食品中苯甲酸山梨酸和糖精钠的测定-标准文本(食品安全国家标准)

食品安全国家标准
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定
1 范围
本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。

本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。

第一法液相色谱法
2原理
样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。

3试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 试剂
3.1.1氨水（NH3•H2O）。

3.1.2氢氧化钠（NaOH）。

3.1.3硫酸（H2SO4）。

3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。

3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。

3.1.6氯化钠（NaCl）。

3.1.7酒石酸（C4H6O6）。

3.1.8硅酮树脂。

3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。

3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。

3.1.11中性氧化铝。

3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。

3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。

3.2 试剂配制
3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。

3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。

3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。

3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。

3.2.6 酒石酸溶液（15%）：称取15 g酒石酸，用水定容100 mL。

3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：分别称取16.72 g磷酸二氢钠和2.72 g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。

3.2.8中性氧化铝：层析用，100目~200目。

105℃干燥2 h，于干燥器中冷却至室温，每100 g中加入2 mL水降活，混匀后密封，放置12 h后使用；或按照使用量的不同，选择合适的活化温度及时间。

3.2.9乙酸铵溶液（1.54 g/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。

3.3 标准品
3.3.1 苯甲酸钠（C6H5COONa）：CAS：532-32-1，纯度≥99%。

3.3.2 山梨酸钾（C6H7KO2）：CAS：590-00-1，纯度≥99%。

3.3.3 糖精钠（C6H4CONNaSO2）：CAS：128-44-9，纯度≥99%。

3.4 标准溶液配制
3.4.1苯甲酸钠标准储备液：准确称取0.2360 g苯甲酸钠，加水溶解并定容至200 mL。

此溶液每毫升相当于含苯甲酸1.00 mg。

3.4.2山梨酸钾标准储备液：准确称取0.2680 g山梨酸钾，加水溶解并定容至200 mL。

此溶液每毫升相当于含山梨酸1.00 mg。

3.4.3糖精钠标准储备液：准确称取0.2340 g糖精钠（120℃烘4 h），加水溶解并定容至200 mL。

此溶液中糖精钠的含量为1.00 mg/mL。

3.4.4 混合标准系列使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量分别为0.000 mg/mL、0.020 mg/mL、0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.160 mg/mL、0.320 mg/mL的混合标准系列使用液。

4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

4.2天平：感量为0.001 g和0.0001 g。

5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 液体样品
5.1.1.1汽水等含气类样品：称取5 g~10 g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.1.2预调酒等含醇类样品：称取10 g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.1.3 高蛋白类样品：贮藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达室温，称量20 g （精确至0.001g）样品于100 mL容量瓶中。

向容量瓶中加入25mL氢氧化钠溶液，混合后置于超声波水浴或70℃水浴中处理15 min。

冷却后，用硫酸溶液将pH调节到8（用pH计或pH试纸均可），然后加入2 mL亚铁氰化钾溶液和2 mL乙酸锌溶液。

剧烈振摇，静置15 min，混合后冷却到室温，再用水定容，静置15 min，上清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.1.4食醋样品：称取50.0 mL，加入40 g氯化钠，5 mL 15%酒石酸溶液，1滴硅酮树脂（作为消泡剂），加水至约200 mL，混匀后，进行蒸馏（蒸馏速度约为2.5 mL/min），收集约90 mL馏出液，用水定容至100 mL。

清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.1.5 其他液体样品：称取5 g~10 g （精确至0.001g ）样品，用氨水（1+1）调节pH 至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.2 半固体、固体样品
5.1.2.1 高油脂类样品：称取2 g~3 g （精确至0.001g ）样品于50mL 具塞离心管中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.2），用旋涡混合器充分混合，然后于4,000 r/min 离心5 min ，小心吸出水层转移到25 mL 容量瓶中，再加入10 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）于具塞离心管中，重复上述步骤，合并两次水层液，用磷酸盐缓冲液（pH 7.2）定容至刻度，混匀，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.2.2 高蛋白类样品：称取粉碎均匀的2 g~3 g （精确至0.001g ）样品于小烧杯中，用20 mL 水分数次清洗小烧杯，将样品移入25 mL 容量瓶中，超声振荡提取5 min ，取出后加2 mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2 mL 乙酸锌溶液，摇匀，用水定容至刻度。

移入离心管中，4,000 r/min 离心5 min 。

取上清液，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.1.2.3 固态乳制品：称取3 g （精确至0.001g ）样品于100 mL 容量瓶中，加10 mL 水，用玻璃棒搅拌至完全溶解。

再按“5.1.1.3高蛋白类样品”处理。

5.1.2.4 其他固体样品：称取2 g~3 g （精确至0.001g ）样品，加水适量，转移至25 mL 容量瓶中，再加水至约20 mL ，置60℃~70℃水浴中加热片刻，加塞，剧烈振摇使其分散均匀后，加氨水（1+1）调节pH 至近中性，加塞，剧烈振摇，使样品在水中分散均匀，置60℃~70℃水浴锅中加热30 min ，取出后趁热超声5 min ，冷却后用水定容至刻度，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

5.2 色谱参考条件
5.2.1 色谱柱：C 18柱，柱长250 mm ，内径4.6 mm ，粒径5 µm 或同等性能的色谱柱。

5.2.2 检测器：紫外检测器。

5.2.3 流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95或相当性能的流动相。

5.2.4 流速：1 mL/min 。

5.2.5 检测波长：230 nm 。

5.2.6 进样量：10 µL 。

5.3 标准曲线的制作
将混合标准系列使用液分别注入液相色谱仪中，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.4 试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠的浓度，平行测定次数不少于两次。

