第十章 现代生物技术在发酵工业中的应用
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
第十章现代生物技术在发酵工业中的应用
以现代前沿技术来说,一般认为生物技术有四个方面:基因操作技术;细胞融合技术;细胞大量培养技术和生物反应器技术。
也可概括为:基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和生化工程。
一、工程菌的发酵
一)工程菌的来源:通过基因工程所得的重组体菌株即是工程菌。
基因工程的关键问题:目的基因在宿主细胞中能否表达,即外源DNA在宿主细胞中能否转录和翻译,表达形成的产物在胞内不被分解,并能分泌到胞外。
二)工程菌的培养
(一)基因重组细胞的种类
宿主细胞可以采用原核大肠杆菌和枯草杆菌、真核细胞的酵母菌和哺乳动物细胞等(二)工程菌的培养
从培养过程来看,其主要因素有:营养源(碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等)浓度的控制和有毒代谢产物的排除。
在生物学上还应考虑:质粒的稳定性、质粒拷贝数的控制、转录效率的提高与控制、翻译效率的提高以及菌体向外分泌产物等因素。
1、培养装置
工程菌的基础实验仍使用常规的培养皿、试管、玻璃瓶等培养器。以大肠杆菌为宿主的培养多使用一般的通气搅拌罐。
工程菌的培养装置与沿用的通气搅拌式培养罐的区别:工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内污染杂菌,又必须不使重组体外漏。
2、培养基和高密度发酵
工程菌发酵有两条基本要求:首先是要使菌体生长良好,获得高浓度菌体(即高密度发酵),这样才能得到最多的产物;其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单,以便分离产物。
从安全性来考虑菌体营养源的问题,培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封(P1~P4)方法中的P1级规定。从生物安全性来考虑,常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。
3、菌株和质粒的稳定性
在工业发酵运行中,菌株必须具有很好的稳定性。对工程菌发酵来说,细胞中的质粒的稳定性和质粒内在的稳定性同样也是很重要的。
三)安全问题
(一)重组DNA实验准则
这些准则是采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。
物理密封是将重组菌密封于设备内,以防传染给实验人员和向外界扩散。
生物学密封要求只有在特殊培养条件下才能生存的宿主,同时用不能转移至其它活细胞的载体,通过这样组合的宿主载体系统,可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分为B1和B2级。
(二)防止基因重组菌外漏的措施
在普通通气搅拌培养罐培养菌体时,可能发生外漏的部分和操作有:1)排气;2)机械密封;3)取样;4)培养后的灭菌;5)接种;6)放罐。
这些部分和操作均应采取措施,以防重组体外漏。
二、动植物细胞的组织培养
一)动物细胞培养
动物细胞培养是指在体外培养动物细胞的技术,即在无菌条件下,从机体中取出组织或细
胞,或利用已经建立的动物细胞系,模拟机体内的正常生理状态下生存的基本条件,让细胞在培养容器中生存、生长和繁殖的方法。
(一)动物细胞培养的特性
1 、细胞生长缓慢,易污染,培养需用抗生素
2 、细胞大,无细胞壁,机械强度低,环境适应性差
3 、需氧少,不耐受强力通风与搅拌
4 、群体生长效应,贴壁生长(锚地依赖性)
5 、培养过程产品分布细胞内外,成本高
6 、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡
(二)细胞培养基的基本组成
(1)水
通常细胞培养用水的污染物标准可参考医药上注射用水标准,但原则上应高于注射用水标准。
(2)低相对分子质量营养物
(A)能源和碳源物质
主要是糖及糖酵解的产物和谷氨酰胺。
(B)氮源(氨基酸) (C)维生素(D)无机离子(E)脂类和磷脂前体(F)核酸前体
(3)非营养性物质
(A) 抗生素细胞培养中,常使用抗生素抑制微生物的污染。
(B) pH缓冲剂最常用的pH缓冲剂是碳酸氢钠,常用浓度26mmol/L。
(C) 酚红酚红普遍作为培养基的pH指示剂。
(D) 保护剂细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、毒性金属和氧化所引起的损伤的物质。
(E) 还原剂某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β巯基乙醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌,并促进半胱氨酸利用。
