如何区分凋亡细胞与坏死细胞

精品文档与其它的生命现象一样具有同等重要(Apoptosis) 是生物界广泛存在的一种现象,细胞凋亡但其诱导因素、发生机制和过的生理学或病理学意义。尽管其最终结果也是导致细胞死亡, ) 。(程及意义均明显不同于一般的病理性细胞死亡即细胞坏死性死亡,简称细胞死亡细胞坏死性死

亡是被动的病理性死细胞凋亡的形态特征与细胞坏死性死亡的形态特征不同。核染色质不规则,,,其形态特征首先是膜通透性增加,细胞外型发生不规则变化内质网扩张亡过程常常引起炎症,这

种死亡,细胞膜破裂,胞浆外溢移位,进而线粒体及核肿张,溶酶体破坏是主动的生理由细胞内在的

有规律的机制引起的,反应。细胞凋亡则是在某些因素的诱导下,内质网扩胞浆浓缩,随即与邻近细胞脱离,失去微绒毛,性细胞自杀。其特征是细胞首先变圆,胞膜内核染色质浓缩成块并凝聚在核膜周边,张呈泡状并与细胞膜融合,线粒体无明显变化,后被吞噬细胞或邻周细胞陷将细胞自行分割

为多个有外膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体,故不没有细胞内容物外泄,所识别、吞噬。由于细胞凋亡过程不导致溶酶体破坏及胞膜破裂,,生物体内细胞存活与死亡是由自身发育阶段提供的

遗传信息,引起炎症反应,在生理条件下其中包括细胞相互接触提供的信号以及周围环,或由邻近

细胞和其微环境提供的信号决定的境中活性物质、激素等。维系着机体细胞的有序状态这些刺激信号的增加或减少调节着细胞产生和凋亡,

根据死亡细胞在形态学、细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，细胞凋亡的检测

下面细胞凋亡的检测方法有很多，生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。人根据凋亡细胞固有的形态特征，细胞凋亡的形态学检测介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡形态学检测方法。的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般

( apoptosis)细胞凋亡的形态学特征。但形态改变仍是确目前对细胞凋亡的认识不断得到深化，

检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，定细胞凋亡的最可靠的方法。光学显微镜观察染色的组织凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在HE胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体。在组织中凋亡细胞以.切片中细胞积缩小分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。染色，在高倍物镜下观察凋亡细Giemsa检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或胞的形态改变，结合显微镜测量工具可作凋亡计数。常

缺乏较为特但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，本方法简便易行，可用于凋亡现象的初步观察，作为分析征的指标，具有较强的主观性，重复性差。本方法. 指标之一。video time-lapse microscopy）视频时差显微技术（尤其是观察细胞表通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，本方法用于细胞培养，和外形的变化。凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，持续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可检测培养基中凋亡细胞，但不能用于病理组织。培养，置于多空培养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像细胞/ml检测方法：收集2x105如同小时。24秒作序列摄影，每隔装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，30连续时进行荧光染色，可参荧光显微镜下观察和摄影。. 精品文档电子显微镜观察核的碎裂和染色质浓缩成半月板或帽状附于核膜，凋亡细胞的典型形

态改变如胞质的固缩，本方在透射电镜下得到最佳体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。凋亡小体形成等，由于样品法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展。范围局限，在凋亡数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变。检查方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，乙醇逐级透射电镜观察。扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，醋酸枸橼酸电子重染色，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。脱水，CO2

一、检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法

磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探.

精品文档(propidine iodide, PI) 碘化丙啶针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。能够透是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞与PI过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 以及死细胞区分开来。PBS悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用方法 1

，室10ul（20ug/ml）次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V洗2，Binding Buffer400ul 避光反应5min后，加入50ug/ml温避光30min，再加入PI（）5ul，AnnexinV-FITC，同时以不加进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h）立即用FACScan PI的一管作为阴性对照。及的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%

爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 3

联断裂发生，因此Annexin VDNA应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于染色不需PI又Annexin V联合法更为灵敏。合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNELDNATUNEL法因固定出现的PI固定细胞，可避免染色因固定造成的细胞碎片过多及法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的联合VPIAnnexin 片段丢失。因此，检测细胞凋亡的方法。结果：.

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细胞内氧化还原状态改变的检测：C细胞色素的定位检测

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精品文档它存在于线粒体内膜正常情况下，细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。protease （apoptotic 和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1

，后者再激复合物激活caspase-9）后启动activating factor-1caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1Ⅳ：（cytochrome c oxidase subunit 氧化酶亚单位Ⅳ活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部COX4 分的一个非常有用的标志。不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度方法：ApoAlertTMCell Fractionation Kit和C抗体和COX4抗体标示细胞色素CWestern 富集的线粒体部分，再进一步通过杂交用细胞色素COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。三、线粒体膜势能的检测