6 结果计算
试样中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量A 1按公式（1）计算： 1000
1000
1111⨯⨯⨯=m V c A (1)
式中：
A 1 ——样品中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg ）；
c 1 ——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL ）； V 1——样品定容体积，单位为毫升（mL ）； m 1——样品质量，单位为克（g ）。

试验结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。

8 其他
取样量为2.5 g时，样品检出限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为2 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg；样品定量限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为6 mg/kg、6 mg/kg、9 mg/kg。

第二法气相色谱法
8 原理
试样酸化后，用乙醚提取出苯甲酸、山梨酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较，外标法定量。

9 试剂和材料
注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

9.1 试剂
9.1.1乙醚（C2H5OC2H5）：不含过氧化物。

9.1.2石油醚：沸程30℃~60℃。

9.1.3盐酸（HCl）。

9.1.4氯化钠（NaCl）。

9.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）。

9.2 试剂配制
9.2.1 盐酸溶液（1+1）：取100 mL盐酸，边搅拌边慢慢加入至50 mL水中，冷却至室温后，加水稀释至200mL。

9.2.2氯化钠酸性溶液（40 g/L）：于氯化钠溶液（40 g/L）中加少量盐酸（1+1）酸化。

9.2.3石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂：取150 mL石油醚和50 mL乙醚，混合。

9.3 标准品
9.3.1 苯甲酸（C6H5COOH）：CAS：65-85-0，纯度≥99%。

9.3.2 山梨酸（C6H8O2）：CAS：110-44-1，纯度≥99%。

9.4 标准溶液配制
9.4.1 苯甲酸、山梨酸标准储备液
准确称取苯甲酸、山梨酸各0.2 g（精确至0.0001g），置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并稀释至刻度。

此溶液每毫升相当于2.0 mg苯甲酸或山梨酸。

9.4.2 苯甲酸、山梨酸标准系列工作液
吸取适量的苯甲酸、山梨酸标准储备液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂稀释至每毫升相当于50 µg、100 µg、150 µg、200 µg、250 µg苯甲酸或山梨酸。

10 仪器和设备
10.1 气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器（FID ）。

10.2 天平：感量为0.001 g 和0.0001 g 。

11 分析步骤 11.1 试样制备
称取2.5 g （精确至0.001g ）事先混合均匀的试样，置于25 mL 具塞量筒中，加0.5 mL 盐酸（1+1）酸化，用15 mL 和10 mL 乙醚提取两次，每次振摇1 min ，将上层乙醚提取液吸入另一个25 mL 具塞量筒中，合并乙醚提取液。

用3mL 氯化钠酸性溶液（40 g/L ）洗涤两次，静止15min ，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25 mL 容量瓶中。

加乙醚至刻度，混匀。

准确吸取5mL 乙醚提取液于5 mL 具塞刻度试管中，置于40℃水浴上挥干，加入2 mL 石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解残渣，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。

11.2 色谱参考条件一
11.2.1 色谱柱：玻璃柱，内径3 mm ，长2 m ，内装涂以5% DEGS+1%磷酸固定液的60目~80目Chromosorb WAW 。

11.2.2 气流速度：载气为氮气，50 mL/min （氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）。

11.2.3 温度：进样口230℃；检测器230℃；柱温：170℃。

11.2.4 进样量：2 µL 。

11.3 色谱参考条件二
11.3.1 色谱柱：毛细管柱HP-WAX ，内径320 µm ，长30 m ，膜厚度0.50 µm ，或其它等效毛细管柱。

11.3.2 气流速度：载气为氮气，流速为30 mL/min （氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件），不分流模式。

11.3.3 温度：进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温升温程序：初始温度：80℃，保留2 min ，以10℃/min 的速率升温至230℃，保留5 min 。

11.3.4 检测器：FID 。

11.3.5 进样量：1 µL 。

11.4 标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

11.5 试样溶液的测定
将试样溶液注入气相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸的浓度，平行测定次数不少于两次。

12 结果计算
试样中苯甲酸、山梨酸含量A 2按公式（2）计算： 1000
51000
252222⨯⨯⨯⨯⨯=
m V c A (2)
式中：
A 2——试样中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg ）；
c2——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；
V2——加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂的体积，单位为毫升（mL）；
m2——试样的质量，单位为克（g）；
5——测定时吸取乙醚提取液的体积，单位为毫升（mL）；
25——试样乙醚提取液的总体积，单位为毫升（mL）。

试验结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

由测得的苯甲酸的量乘以1.18，即为试样中苯甲酸钠的含量；由测得的山梨酸的量乘以1.34，即为试样中山梨酸钾的含量。

13 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。

14 其他
苯甲酸和山梨酸标准溶液的检出限均为0.2 mg/kg；定量限均为0.65 mg/kg。

酱油试样取样量为2.5 g时，苯甲酸和山梨酸的检出限均为1 mg/kg；定量限均为5 mg/kg。

附录A
苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱图
图A.1给出了苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠标准溶液的高效液相色谱图。

图A.1 苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱图
图A.2给出了苯甲酸和山梨酸标准溶液的气相色谱图。

图A.2 苯甲酸、山梨酸的气相色谱图（毛细管柱）
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0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00
uV (x10,000)
苯甲酸钠
山梨酸钾
糖精钠。