(4)血清
在动物细胞培养中,常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清。最常用的是小牛血清,胎牛血清次之,用于要求更高的细胞系。人血清用于一些人细胞系。
血清是极复杂的混合物,含有食物物质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细胞释放物质(如血红蛋白和血小板的生长因子)、采血中引入的污染物。
(三)动物细胞大量培养技术
由于细胞类型不同,故有下列几种培养技术:
1)悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生长的过程,主要用于非贴壁依赖性细胞的培养,如杂交瘤细胞等。
2)贴壁附着培养
为了增大附着面积,过去常用扁瓶和转瓶简单装置来进行单层静置培养。现已开发出各种形式的培养装置,如旋转瓶和多段式托盘培养装置等,已用于β-干扰素的生产。
3)微载体培养
微载体是指直径在60-250nm、适合于动物细胞贴附和生长的微珠。
(四)生物反应器中的细胞培养模式
无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,就操作方式而言,深层培养可分为:
1)分批培养2)流加培养3)半连续培养4)连续培养
5)灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养,一方面新鲜培养基不断加入反应器,另一方面又将反应液连续不断地取出,但细胞留在反应器内,使细胞处于一种不断的营养状态。
二)植物组织细胞培养
切取植物的叶、茎、根等组织的一部分,将其表面进行杀菌后,放入具有营养成分的培养基中进行培养,这种培养技术称为组织培养,或称之为愈伤组织培养。
植物细胞培养包括植物器官、组织、细胞、原生质体、胚和植株的培养。它是在植物组织技术基础上发展起来的,是指在离体条件下培养植物细胞的方法。
从当前的研究状况来看,植物细胞培养的应用领域主要涉及以下三个方面:
1)有用代谢物质的生产;2)珍贵植物和名贵花卉等种苗的快速繁殖;
3)进行植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究。
1、基本培养技术
植物组织培养最基本的是要无菌操作。无菌培养的组织有植物细胞、生长点、叶、根、子房、胚珠、花丝、花柱、花瓣、花药和花粉等。
在进行细胞大量培养时,其主要技术分为愈伤组织的固体培养和细胞或组织的液体悬浮培养。对于工业化生产有用植物代谢物来说,采用液体悬浮培养较为有利。
2、培养植物细胞的反应器操作策略:
1)连续培养2)两段培养3)细胞固定化
4)两相培养与过程的耦合5)高密度培养
三、固定化细胞发酵
在发酵工程中,使用固定化细胞代替正常分批生长细胞,如同固定化酶代替游离酶一样,具有如下的优点:1)分批发酵可用固定化细胞进行连续反应来代替;2)可以利用高密度的固定化细胞集合体进行发酵,反应效率大大提高;3)可以人为地控制固定化细胞的生理状态,因为许多代谢产物(或酶)仅仅在细胞的静止期才能形成,所以有利于产物的形成,发酵液的体积也大大减少。
1、酶和细胞的固定化方法
酶的本质是蛋白质。酶和细胞的固定化实际上是具有催化活性的蛋白质的固定化。
1)吸附法
吸附法是一种最古老的固定化方法,也是一种最简便、最经济的方法。只要将酶溶液与吸附剂表面接触就能达到吸附结合。
各种矿物质和其他无机载体可以用作酶的吸附剂。目前最常用的吸附剂是离子交换剂。2)包埋法
将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法称为包埋法。酶被包埋后应该不再扩散到周围介质中去而底物和产物却能自由扩散。
包埋法的优点在于它的普适性。
常用的格子型包埋法载体有:海藻酸盐、K-角叉菜、琼脂、三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶等。
3)交联法
交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶发生分子间交联因而得到固定的方法。常用的试剂有戊二醛、1,6-亚己基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯-马来酸酐共聚物等。4)化学共价法
共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合。
用共价法固定酶,载体与酶的结合牢固、半衰期较长。但由于化学共价法结合时反应剧烈,常常引起酶蛋白高级结构发生变化,因此一般活性回收较低。共价法的主要方法有酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰法、重氮化反应以及硅烷基化法等。
2、固定化生物反应器
现有的常用固定化细胞生物反应器有:连续搅拌罐反应器、填充床反应器、流化床反应器、