2015_《中国药典》无菌检查法修订

ICH Q6B， USP、EP、BP、JP无菌检查法中生物技术产品/及生物制品检 定规程、标准没有对生物制品作出特殊的规定。


整合中的焦点：
培养温度 三部无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别 置30～35℃、 20～25℃两个温度下培养。以致在取样量、检验量、接种 方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。
证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证
体系和严格的GMP管理。

1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性
主要内容
我国药典无菌检查法的历史发展
我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容 2015版《中国药典》无菌检查法 医院制剂进行微生物控制的必要性
参照USP 对表1、表2、表3整合修订内容
2010版 表1. 批出厂产品最少检验数量 。 表2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量。
表3. 固体制剂最少检验及上市抽验样品的最少检验数量。
2015版 表1.批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量。 注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
适用范围
硫乙醇酸盐流体培养基 厌氧菌检查（首选） 需气菌检查。
胰酪大豆胨液体培养基
真菌和需气菌的检查。
培养基灵敏度检查实验菌株的修订
2010年版
硫乙醇酸盐流体培养基
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基 白色念珠菌、黑曲霉
2015年版
硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、 胰酪大豆胨液体培养基 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉
洁 净 度 级 别
静态
动态 ≥5.0 μm 20 29 2900 29000 ≥0.5 μm 3520 352000 3520000 不作规定 ≥5.0 μm 20 2900 29000 不作规定
≥0.5 μm 3520 3520 352000 3520000
A级 B级
<1
10
<1
5
<1
5
<1
5
C级
厂产品按表1规定；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3中最少 检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/2的最小检验数
量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性 对照用。
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2015版
检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外， ①出厂产品按表1规定；②上市产品监督检验按表2规定 表1、表2中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。
D级
100
200
50
100
25
50
－
－
无菌检查环境修订
2010年版
无菌检查 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内 或隔离系统进行 2015年版
无菌检查
在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。
培养基增修订内容 2010年版
1.硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃ 2.改良马丁培养基 23 ～ 28 ℃培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 营养肉汤培养基 6. 营养琼脂培养基 7. 改良马丁琼脂培养基 2015年版 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃培养 2. 胰酪大豆胨肉汤培养基 20 ～ 25℃培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 胰酪大豆胨琼脂培养基 6. 沙氏葡萄糖肉汤培养基 7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基
4、检查方法的整合修订。 5、参照USP 对表2、表3的整合修订。
实验环境的重大修订
悬浮粒子最大允许数/立方米
微生物监测的动态标准(1) 表面微生物 动态 沉降 浮游 菌 接触碟 5指手 菌 （f9 / 套 cfu/ 0mm） （f55 cfu /手 m3 cfu mm） 套 /4h(2) cfu /
表2. 上市抽验样品的最少检验数量 （包括液体和固体制剂）。 注 ①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。
②抗生素粉针剂（≥5g) 及抗生素原料药的最少检验数量为6瓶（或支）。
筒装固体原料的最少检验数量为4个包装。根据具体情况定
表3. 供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）。
养基。采用薄膜过滤法时，检验量应 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许 不少于直接接种法供试品的总接种量 ，应将所有容器内的全部内容物过滤。
，只要供试品特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤。
检验量的整合 2010版
检验量是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基 接种的供试品量按表2、表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过 滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，
我国药典无菌检查法与欧美药典的差异
比较项目
检验条件规定 人员要求
ChP2010
总体10000级、局部100级 具备微生物专业知识，并经过无 菌技术的培训
USP35
应在无菌条件下进行。 经培训和认可
EP7.0
应在无菌条件下进行。 经培训和认可
培养基、培养条 件与时间
硫乙醇酸盐流体培养基 硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃；20～25℃(三部） 30～35℃ 改良马丁培养基 23～28℃ 胰酪大豆胨液体培养基
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法 1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液 性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除 1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml 吐温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸 膏＋吐温80 采用薄膜过滤，利于抗菌影 响去除 1．0.1％蛋白胨水溶液 2．0.1％蛋白胨水溶液＋0.1 ％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐 温-80） 3．十四烷酸异丙酯。
中国药典2015年版无菌检查法的增修订内容
1、无菌
是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原
2、无菌检查法
料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验
的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。 4、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其
修订原则：
以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲的要求
进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点，
在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾，作原 则性要求而不作具体细则规定。致力于逐步修订完善。
检验数量的整合
2010版
检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外，出
干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及
无菌操作。
5、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品
在该检验条件下未发现微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批产品
的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。
灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作 为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保
至胰酪大豆胨液体培养基 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基
3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基
4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基
方法适用性试验的修订
2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。 2015版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、生孢梭菌各2管 胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉。
2005年版 2010年版
我国药典无菌检查法的历史发展
2005年版主要变化 10000下局部100级，隔离系统， GB-洁净度验证 培养基适用性检查 方法验证试验 优先用封闭式薄膜过滤器 增加稀释液冲洗液品种 直接接种法 “一对一” 延长培养时间为14天 对表1 强调了“每种培养基最少检验数量” 取消复试 2010年版主要变化 对无菌检查人员提出专业要求和培训 增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液 方法验证试验菌：金、大、枯、生、白、黑 冲洗量：少量（约100ml）多次，总量不超过1000ml 强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性
我国药典无菌检查法的历史发展
修订时间 1953年版 1963年版 1977年版 1985年版 1990年版 1995年版 修订内容 直接接种法 直接接种法 无阳性对照菌取样量2支/瓶 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。阳性对照－金葡 直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。 阳性对照－金葡 同1985年版 培养基灵敏度检查－藤黄、 生孢、白念。阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念 10－5
菌液制备用培养基
2010年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物
至营养肉汤培养基培养基 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基 3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上 2015年版
1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物
1998年
2000年版
阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念10－5
实验环境为100级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量6～11支/瓶；50 毫升 以上大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。阳性对照：金 葡、生孢、白念均10 ～100个菌抑细菌和抑真菌试验 增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优 先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为14天、取消复试。 在2005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性
均培养14天，
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于7天
转种后细菌培养2天、真菌培 养3 天
培养基灵敏度检 查与方法验证用 菌株 检验方法 稀释剂与薄膜过 滤冲洗液
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌 、黑曲霉
结果判断与复试 规定
一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生 长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)
2015版药典无菌检查法的增、修订内容 1、方法应用范围增加“生物制品”。 2、实验环境的修订。
3、培养基体系的修订。
检验量的整合 2010版
检验量： 检验量
2015版
是指一次试验所用的供试品总量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养 （g或ml）。除另有规定外，每份培 基的最小量（g或ml）。
养基接种的供试品量按表2、表3规定 除另有规定外供试品检验按表3规定。若每 。若每支（瓶）供试品的装量按规定 支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 足够接种两份培养基，则应分别接种 种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体 硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培 培养基和胰酪大豆胨液体培养基。
应将所有容器内的全部内容物过滤。
2015版 检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g或ml）。
除另有规定外供试品检验按表3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接
种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
注 如果医疗器械体积过大，培养基用量可在2000 ml以上，将其完全浸没。
阳性对照试验 按原二部的规定： ⒈供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。 ⒉阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小 于100CFU。 ⒊阳性对照管培养48～72小时应生长良好。