 生 长 良 好 ，判该 培 养 基 的灵 敏度 检査 符合规定 。
中国药典无菌及微生物限度检查法发展与修订
整合调查
❖ 据反映，历史上个别地区在生物制品无菌检查中曾经发 现个别品种在20~25℃ 培养的硫乙醇酸盐流体培养基中 有菌生长的情况（但未作鉴定和溯源明确是什么菌）。
❖ 从微生物适宜培养条件分析
▪ 嗜热型需氧菌适宜生长温度为45源自58℃； ▪ 嗜温型需氧菌适宜生长温度为20~44℃； ▪ 嗜冷型需氧菌适宜生长温度为10~18℃；
非无菌药品微生物限度检查： 微生物计数法
非无菌药品微生物限度检查： 控制菌检查法
非无菌药品微生物限度标准
30
微生物限度检查法实验环境的变化
2010年版
2015年版
应在洁净度10000级背景下 应在受控洁净环境下（不
的局部100级单向流空气区 低于D级）的局部不低于B
域内进行。
级单向流空气区域内进行。
21
根据培养基的调整所做的相关调整
培养基修订
培养基灵敏 度检查及方 法适用性试 验中的修订
菌液制备用培 养基的修订
由TSB替代MM
两种培养基 接入试验菌的调整
各菌接种的 培养基调整
硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（大肠埃希菌）、生孢梭菌 胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
实用化问题； ❖ 增加新的指导原则，特别是对与企业过程控制相
关的指导原则。
10
2015版药典无菌及微生物限度检查法目标
❖ 建立统一的质量技术要求，保持各方药典科技 水平一致，保证用药安全、有效。
▪ 质量控制、检验技术、检验标准等
❖ 减少国际贸易的障碍。 ❖ 统一医药产品进入国际市场的技术门槛，促进
★2006年7～8月发生了震惊 全国的“欣弗事件”
●直接死亡11人 ●企业倒闭 ●至今余震不断
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一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数
量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性 对照用。
2015版
检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外， ①出厂产品按表1规定；②上市产品监督检验按表2规定 表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
至胰酪大豆胨液体培养基 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基
3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基
4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基
方法适用性试验的修订
2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。 2015版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、生孢梭菌各2管 胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉。
4、检查方法的整合修订。 5、参照USP 对表2、表3的整合修订。
实验环境的重大修订
悬浮粒子最大允许数/立方米
微生物监测的动态标准(1) 表面微生物 动态 沉降 浮游 菌 接触碟 5指手 菌 （f9 / 套 cfu/ 0mm） （f55 cfu /手 m3 cfu mm） 套 /4h(2) cfu /
检验量的整合 2010版
检验量： 检验量
2015版
是指一次试验所用的供试品总量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养 （g或ml）。除另有规定外，每份培 基的最小量（g或ml）。
养基接种的供试品量按表2、表3规定 除另有规定外供试品检验按表3规定。若每 。若每支（瓶）供试品的装量按规定 支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 足够接种两份培养基，则应分别接种 种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培 培养基和胰酪大豆胨液体培养基。
和严格的GMP管理。
1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性
主要内容
我国药典无菌检查法的历史发展
我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容 2015版《中国药典》无菌检查法 医院制剂进行微生物控制的必要性
修订原则：
以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲的要求
进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点，
在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾，作原 则性要求而不作具体细则规定。致力于逐步修订完善。
检验数量的整合
2010版
检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出
我国药典无菌检查法与欧美药典的差异
比较项目
检验条件规定 人员要求
ChP2010
总体10000级、局部100级 具备微生物专业知识，并经过无 菌技术的培训
USP35
应在无菌条件下进行。 经培训和认可
EP7.0
应在无菌条件下进行。 经培训和认可
培养基、培养条 件与时间
硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃；20～25℃(三部） 30～35℃ 改良马丁培养基 23～28℃ 胰酪大豆胨液体培养基
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法 1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液 性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除 1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml 吐温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸 膏＋吐温80 采用薄膜过滤，利于抗菌影 响去除 1．0.1％蛋白胨水溶液 2．0.1％蛋白胨水溶液＋0.1 ％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐 温-80） 3．十四烷酸异丙酯。
应将所有容器内的全部内容物过滤。
2015版 检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。
除另有规定外供试品检验按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接
种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
洁 净 度 级 别
静态
动态 ≥5.0 μm 20 29 2900 29000 ≥0.5 μm 3520 352000 3520000 不作规定 ≥5.0 μm 20 2900 29000 不作规定
≥0.5 μm 3520 3520 352000 3520000
A级 B级
<1
10
<1
5
<1
5
<1
5
C级
2005年版 2010年版
我国药典无菌检查法的历史发展
2005年版主要变化 10000下局部100级，隔离系统， GB-洁净度验证 培养基适用性检查 方法验证试验 优先用封闭式薄膜过滤器 增加稀释液冲洗液品种 直接接种法 “一对一” 延长培养时间为14天 对表1 强调了“每种培养基最少检验数量” 取消复试 2010年版主要变化 对无菌检查人员提出专业要求和培训 增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液 方法验证试验菌：金、大、枯、生、白、黑 冲洗量：少量（约100ml）多次，总量不超过1000ml 强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性
我国药典无菌检查法的历史发展
修订时间 1953年版 1963年版 1977年版 1985年版 1990年版 1995年版 修订内容 直接接种法 直接接种法 无阳性对照菌取样量2支/瓶 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照－金葡 直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。 阳性对照－金葡 同1985年版 培养基灵敏度检查－藤黄、 生孢、白念。阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念 10－5
D级
100
200
50
100
25
50
－
－
无菌检查环境修订
2010年版
无菌检查 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内 或隔离系统进行 2015年版
无菌检查
在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。
培养基增修订内容 2010年版
1.硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃ 2.改良马丁培养基 23 ～ 28 ℃培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 营养肉汤培养基 6. 营养琼脂培养基 7. 改良马丁琼脂培养基 2015年版 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃培养 2. 胰酪大豆胨肉汤培养基 20 ～ 25℃培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 胰酪大豆胨琼脂培养基 6. 沙氏葡萄糖肉汤培养基 7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
养基。采用薄膜过滤法时，检验量应 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许 不少于直接接种法供试品的总接种量 ，应将所有容器内的全部内容物过滤。
，只要供试品特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤。
检验量的整合 2010版
检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基 接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过 滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，
结果判断与复试 规定
一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生 长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)
2015版药典无菌检查法的增、修订内容 1、方法应用范围增加“生物制品”。 2、实验环境的修订。
3、培养基体系的修订。
1998年
2000年版
阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念10－5
实验环境为100级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量6～11支/瓶；50 毫升 以上大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。阳性对照：金 葡、生孢、白念均10 ～100个菌抑细菌和抑真菌试验 增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优 先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为14天、取消复试。 在2005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性
均培养14天，
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于7天
转种后细菌培养2天、真菌培 养3 天
培养基灵敏度检 查与方法验证用 菌株 检验方法 稀释剂与薄膜过 滤冲洗液
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌 、黑曲霉
中国药典2015年版无菌检查法的增修订内容
1、无菌
是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原
2、无菌检查法
料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验
的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。 4、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其
干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及
无菌操作。
5、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品
在该检验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品